Олег Викторович Мосин : другие произведения.

О некоторых аспектах зообиотехнологии

Самиздат: [Регистрация] [Найти] [Рейтинги] [Обсуждения] [Новинки] [Обзоры] [Помощь|Техвопросы]
Ссылки:


 Ваша оценка:
  • Аннотация:
    Давайте глубже разберёмся, что такое зообиотехнология и для чего она нужна. Зообиотехнология является ветвью биотехнологии и связана с генно-инженерными манипуляциями с клетками животных. Значимость представителей царства животных в зообиотехнологии далеко неравноценная. Это связано с теми обстоятельствами, что во многих случаях еще не до конца разработаны способы культивирования клеток не только в производственных, но и в лабораторных условиях, хотя первые манипуляции с животными клетками начались ещё еще в 1950 г. Ф. К. Роббинсом и Дж. Ф. Эндерсом. В настоящее время в промышленном масштабе освоено культивирование лимфобластов человека, продуцирующие интерферон, клетки-гибридомы, образующие моноклональные антитела; монослойные клеточные культуры различных тканей, использующиеся, например, для репродукции вирусов и т. д. Даже из этих немногочисленных примеров можно заключить, что первостепенной задачей для зообиотехнологических процессов является получение клеток и клеточных культур. Об этом и рассказывается в данной статье О.В. Мосина

ЧТО ТАКОЕ ЗООБИОТЕХНОЛОГИЯ И ЗАЧЕМ ОНА НУЖНА?

О.В. Мосин

Давайте глубже разберёмся, что такое зообиотехнология и для чего она нужна. Зообиотехнология является ветвью биотехнологии. Принципиальное отличие ее от микробной биотехнологии и фитобиотехнологии состоит в том, что объектами зообиотехнологии являются клетки животных и человека.

Как известно из биологии наипростейшими животными существами клеточной организации являются протозоиные организмы, или Protozoa (от греч. protos-первый, zoon- животное, живое существо), составляющие самостоятельный отдел в царстве Animalia (таблица 1).

Т а б л и ц а 1. Представители царства Animalia

N п/п Отдел Типы или классы
1 Protozoa (простейшие) Типы: Acanthariae - акантарии, Ascetospora - -асцето споровые, Ciliophora реснитчатые, Cnidosporida- книдоспоридевые, Mastigophora - жгутиконосцы, Microsporida- микроспоридевые, Opalinidomorpha - опалинидоформные, Sarcodina-ложноножки, Sporozoa-споровики.
2 Parazoa (губки) Классы: Calcarea известковые губки, Demospongiae - обыкновенные губки, Hexactinellida - кремниевые шестилучевые губки.


3 Metazoa (многоклеточные гетеротрофные животные) Типы: Annelida - кольчатые черви, Arthropoda - членистоногие, Chordata - хордовые, Coelenterata - кишечнополостные, Echinodermata - иглокожие, Mollusca - моллюски, или мягкотелые, Nematoda - круглые черви, Platyhelminthes - плоские черви.

Из 65 тысяч видов Protozoa в мире 55 тысяч являются свободно живущими в природе, а 10 тысяч ведут паразитический образ жизни.

Среди выделяемых ныне 9 типов простейших организмов жгутиковым отводят место пограничных существ, являющихся ближайшими предками многоклеточных животных и растений и образующих связующее звено между ними.

Поддержание Protozoa в культуре - дело достаточно сложное, однако многие виды удается выращивать на относительно простых средах или на более сложных, рекомендованных для культивирования клеток и тканей животных. Для некоторых протозойных видов целесообразно добавлять в среды споровые бактерии (Вас. subtills) и/или дрожжи (Saccharomyces cerevisiae и др.). Это обусловлено их фагоцитарной активностью.

С биотехнологических позиций попеременный интерес был проявлен к препаратам круцину (Н. Г. Клюева, Г. И. Роскин) и его аналогу - трипанозе (Ж. Кудер, Ж. Мишель-Брэн и др.) получаемым с помощью Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi, астазилиду (Н. Н. Сухарева-Немакова) - полу синтетическому продукту, включающему комплекс эфиров сахарозы и жирных кислот, выделенных из жгутиконосца Astasia longa, полисахаридам. В доклинических и клинических испытаниях они проявляли больший или меньший противоопухолевый эффект. Однако из-за нестабильности клинических результатов, неосвоенности крупномасштабного культивирования Protozoa и некоторых других причин зообиотехнология в этой области мало продвинулась вперед.

Из всех других представителей царства животных наибольший интерес представляют хордовые. Их подразделяют на два подтипа - бесчерепные (Protochordata, или Acrania) и черепные, или позвоночные (Craniata, или Vertebrata). Всех черепных объединяют в следующие классы: Cyclostomata (круглоротые), Pisces (рыбы), Amphibia (земноводные), Reptilia (пресмыкающиеся), Aves (птицы) и Mammalia (млекопитающие).

Значимость представителей царства животных в зообиотехнологии далеко неравноценная. Это связано с теми обстоятельствами, что во многих случаях еще не разработаны способы культивирования клеток не только в производственных, но и в лабораторных условиях, или, как говорят, "еще не дошли руки" до конкретных биообъектов животного происхождения, хотя техника однослойной культуры клеток впервые разработана еще в 1950 г. Ф. К. Роббинсом и Дж. Ф. Эндерсом.

В настоящее время в промышленном масштабе освоено культивирование лимфобластов человека, продуцирующие интерферон, клетки-гибридомы, образующие моноклональные антитела; монослойные клеточные культуры различных тканей, использующиеся, например, для репродукции вирусов и т. д. Даже из этих немногочисленных примеров можно заключить, что первостепенной задачей для зообиотехнологических процессов является получение клеток и клеточных культур.

Способы выращивания клеток животных. Как известно, любые клетки животного организма происходят из оплодотворенной яйцеклетки, которая со временем развивается и дифференцируется (рис).

Эмбрион млекопитающего на ранней стадии развития [О.В.Мосин]

Зародышевый диск включает эктодерму, эндодерму и мезодерму, из которых впоследствии образуются все ткани будущего организма. Но как только какую-либо ткань перевести в кулътуру, то наступает дедифференциация клеток и различить их становится делом трудным или невозможным. Например, для исследования в области онкологии важны культуры раковых клеток, о которых имеются сообщения в научной литературе. Такие клетки получены от больных раком легкого и щитовидной железы.

В 1986 г. в Японии впервые был получен в культуре штамм клеток рака желчного пузыря. Он был стабилен после 103 пассажей in vitro, сохранил прежнее число хромосом в пределах 76-101. Индуцируемый им опухолевый процесс и первичный рак желчного пузыря оказались тождественными по гистограмме. Подобный штамм оказался полезным при оценке противоопухолевых средств.

Любой штамм, представляющий определенную ценность для научно-практического использования, должен иметь следующие характеристики:

1) качество исходной ткани - нормальная или опухолевая (для опухолевой необходим показатель доброкачественности или злокачественности);

2) тип ткани - эмбриональная или зрелая;

3) принадлежность ткани - вид животного;

4) источник ткани - орган;

5) тип клетки (если известно);

6) наименование штамма (буквенное - не более 4 букв и серия цифр нумерации);

7) номер клона, если штамм клонировался;

8) источник информации (ссылка на оригинальную публикацию).

Все способы выращивания клеток животных могут быть соотнесены либо к интактным нетрансформированным с помощью вирусов), либо к вирусотрансформированным клеткам. Успех культивирования первых во многом обусловлен наличием и плотностью адгезинов, благодаря которым они проявляют эффект "заякоривания" на подлежащей поверхности стекла, металла или пластика. Однако такие клетки не растут в суспензионных культурах.

Вирусотрансформированные клетки животных, напротив, хорошо растут в виде суспензионных культур и хуже или совсем не растут в адгезированном состоянии.

Имеются такие штаммы животных клеток, которые могут расти и в прикрепленном состоянии, и в виде суспензии. Прикрепившиеся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в форме нескольких слившихся слоев. Подобного результата можно добиться при использовании других факторов воздействия на клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и т. д.). Тем не менее, на практике широко пользуются монослойными культурами.

Глубинное выращивание клеток в монослое. Рост клеток в виде монослоя зависит от адгезивных белков - фибронектинов (от лат. fibra - нить, nectere - связывать или соединять), обеспечивающих межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке и направляющих их перемещения. В животном организме клетки, способные к перемещениям (особенно в период эмбрионального развития, при заживлении ран), и связанные с базальными мембранами, содержат на своей поверхности крупномолекулярные гликопротеиновые молекулы фибронектина, открытого в 1973 г. Р.О. Хайнсом (Англия), К. Гамбергом и С.И. Хакомори (США) при изучении нормальных и опухолевых клеток. Фибронектин, полимеризуясь, образует длинные нити вокруг клетки, которые контактируют с клеточной мембраной и связываются с цитоскелетным белком-актином. Топология фибронектина в экстрацеллюлярном матриксе схематично представлена на рисунке ниже:t

Схематичное изображение молекулы фибронектина [О.В.Мосин]

Молекула фибронектина состоит из двух субъединиц с ММ около 250 кДа, содержащих небольшие по размеру домены и соединенных на одном конце двумя S-S-мостиками. Размеры одной субъединицы 60-70x2-3 нм; на эту длину приходится от 2145 до 2445 остатков аминокислот. Каждый домен отвечает за одну функцию фибронектина, например, за соединение с фибрином, другой домен - за прикрепление к пластику и т. д.

Доказано, что фибронектин имеется у всех представителей царства Animalia, включая человека. Амфотерный гликопротеинфибронектин в изолированном виде выраженно стимулирует адгезию, если добавлять его в питательную среду в концентрации порядка 1-5 мкг/мл. Амфолит в данном случае выступает мостиком между отрицательно заряженной поверхностью животной клетки и субстратом, несущим отрицательный или положительный заряд. Свободная энергия поверхности твердого носителя может быть высокой (чистые поверхности стекол, металлов, металлических окислов) или низкой (поверхности из органических полимеров), хотя понятно, что при соответствующих обработках низкоэнергетические поверхности трансформируются б высокоэнергетические. В качестве связующих мостиков можно применять ионы кальция или магния.

Механизм адгезии животной клетки к субстрату [О.В.Мосин]

Наряду с плотностью заряда в прикрепляемости клеток большое значение имеют характеристики субстрата: гидрофильность его поверхности (смачиваемость), протяженность и горизонтальность. Распластываем ость клеток на подложке будет выше, если число отрицательных зарядов оказывается не ниже 5 на площади 10 нм2. Адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей в сравнении с гидрофобными, по протяженности они должны быть больше нормальной длины клеток; субстраты с искривленной поверхностью хуже гладких - растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстрата (здесь существен вклад цитоскелета. Если, например, прикрепление клеток к агар-агару принять за единицу, то к тефлону они прикрепляются в 5 раз лучше, к полиэтилену -- в 8 раз, к полипропилену - в 9 раз, к резине - в 12 раз, к алюминию - в 15 раз, к стеклу - в 16 раз, а к стали и полистирену - в 20 раз.

В 1993 г. на рынок поступил пронектин F - продукт белковой инженерии, созданный в Великобритании. Он напоминает ранее названный фибронектин, но пронектин F включает 13 мест связывания на молекулу (в сравнении с нормальным комплементом). Его потенциал к клеточной адгезии в 13 раз выше потенциала фибронектина, полученного от млекопитающих. Пронектин F рекомендуют для выращивания клеток в бессыворочных средах.

Крупномасштабное культивирование животных клеток в монослое нацелено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы. Выбор клеток не столь велик, но некоторые из них вполне адаптированы к условиям выращивания in vitro. В 1964 г. впервые были получены линии соединительнотканных клеток - фибробластов ВНК 21 от сирийского хомяка. Эти клетки пассируются неограниченно долго и первоначально использовались для репродукции вируса ящура для приготовления соответствующих вакцин. Следует иметь в виду, что нормальные диплоидные клетки человека, например, линии WI-38, могут делиться ограниченное число раз (50 ? 10) и проявляют феномен старения (см. раздел 3.2.4.}. В то же время такие клетки , как HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека, оказались бессмертными при пассировании.

При доступности донорской ткани используют клетки почек кроликов, обезьян, собак (линия МДСР), 10-14-дневных куриных эмбрионов, клетки из миндалин, амниона, легких эмбриона человека 12-16-недельного возраста, клетки эпидермиса взрослого человека, мышиные фибробласты (линия LS), диплоидные фибробласты человека (линия MRC-5) и другие.

Выбранные клетки выращивают в строго асептичных условиях в специальном оборудовании при медленном вращении роллерной системы или покачивании для смывания большей площади культуралъной среды. Клетки то погружаются в жидкую фазу, то в газообразную. При этом с избытком обеспечиваются их дыхательные потребности в кислороде.

Во время цикла культивирования клеток должны учитываться разные параметры. Одни из них относятся к числу константных, другие - к числу вариабельных. Константными являются качество материала, форма и объем культиватора, вариабельными - скорость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер (величина) посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание СО2 в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал и концентрация основных источников питания. Первые три вариабельных показателя можно поддерживать постоянными, переводя их в разряд константных.

Естественно ожидать, что среды для клеток животных должны отличаться от сред, используемых, например, для прокариот. На начальных этапах развития зообиотехнологии обязательным было добавление сывороток к средам, применяемым в лабораторных и производственных условиях. Сыворотки обеспечивали клетки необходимыми гормонами (глюкокортикоиды, инсулин, половые гормоны, простагландины и др.). ростовыми факторами (эпидермальным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленекротическим и др.), факторами адгезии (коллаген, фибронектин, ламинин), белками (альбумин, трансферрин, фетуин), микроэлементами и липидами, для выживания in vitro. Обычно для этого используют фетальную бычью сыворотку (ФБС). Высоким качеством отличаются сыворотки, рекомендуемые фирмой Sigma (США). Некоторые из них по качеству (для отдельных линий клеток) превосходят ФБС, например, сыворотка крови новорожденных телят в возрасте до 10 дней и менее, сыворотка от телят возраста менее 10-месячного, лошадиная сыворотка от жеребцов, кастрированных за год до взятия крови.

Вместо натуральных сывороток фирма IBF biotechnics (Германия) предлагает высококачественные заменители, в частности, ultroser G - для иммобилизованных клеток. Эта среда содержит мало белка, благодаря чему упрощается очистка биопродукта и достигается стабильность компонентного состава.

Оптимальные показатели рН и температуры зависят от происхождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопитающих концентрацию водородных ионов поддерживают в пределах рН от 7,2 до 7,4, а температуру - в пределах +36 -37,5 С.

Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем (СО2-NaHCO3), трис- и др.] а температуру - с помощью терморегуляторов.

Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка).

Посевной материал (инокулят, от лат. inoculatio - прививание) заметно сказывается на скорости роста клеток в монослойной культуре. В случае применения первичных клеток необходимо иметь их в более высокой плотности на 1 см2 внутренней (рабочей) поверхности культиватора.

Если же используют клеточные линии (а не первичные клетки), то плотность инокулята может быть несколько меньшей, так как они почти все 100% адгезируются на поверхности культиватора. Покачивание или вращение омываемых средой клеток несомненно сказывается на их прикреплении.

Глубинное выращивание клеток в суспензионных культурах. Площадь выращиваемых клеток можно существенно увеличить при использовании микроносителей, суспендируемых в питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются, а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные микроносители с клетками моделируют глубинные культуры, например, микроорганизмов. Следовательно, в таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры животных клеток.

В качестве микроносителей применяют положительно заряженные ДЕАЕ-сефадексы, сефадексы с коллагеновым покрытием, отрицательно заряженный полистирол, полые стеклянные сферы и др. Так, например, отдельные фирмы предлагают микросферы из пористого шлачного. стекла (рис), которые могут быть использованы для иммобилизации клеток млекопитающих. Поры их доступны для пенетрации (от лат, penetratio - проникновение) клеток внутрь матрикса, облегчая трехмерную колонизацию внутренней поверхности носителя, что способствует взаимодействию метаболизируюгцих соседствующих клеток и поддержанию их возросших жизнеспособности и продуктивности. Пористые сферы пригодны для иммобилизации прилипающих и суспензионных клеток (например, гибридом).

Микросферы для иммобилизации клеток млекопитающих [О.В.Мосин]

Рекомендуемый размер сферических микроносителей порядка 200+ 25 мкм оценивают оптимальным с удельной плотностью 1,03. Требуемое количество их примерно равно 104 мл, а для инокуляции необходимо порядка 105 клеток. При увеличении количества микроносителя возрастает доза клеток в инокуляте.

Подход к выбору сред и контролируемого параметра культивирования остается прежним. Клетки после выращивания отделяют от микроносителей центрифугированием (в том числе - в градиенте плотности), фильтрованием, или, чаще, обработкой трипсином с последующими промыванием и сепарированием.

Суспензионные клетки на микроносителях применяют в целях получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура),

Возможности переноса генетической информации из эукариотических клеток в прокариотические сняло проблему массового культивирования животных клеток для получения таких продуктов, как интерферон, гормоны, лимфокины и другие. Здесь успешно развивается рДНК-биотехнология.

Клеткам животных в глубинных культурах почти во всех случаях требуется защитная матрица, - функцию которой берут на себя белки сыворотки крови, добавляемой в среду культивирования. Этим еще раз подтверждается более высокая ранимость животных клеток по сравнению с микробными и растительными клетками. Тем не менее, основные подходы к выбору оборудования и к реализации биотехнологических процессов с использованием животных клеток во многом аналогичны с таковыми в микробной биотехнологии. Например, системы культивирования в обоих случаях могут быть хемо- или турбидостатными, циклическими, непрерывными или полунепрерывными.

В противоположность суспензионным культурам клеток на микроносителях разработаны способы инкапсулирования их в полимерные сферы (полилизиновые, агарозные, из полимерных смол), когда клетки, no-существу, не испытывают того механического напряжения, которое они должны проявлять в свободном виде. Эти способы оказались выгодными для культивирования гибридом в целях получения моноклональных антител. Диаметр микрокапсул, размер пор в них и их толщина могут быть независимо проконтролированы в процессе изготовления и оптимизированы для конкретного типа гибридом. Например, согласно данным фирмы Damon Biotech (Германия) гибридомные клетки человека или животных вначале суспендируют в биосовместимом растворе натрия альгината. Образовавшиеся капельки затем пропускают в раствор кальция хлорида, где они становятся желированными микросферами. На поверхности таких сфер затем формируют полилизиновую мембрану. После этого гель разжижают, оставляя гибридомные клетки в нормальном физиологическом состоянии внутри "дырчатых" микросфер.

В процессе культивирования таких инкапсулированных гибридом продукция моноклональных антител возрастает в сотни-тысячи раз по сравнению с обычным культивированием гибридомных клеток. После завершения биосинтеза антител микрокапсулы подвергают диализу для удаления примесных веществ, а затем физически их "раскрывают", гибридомные клетки и фрагменты капсул легко сепарируются от искомых моноклональных антител, которые могут быть подвергнуты дальнейшей очистке или использованы по назначению. Схема описанных процедур представлена на рисунке ниже:

Получение моноклональных антител гибридомы [О.В.Мосин]

Полилизиновая мембрана обеспечивает диффузию небольших молекул питательных веществ внутрь микросфер, но не позволяет выходить иммунным глобулинам.

Кроме физического удаления полилизированной мембраны можно воспользоваться ферментативным гидролизом.

В описанные микросферы можно инкапсулировать не только клетки, но и ферменты, индукторы каких-либо процессов, а также мультисистемы.

Таким образом, глубинное выращивание животных клеток реализуют в трех вариантах:

1) монослой клеток статичен, культуральная среда подвижна;

2) среда культивирования статична, монослой клеток подвижен;

3) клетки (например, на микроносителях, в микросферах) и среда культивирования подвижны.

4) Эти варианты выращивания
клеток должны приниматься в расчет при выборе или проектировании соответствующего оборудования.

Другие способы выращивания клеток. В настоящее время в опытно-промышленных условиях получают интерферон, выращивая лимфобласты человека в виде отъемно-доливных культур, то есть когда определенная часть клеточной суспензии замещается свежей средой, например, ultroser HY (Германия), а остающаяся часть "старой" культуры выполняет роль инокулята.

Интерфероны можно получать в периодической культуре, когда часть ее отбирают через определенные интервалы времени при непрерывной подпитке свежей питательной средой и при постоянной скорости ее подачи. Тогда объем культуры прогрессивно возрастает, равно как прогрессивно снижаются скорости ее роста и разбавления.

Как бы долго не удавалось поддерживать клетки в циклических культурах с подпиткой, в конечном итоге они погибают и весь цикл приходится начинать сначала.

Неопределенно длительное время можно выращивать клетки млекопитающих в непрерывных хемостатных культурах, когда удается добиваться постоянства концентрации лимитирующего субстрата и плотности клеток.

Теория и практика непрерывного культивирования впервые сформулированы в 1950 г. Ж. Моно, и, независимо от него, А. Новиком и Л. Сцилардом, предложившими термин "хемостат". В хемостатах скорость подачи свежей среды и отбора культуры равны (как и объем их). Скорость роста, развития и размножения клеток контролируется скоростью подвода лимитирующего компонента, а численность - его концентрацией. В качестве лимитирующего рост агента чаще всего используют глюкозу, реже - фосфат и другие вещества. При правильном подборе условий выращивания в хемостатах удается на порядок увеличить выход клеток по сравнению с периодическим культивированием. Причем, хемостатные культуры отличаются накоплением физиологически однотипных клеток. Это можно показать на примере с клетками лейкемии мышей - L 1210 (таблица 55), которые засевали (инокулят) в концентрации 2x10s клеток/мл для периодического культивирования, длившегося 3 суток до получения максимальной плотности 2,5x10б клеток/мл (суспензионные культуры). При хемостатном культивировании скорость подачи среды и отъема культуры составляла 0,3 сут~1.

Таблица 2. Накопление клеток L 1210 при периодическом и непрерывном культивировании (по М. Ж. Тови, 1985)

Способ выращинания Объем среды, л Урожайность клеток

на 1 мг глюкозы на 1 мл среды в неделю

х 106 мкг х 10s


Периодический 0,3 3,5 524 2,3 1,38x10
Непрерывный (хемостатный) 0,3 6,2 601 6,2 1,12*1010
Естественно, что время, затрачиваемое на подготовку смежных циклов и их реализацию при периодическом культивировании, является непроизводительным.

Эмбриональные и другие ткани для репродукции вирусов и получения вирусных вакцин. Из эмбриональных тканей наиболее широко используемыми являются эмбриональные ткани цыпленка, мыши и человека. Особенной выгодой отличаются куриные эмбрионы (по доступности) десяти-двенадцатисуточного возраста, используемые преимущественно для репродукции вирусов и последующего изготовления вирусных вакцин.

Куриные эмбрионы впервые введены в вирусологическую практику в 1931 г. Г. М. Вудруфом и Е. У. Гудпасчером. Такие эмбрионы рекомендуют также для выявления, идентификации и определения инфицирующей дозы вирусов, для получения антигенных препаратов, применяемых в серологических реакциях.

Инкубированные при 38 С куриные яйца овоскопируют (просвечивают), отбраковывают, "прозрачные" неоплодотворенные экземпляры и сохраняют оплодотворенные, в которых хорошо видны наполненные кровеносные сосуды хорионаллантоисной оболочки и движения эмбрионов.

Заражение эмбрионов можно проводить вручную и автоматизированно. Последний способ применяют в крупномасштабном производстве, например, противогриппозных вакцин. Материал, содержащий вирусы, вводят с помощью шприца (батареи шприцов) в различные части эмбриона (эмбрионов) (рис).

Десятидневный куриный эмбрион [О.В.Мосин]

Все этапы работы с куриными эмбрионами после овоскопии проводят в асептичных условиях. Материалом для заражения могут быть суспензия растертой мозговой ткани (применительно к вирусу бешенства), печени, селезенки, почек (применительно к хламидиям орнитоза) и т. д. В целях деконтаминации вирусного материала от бактерий или в целях предотвращения его бактериального загрязнения можно использовать соответствующие антибиотики, например, пенициллин с каким-либо аминогликозидом порядка 150 МЕ на 1 мл суспензии вирусологического материала.

Для борьбы с грибковым заражением эмбрионов целесообразно воспользоваться некоторыми антибиотиками-полиенами (нистатин, амфотерицин В) или отдельными производными бензимидазола (например дактарин и др.).

Чаще всего суспензию вирусного материала вводят в аллантоисную полость или, реже, на хориоаллантоисную оболочку в количестве 0,05-0,1 мл, прокалывая продезинфицированную скорлупу (например, иодированным этанолом) на расчетную глубину. После этого отверстие закрывают расплавленным парафином и эмбрионы помещают в термостат, в котором поддерживается оптимальная температура для репродукции вируса, например 36- 37,5?С. Продолжительность инкубации зависит от типа и активности вируса. Обычно через 2-4 суток можно наблюдать изменение оболочек с последующей гибелью эмбрионов.

Зараженные эмбрионы контролируют ежедневно 1-2 раза (овоскопируют, поворачивают другой стороной). Погибшие эмбрионы затем передают в отделение сбора вирусного материала. Там их дезинфицируют, аллантоисную жидкость с вирусом отсасывают и переносят в стерильные емкости. Инактивацию вирусов при определенной температуре проводят обычно с помощью формалина, фонола или других веществ. Применяя высокоскоростное центрифугирование 18 т. 8524 или афинную хроматографию, удается получать высокоочищенные вирусные частицы.

Собранный вирусный материал, прошедший соответствующий контроль, подвергают лиофильной сушке. Контролю подлежат следующие показатели: стерильность, безвредность и специфическая активность. Применительно к стерильности имеют в виду отсутствие: живого гомологичного вируса в убитой вакцине, бактерий и грибов. Безвредность и специфическую активность оценивают на животных и только после этого вакцину разрешают испытывать на волонтерах или добровольцах; после успешного проведения клинической апробации вакцину разрешают применять в широкой медицинской практике.

На куриных эмбрионах получают, например, живую противогриппозную вакцину. Она предназначается для интраназального введения (лицам старше 16 лет и детям от 3 до 15 лет). Вакцина представляет собой высушенную аллантоисную жидкость, взятую от зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подбирают согласно эпидемиологической ситуации и прогнозам. Поэтому препараты могут выпускаться в виде моновакцины или дивакцины (например,, включающая вирусы А2 и Б) в ампулах с 20 и 8 прививочными дозами для соответствующих групп населения. Высушенная масса в ампулах обычно имеет светло-желтый цвет, который сохраняется и после растворения содержимого ампулы в прокипяченой остуженной воде.

Живые противогриппозные вакцины для взрослых и детей готовят и для приема через рот. Такие вакцины представляют собой специальные вакцинные штаммы, репродукция которых происходила в течение 5-15 пассажей (не менее и не более) на культуре почечной ткани куриных эмбрионов. Их выпускают в сухом виде во флаконах. При растворении в воде цвет из светло-желтого переходит в красноватый.

Из других вирусных вакцин, получаемых на куриных эмбрионах, можно назвать против on аротитную, против желтой лихорадки.

Из прочих эмбриональных тканей используют эмбрионы мышей или других млекопитающих животных, а также абортированные плоды человека.,

Эмбриональные перевиваемые ткани доступны после обработки трипсином, поскольку в таких тканях еще не формируется большого количества межклеточных веществ (в том числе небелковой природы). Клетки разделяются и после необходимых обработок их культивируют в специальных средах в монослое или в суспендированном состоянии.

Ткани, изолируемые от животных после рождения, относятся к разряду зрелых. Чем их возраст больше, тем с большим трудом они культивируются. Однако после успешного выращивания они затем "выравниваются" и мало чем отличаются от эмбриональных клеток.

В целях репродукции вирусов особую роль сыграли почечные и амниотические зрелые ткани. Из них первые получали от обезъян, вторые - из амниотических оболочек от женщин-рожениц при нормальных родах. Свежие почки от здоровых обезьян, например макаки резус или африканских зеленых мартышек (сразу же после экстирпации, от лат. extirpatio - полное вырезание, вылущение, искоренение) декапсулируют, рассекают пополам, удаляют лоханки, нарезают паренхиматозную ткань на мелкие кусочки, трипси-низируют и клетки (порядка 3x103/мл) помещают в специальную среду, термостатируют при 45 С в качающихся аппаратах. Спустя сутки, культуру заражают, например, вирусом полиомиелита и уже через 4-7 дней в надосадочной жидкости накапливается вирус. Эту жидкость сливают, к ней добавляют формалин до получения 0,025%-й концентрации и смесь оставляют при 37 С на 12 дней для полного обезвреживания вируса. После этого препарат подвергают диализу с последующим контролем на отсутствие живых вирусных частиц, токсичности, безвредности и на активность. Таков принцип изготовления полиовакцины Дж. Солка.

В случае приготовления живых вакцин из ослабленных (аттенуированных) штаммов вирусов исключают стадию обработки формалином. Так получают, например, живую полиовакцину А. Себина (иммунологических типов 1,11,111). В целях термостабилизации вакцины к ней добавляют химически чистый магния хлорид. Вакцину выпускают в жидком виде (по 5 мл) и в форме конфет-драже. Жидкая форма имеет красновато-оранжевый цвет; цвет драже различен: розовый - для первого иммунологического типа вируса, сиреневый - для второго . типа, голубой - для третьего типа и белый - для смеси всех трех типов.

Кроме полиомиелита специфическую профилактику живыми вакцинами проводят при кори. Противокоревую живую сухую вакцину изготавливают из вакцинного штамма, репродукция которого осуществлялась на клеточных культурах почек морских свинок или фибробластах японских перепелок. Сухая вакцина имеет желтовато-розовый цвет, который может сохраняться после растворения ее в прилагаемом к упаковке растворителе. Выпускают во флаконах по 1,2,5 и 10 прививочных доз. После растворения вакцину вводят в количестве 0,5 мл подкожно или по 0,1 мл внутрикожно. Она предназначается для не болевших корью детей в возрасте от 10 месяцев до 8 лет (по показаниям - до 14 лет).

Вакцина против клещевого энцефалита является формолвакциной, полученной из тканевой культуры фибробластов куриного эмбриона и выпускаемом в жидком виде во флаконах (по 10 мл) или ампулах (по 5 мл) с гидроокисью алюминия (до 2 мг) в качестве адсорбента или в лиофильно высушенном виде с желатином (до 1,5%) и сахарозой (до 8%). Вакцину вводят подкожно (жидкую или после разведения в дистиллированной воде сухого препарата).

По способам культивирования особое место занимает вирус бешенства. Его репродукцию осуществляют на мозговой ткани целостных организмов, используя для этого кроликов, крыс, овец. Л. Пастер в 80-е годы XIX века выделил от больной собаки вирус бешенства, и после ряда его пассажей через мозг кроликов он добился того, что вирус приобрел свойства вызывать заболевание у данных животных после определенного и постоянного инкубационного периода (4-6 дней). Такой вирус, в отличие от вируса "уличного" бешенства, получил название Virus fixe (фиксированный вирус). Его-то и применяют для получения вакцин.

В целях профилактики бешенства используют сухие антирабические вакцины Ферми и МИВП. Первую из них готовят из мозга овец возраста до 1 года, вторую - из мозга сосунков белых крыс (возраст 4-8 суток) после заражения тех и других фиксированным вирусом бешенства. Подобные вакцины представляют собой суспензии мозговых тканей, содержащих указанный вирус. В сухом виде вакцины выпускают в форме таблеток беловато-серого цвета, которые суспендируют в прилагаемом растворителе (дистиллированная вода) и сразу же вводят подкожно. Хранение разведенных вакцин впрок запрещается.

Вакцина против краснухи содержит живой ослабленный (аттенуированный, от лат. attenuare - уменьшать) вирус, репродуцировавшийся на диплоидных клетках человека или на клетках почек кролика. Используют для профилактики краснухи.

Клетки амниона человека должны быть получены не позднее 12 часов после родов. Для этого послед помещают в стерильный контейнер без применения антисептиков и в ближайшие после этого часы отделяют амнион от хориона, промывают специальным солевым раствором и дважды последовательно трипсинизируют. После этого клетки центрифугируют - в течение 10 минут, ресуспендируют осадок в среде и подсчитывают образовавшиеся изолированные клетки (необходимо получить порядка 106 клеток в 1 мл). Их суспендируют и переносят в большие емкости до получения 106 клеток в 1 мл питательной среды, сменяя ее каждые 5-7 дней. Полученные клетки можно использовать для культивирования вирусов.

Перевиваемые опухоли животных, в частности, асцитные, нашли широкое применение на практике. Они хорошо растут в форме суспензии изолированных клеток в экссудате брюшной полости, например, мышей и крыс. Опухолевые клетки размножаются в асцитической жидкости, которую отсасывают из брюшной полости с помощью шприца (или с помощью пипетки после оперативного вмешательства). Такие клетки можно также выращивать in vitro.

Перевиваемые опухоли животных представляют определенную ценность при изучении противоопухолевых химиотерапевтических веществ. Для выращивания опухолевых клеток могут оказаться полезными так называемые кокарциногены - вещества, индуцирующие формирование опухолевой ткани, хотя сами не являются карциногенами. Среди известных кокарциногенов наиболее сильным триггерным действием (от англ, trigger - спусковой крючок, "собачка") обладает тиглиан - природный вторичный метаболит у растений, относящихся .к семействам -Euphorbiaceae (молочайные) и Thymelaeaceae (тимиановые). Он является природным (Ьоооболом из rovmrbT тетрациклических дитерпенов с пергидро-циклопропабензазуленовым скелетом. В этом скелете содержится 7 хиральных атомов углерода, и, следовательно, возможно существование большого числа изомеров. Из всех фороболов только производные 4(3-форобола являются активными, но не производные 4сс стереоизомеров.

Предполагают, что их деградация происходит замедленно и поэтому они могут непрерывно активировать фермент протеинкиназу С. Это, в свою очередь, стимулирует специфические протеазы, катализирующие реакцию распада фермента с последующим серьезным нарушением клеточной регуляции, сопровождающейся индукцией опухолевого роста.

форобол [О.В.Мосин]

Необходимо также помнить, что фороболы еще стимулируют клеточную пролиферацию, митогенез лимфоцитов, продукцию простагландинов, дегрануляцию нейтрофилов, синтез ДНК, изменения в свойствах мембран и др. Однако в связи с высокой биологической активностью, эфиры форобола представляют определенную опасность для здоровья работающих с ними лиц. Поэтому операторы должны надевать перчатки, защитные очки и прочую одежду, чтобы защитить кожу и глаза от контакта с этими веществами.

Для инактивации эфиров форобола их необходимо растворить в органическом растворителе, смешивающимся с водой, в равном объеме 10% водного раствора натрия гидроксида. Гидролиз эфиров завершается в срок до одного часа выдержки, после чего щелочной раствор становится безопасным.

Водные растворы эфиров форбола могут быть обезврежены добавлением около 10 % по объему натрия гипохлорита.

Способствует росту опухолевых клеток (-)-индолактам, являющийся производным индола. Его эффективность в других биологических системах различна, что может быть объяснено различным аффинитетом к С-подтипам протеинкиназы; стереоизомер (+ )-ин-долактам не обладает стимулирующим действием, но его можно использовать в качестве субстанции для негативного контроля.

В таком же плане могут быть использованы новые, человеческого происхождения, гормоноподобные ростовые факторы: инсу-лино-подобные (IGF 1 и 2), тромбоцитарные (PDGF, от англ. Platelet Derived-Growth-Factors), трансформирующие ростовые (TGFa и (3), некроза опухолей (TNFa).

IGF I - полипептид, состоящий из 70 аминокислотных остатков, спирально закрученный и удерживаемый в таком состоянии благодаря трем S-S - мостикам между остатками цистеина (рис).

Полипептид IGF-1 [О.В.Мосин]

Первый из них соединяет дисульфидной связью 6-й и 48-й остатки, второй- 18-йи 61-й остатки, третий - 47-й и 52-й остатки. IGF 1 является пептидным гормоном, влияющим на рост и обмен веществ организма после рождения. Его секреция находится под влиянием уровня гормонов роста в сыворотке крови и характера питания ребенка. IGF 1 влияет на рост и дифференциацию многих типов животных клеток, включая мышиные клетки - предшественники эритроцитов последней стадии и эпителиальные клетки млекопитающих, крысиные миобласты, олигодендроциты, клетки черепа и клетки зобной железы; человеческие хондроциты и адренергические нейробластные клетки. Вариантом IGF 1 является укороченный на N- терминальный трипептид-мозговой 1GF, изолированный из мозга плода и взрослого человека. Этот пептидный гормон важен для роста и метаболизма центральной нервной системы. Он в 4 раза сильнее IGF 1 по стимуляции синтеза в фетальных мозговых клетках крыс и более выраженно реагирует в перекрестных реакциях с рецепторами для IGF 1 на мембранах мозга у плода и взрослого человека.

IGF 2 - полипептид, состоящий из 67 аминокислот (ММ- 7 470). Как и IGF 1 является сильным митогеном для многих клеток. Как полагают, он - важный регулятор роста соматических клеток, стимулирующий их размножение.

Тромбоцитарный ростовый фактор PDGF - гомодимерный, мульти функциональный полипептид, который действует как сильный митоген в отношении широкого набора эндотёлиальных клеток фибробластов. Его рассматрвают как вещество, играющее важную роль в восстановлении тканей и воспалении. PDGF - хемоаттрактант для фибробластов, гладко мышечных клеток, моноцитов и нейтрофилов, что играет немаловажную роль в заживлении ран.

PDGF [О.В.Мосин]

В отвечающих на PDGF клетках индуцируются оборот фосфатидилинозита, метаболизм простагландинов и активируются фосфолипазы. В человеческих фибробластах кожи, стимулированных PDGF, возрастает в три раза коллагеназная активность. Полагают, что он принимает участие в трансформации клеток и вовлекается в процесс атеросклероза.

Следует отличать PDGF от фактора активации тромбоцитов (PAF, от англ, platelet activating factor) -это фосфолипид, образуемый тромбоцитами, макрофагами, иейтрофилами и эозинофилами под влиянием воспалительного стимула.

Он синтезируется из клеточных мембран под влиянием фосфолипазы А 2 вначале в форме предшественника - lyso-PAr, который затем превращается в PAF под влиянием ацетил-трансферазы (этот же энзим катализирует реакцию обратной трансформации PAF в lyso-PAF).

РАН - исключительно потентная субстанция. Она индуцирует агрегацию тромбоцитов, будучи в фемтомолярных концентрациях (1015). После парентерального введения или вдыхания PAF вызывает бронхоспазм и повышенную проницаемость микрокапилляров; количество кровяных пластинок и нейтрофилов в крови падает при одновременном клеточном скоплении в легких. Введенный внутрикожно он вызывает формирование пустулы и повышение температуры при устойчивой клеточной инфильтрации. PAF обладает сильным хемотаксическим эффектом, вызывая накопление нейтрофилов и эозинофилов, активирует их в плане образования других воспалительных компонентов (супероксидных анионов О2 и эйкозаноидов) .

С20Н41СООМ; СН^-

эйкозанкарбоновая кислота

- СН-=СН- СН2- СН= СН -СН2- СН=СН-СН2 НООС- (СН2)3~ СН =СН

эикозантетраен-5,8,1 1,14-овая кислота (арахидоновая кислота)

Ингалированный PAF повышает экскрецию лейкотриенов с мочой, возможно потому, что он стимулирует повышенное накопление их в легких как медиаторов воспаления. Лейкотриены ранее называли "медленно реагирующими субстанциями" при анафилаксии (SPS-A).

TGF - гормоноподобные вещества, которые могут индуцировать временный неопластический рост и дифференциацию нормальных клеток. Фибробласты в среде с TGF не нуждаются затем в субстрате для роста и не отвечают на межклеточные контакты. После удаления TGF из культуральной среды клетки возвращаются к нормальному росту.

Семейство лейкотриенов [О.В.Мосин]

TGFa близко родственен эпидермальному ростовому фактору (EGF) благодаря обладанию тем же клеточным рецептором.

TGFa - одиночный полипептид, содержащий 50 аминокислотных остатков; он взаимодействует с тем же рецептором, что и EGF и проявляет такую же потенцию в индуцировании тирозин-киназной активности, связанной с EGF-рецептором. TGFa, в отличие от EGF, "запускает" эмбриогенез и активацию протоонкогенеза в течение регенерации поврежденных тканей.

TGF(3 - кислотостойкий полипептид, состоящий из двух идентичных субъединиц со 112 аминокислотами в каждой. Его ММ-25 кДа; изолированы TGFp - 1 и 2 с 71% гомологией между ними и сходной функциональной активностью. В частности, TGFp играет важную роль в генезе опухолей, развитии эмбриона, тканевой репарации и иммунорегуляции.

TGFfJ - ингибитор роста для большинства типов клеток, но может стимулировать образование внеклеточных матриксных белков типа фибронектина и коллагена. TGFa и Р выступают синергистами при трансформации различных клеточных линий.

В регуляции поведения клеток важную роль отводят семейству из четырех синдеканов, являющихся поверхностными протеогли-канами клеток. Из них более детально изучен синдекан- 1. В его так называемом внешнем домене, или эктодомене содержатся ковалентно связанные цепи гликозаминогликанов, состоящие преимущественно из гепарансульфата, а также из хондроитинсульфата. Синдекан - 1 селективно связывает различные внеклеточные матриксные молекулы через его гепарансулъфатные цепи. Одновременно он может связывать ростовые факторы и выступать вектором сайта стимуляции роста; здесь (в месте взаимодействия синдекана-1 с матриксом) иммобилизуется рецепторный комплекс для тирозинкиназы.

Плазматические клетки и ряд человеческих В-клеточных опухолевых линий экспрессируют синдекан-1 преимущественно в виде гепарансульфат-протеогликана. Способность В-клеточных линий связывать фибронектин и фибриллярные коллагеновые матрицы четко коррелирует с их экспрессией синдекана-1 на клеточной поверхности. Экспрессия этого протеогликана также сопряжена с пролиферацией клеток и, как предполагают, с малигнизацией их (от лат. malignus - злокачественный).

Кроме стимуляции роста синдекан-1 также участвует в регуляции морфологии клетки благодаря содействию организации элементов цитосколета, прежде всего, эпителиальных клеток.

Менее изученными гепарансульфат-протеогликанами являются синдекан-2 (фиброгликан), синдекан-3 (N-синдскан) и синдекан-4 (риудокан, амфигликан). Последнему приписывают внутриклеточную функцию возможного связывания других мембранных белков или цитоскелета.

Более "многоликим" представляется TNPa - полипептид с ММ 17 кДа. Он - медиатор воспаления и играет выдающуюся роль в патогенезе эндотоксического шока, вызванного грамотрицательными бактериями. TNPa стимулирует активность коллагеназы и продукцию простагландина Е2 синовиальными клетками, активность остеокластов и резорбцию костной ткани, способствует ангиогенезу, стимулирует пролиферацию фибробластов, индуцирует высвобождение ИЛ 1 и 6, PDGF. Вместе с тем, он - цитотоксический и цитостатический ингибитор опухолевого роста, вовлекается в патологические процессы типа раковой кахексии, или истощения (от греч. Kakos - плохо, oexis - состояние) и церебральной малярии (отлат. cerebrum - головной мозг).

Установлено, что убитые клетки Staphylococcus aureus стимулируют продукцию TNFa в культурах мононуклеарных фагоцитов или моноцитов крови человека. Предварительная обработка клеток бисбензили-зохинолиновым алкалоидом тетрандрином подавляет эту продукцию. Поэтому высказано предположение о том, что тетрандрин можно использовать для лечения воспалителъных заболеваний, при которых TNFa играет основную роль.

С добавлением или без добавления фороболов и ростовых факторов клетки опухолей теряют присущий нормальным клеткам фибронектин, округляются и в таком виде продолжают размножаться и существовать в ряду поколений. Привнесение к ним извне фибронектина сопровождается восстановлением их способности к адгезии, но без реверсии в нормальные клетки по физиолого-биохимической сущности, то есть они все равно остаются опухолевыми.

Следует отметить, что в культуру давно введены клетки крови, соединительной ткани и другие. Соединительнотканные клетки - фибробласты (от лат. fibra - нить, волокно; от греч. blastos - почка, росток, отпрыск) характеризуются выраженной адгезивностью благодаря обильной продукции ими фибронектина (см. рис. 152), поэтому их монослойные культуры всегда удаются с определенным успехом.

В искусственных условиях удается культивировать клетки эпидермиса кожи, то есть диплоидные и "продвинутые" в дифференциации клетки. Направленность такой работы, главным образом, практическая и результаты ее бесценны для ожоговых клиник. По сообщению немецких ученых (1988) за 6-7 недель из кусочка кожи размером 2 см2 можно получить "кожу" размером 1-2 м2. Для этого у пациента, которому предстоит пересадка кожи, берут кожный лоскут и помещают в раствор специальных ферментов, эпидермис отделяется от подлежащих слоев кожи, его промывают и переносят в питательную жидкость. Клетки делятся, а в присутствии стимуляторов их рост еще более ускоряется.

Получение инсектопатогенных вирусов в клеточных культурах. Культуры клеток и тканей насекомых приобрели большое значение в различных биологических науках (эндокринология, биохимия, вирусология и др.) и в биотехнологии. Это стало возможным благодаря разработкам соответствующих сред, на которых хорошо развиваются указанные биообъекты, а на объектах, в свою очередь, можно с успехом поддерживать рост соответствующих патогенов, поражающих растения, животных и человека (паразиты и вирусы). Более того, на культурах клеток и тканей насекомых можно обеспечить продукцию вирулентных инсектовирусов и рекомбинантных белков, используя вирусы насекомых в качестве векторов. В этой связи велика роль таких культур в контроле за чумой, используя биотехнологию.

Прогресс в получении клеточных линий насекомых был последовательно обеспечен трудами В. Трагера в конце 30-х годов текущего столетия, С. Вьятта (1956), Т. Д. С. Грейса (1962). Грейс модифицировал среду Вьятта, включавшую 21 аминокислоту, пять солей, три сахара, три органические кислоты (рН -6,3-6,5), добавив в нее 9 витаминов комплекса В. В результате ему удалось изолировать 4 культуры, ставшие стабильными линиями клеток насекомых. В последующие годы были получены самые различные клеточные линии от насекомых, относящихся к различным порядкам, но с преобладанием Diptera (мухи, комары) и Lepidoptera - бабочки (от греч. di(s) - два, дважды, двух; pteron - крылышко; lepis -. чешуя). Для них наиболее часто используют среды Дж. Митсухаси и К. Марамороша (среда ММ), Шилда и Санга (среда МЗ), Шнейдера; Эхальера и Оганесяна (среда D-22), IPL-41 и другие. Фирма Sigma (США) выпускает указанные среды в сухом виде.

Технология выращивания вирусов на культурах клеток насекомых принципиально мало чем отличается от выращивания других вирусов на клетках животных и человека..

Интерфероны. Интерферон открыт А. Айзексом и Дж. Линдеманом в 1957 г. в клетках цыпленка, зараженных вирусом гриппа. Это видоспецифическое белковое вещество, синтезируемое лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногенов. Применительно к млекопитающим и, прежде всего, человеку под названием "лейкоциты" объединяют все белые клетки крови (от греч. leikos - белый, kytos - ячейка, клетка) - сегментоядерные лейкоциты (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные), или микрофаги, лимфоциты (Т и В) и моноциты. Все эти клетки являются ядерными и участвуют в обеспечении постоянства внутренней среды макроорганизма (гомеостаза), включая неспецифическую и специфическую защиту, или иммунитет. Однако сегментоядерные лейкоциты относят к разряду полинуклеарных, тогда как моноциты - к разряду мононуклеарных. Мононуклеарными фагоцитами (наравне с моноцитами) являются также гистиоциты, или макрофаги. К ним относят макрофаги соединительной ткани, звездчатые клетки Купфера в печени, альвеолярные макрофаги в легких, свободные и фиксированные макрофаги в лимфоузлах и селезенке, гистиоциты в коже, остеокласты в костной ткани, фиксированные макрофаги в костном мозге, макрофаги в серозных полостях (плевральной и брюшной), макрофаги в нервной ткани (клетки микроглии).

С учетом топологии и/или функции макрофаги подразделяют еще на резидентные, эксудативные (макрофаги воспалительного эксудата), активированные, индуцированные.

Моноциты, макрофаги и их предшественники объединены в так называемую систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Генеалогия (от греч. genea - рождение, происхождение, logos - обсуждение) клеток крови изучена достаточно глубоко.

Лейкоциты и другие клетки млекопитающих, в частности, при заражении вирусами продуцируют не один интерферон, а больше, объединяемых в семейство интерферонов, ингибирующих продуктивный цикл репликации вирусов. Вот почему они являются оружием первой линии защиты против вирусных инфекций.

Однако в обычных (неиндуцированных) клетках интерфероны не выявляются. Некоторые характеристики отдельных интерферонов приведены в таблице 56.

Таблица 56 Некоторые характеристики интерферонов человека

Тип Характеристики
интерферона клетки - индук- число локали- нали- стабиль- актив- длина ч. амк-т ММ.
продуценты тор генов ичтер-фе-

рона зация в хро-мосо-мвх чие нитронов в генах ность при рН2 ность в присутствии

дне сигнальной поспе- в первичной моле- в окончательной кДа
дова- куле моле-
тельно- куле
стти
(ч.амк-т)
лейко- вирус- 14 9 _ да да 23 166 143 17
циты ная
пери- индук-
фери- ция,
ческой двух-
крови нитэвая
РНК
фиб- - " - 2 9,2,5 да да 21 166 145 17
робпа- (5?))
сгы
лимфо- м ито ге- 1 12 - чет нет 20 166 146 17
циты ны jl|JI4
несен-
сибили-
зирован-
чых лим-
фоци-
тов),
специ-
фичес.
АГ
(сенси-
билизи-
ровач- -
ные лим-
фоциты)
Примечание: ДДС - натрия додецилсулъфат; ч. амк-т - число аминокислот, ММ - молекулярная масса в кнлодальтонах; АГ - антигены.

Как следует из таблицы размеры молекул интерферонов близки по числу аминокислот и молекулярной массе, хотя по другим признакам они различны; интерфероны (3 и у являются гликопротеинами, тогда как интерферон а - протеином.

Интерфероны - клеточные белки и поэтому они видоспецифичны, то есть каждому виду животного свойственен свой интерферон, но не являются вирусоспецифическими. При смешанной вирусной инфекции один вирус подавляет другой за счет интерфероногенности первого - феномен вирусной интеференции. Иногда эта видоспецифичность очень узкая, например, для курицы, утки, мыщи и крысы, но не перекрестно в группах птиц и грызунов или между группами. Однако есть исключения - человеческий интерферон защищает клетки крупного рогатого скота лучше, чем коровий интерферон.

Человеческие интерфероны аир продуцируются преимущественно лейкоцитами, В-лимфобластами и соединительнотканными клетками мезенхимного происхождения - фибробластами в ответ на вирусную инфекцию. Интерферон у прежде называли иммунным, или тип 2; он образуется несенсибилизированными лимфоидными клетками Т-лимфобластами в ответ на митогены, и сенсибилизированными лимфоцитами при стимуляции специфическими антигенами (таблица 57). Т а б л и ц а 57. Виды индуцируемых интерферонов

Интерфероны Система

индуктор клетки -продуценты
лейкоцит арный -а вирус лейкоциты периферической крови
лимфобластпый-а - "- В -лим фобласты
фибробластный-р - "- фибробласты
имунный-у митоген лейкоциты периферической крови или Т-лимфобласты

специфический антиген лимфоциты
Установлено, что индукторами интерферонов могут быть: инактивированные температурой или УФЛ вирусы гриппа, реорота и другие вирусы; двухнитевые РНК (например, реовирусная); некоторые полианионные вещества (бактериальные эндотоксины, поликарбоновые кислоты, сополимеры пирана); синтетические двухнитевые полирибонуклеотиды, например, полиИ: поли Ц -можно достичь супериндукции интерферона, если обрабатывать клетки полиИ: полиЦ вместе с циклогексимидом (ингибитором синтеза белка), а спустя 5 часов - актиномицином Д. Механизмы индукции интерферона до конца еще не изучены и трудно объяснить почему, например, двухнитевые РНК стимулируют образование интерферона, а двухнитевая ДНК не обладает аналогичным действием.

На практике интерферон-а выделяют из лейкоцитов при низкоскоростном центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в культуральную среду, содержащую либо сыворотку крови человека или казеин молока, в среду вносят вирус - интерфероноген (вирус Сендай или вирус ныокаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус - интерфероноген инакти-вируют любым из приемлемых способов.

Супернатант (от лат. supernatans - плавающий на поверхности), или надосадок представляет собой нативный интерферон. Его лиофилъно высушивают и выпускают в ампулах. Это - пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный интерферон путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах. Полученный препарат после высушивания имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворимый в воде. Тот и другой интерфероны должны быть стерильными.

Активность препаратов определяют титрованием на первичных культурах клеток, например, кожно-мышечной ткани эмбриона человека с вирусом везикулярного стоматита. Противовирусная активность (так называемая удельная активность) нативного интерферона должна быть не менее 32 единиц, концентрированного - 100 единиц. Для очистки интерферона можно прибегнуть и к высоко эффективной жидкостной хроматографии.

Интерферон |3 получают из фибробластов, выращенных в монослойной культуре, индуцированной полиИ: полиЦ в присутствии циклогексимида и актиномицина Д. Обычно интерфероны продуцируются в малых количествах (около 1 мг на 10 л тканевой кулътуральной жидкости) и, к тому же, после 48-72 часов клетки-продуценты отмирают. Вот почему производство лейкоцитарных интерферонов относят к разряду дорогостоящих и экономически - мало выгодных. Поэтому успешно завершившиеся работы по генно-инженерному интерферону помогли решить и эти проблемы.

Этапы клонирования гена интерферона [О.В.Мосин]

В начале 80-х годов XX в. британская фирма The Wellcome Foundation LTD передала на клинические испытания природную смесь ct-интерферонов, полученную в глубинной суспензионной культуре вирусоиндуцированных человеческих лимфобластов. Препарат был назван "велфероном". Выпускается в виде стерильной, прозрачной, бесцветной жидкости по 1 мл (3 мегаединицы-МЕ). К 1988 году уже три фирмы выпускали а-интерфероны:

1) выше названный велферон - фирма Wellcome Found.,

2) интрон А - фирма Kirby-Warrick,

3) роферон А - фирма Roche.

Интрон А и роферон А являются генно-инженерными препаратами, содержащими лишь один субтип а-интерферона и различающиеся по одной аминокислоте. Так, роферон А обозначается как интерферон а2а; он содержит в полипептидной цепи лизин в позиции 23. Интрон А - это а2Ь-интерферон, содержащий аргинин вместо лизина. Как оказалось, роферон А индуцирует антителообразование примерно у 25% больных, у которых благодаря этому нейтрализуется введенный интерферон. Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов (как одна из возможных) принципиально сводится к следующему:

1. индукция синтеза и выделение интерфероновой мРНК из
клеток,

2. получение кДНК, комплементарной интерфероновой мРНК
из лейкоцитов,

3. встраивание кДНК в плазмиду,

4. введение реконструированной плазмиды в клетки Е. coli,

5. размножение бактерий, содержащих реконструированную
плазмиду, в культуральной среде,

6. сепарирование клеток Е. coli,

7. дезинтеграция и экстракция клеток Е. coli,

8. осаждение (например, полиэтиленамином) с последующим
центрифугированием,

9. высаливание интерферона из супернатанта аммония сульфатом,

10. диализ осадка интерферона,

10. растворение интерферона, пропускание раствора через
колонку с иммуносорбентом (пришитыми моноклональными антителами).

11. 12. элюция интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике.

12. Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реализуются в производственных условиях, тогда как первые 4 стадии выполняются в лабораторных условиях. Кстати сказать, эти 4 стадии наиболее трудные и сложные.

Бактерии с генами интерферона человека продуцируют специфический белок в количестве 200-250 мкг/л бактериальной суспензии. Кроме Е. coli удается получать человеческий интерферон с помощью Вас. subtilis, способную секретировать синтезируемые белки в окружающую среду (у Е. coli они накапливаются в периплазматическом пространстве), а также с помощью Saccharomyces cerevisiae, растущих на средах с более дешевыми субстратами, на них не действуют фаги, они крупнее бактерий и легче сепарируются, в их клетках осуществляется процессинг преинтерфсронов. Применяют также культуры бактерий из родов Methylomonas, Pseudomonas, Salmonella. Все названные микроорганизмы конститутивно (т.е. не адаптивно) образуют интерфероны, не отличающиеся от природных. Против всех классов интерферонов получены моноклон альные антитела, с помощью которых проводят быструю и высококачественную очистку продуктов, применяя иммуноафинную хроматографию.

На практике интерфероны применяют при вирусных инфекциях, ревматоидном артрите (интерферону), при иммунопатологии и в онкологии.

ЛИТЕРАТУРА

Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. М., Мир, 1989.

Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология, М, ВО Агропромиздат, 1990.

Биотехнология клеток животных. В 2-х томах. Под ред. Р. Е. Спиера и Дж. Гриффитса. М., ВО Агропромиздат, 1989.

Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М., Мир, 1988.

Воробьева Л. И. Промышленная микробиология. М., МГУ, 1989.

Сассон А. Биотехнология. Свершения и надежды. М., Мир., 1987.

Седых Н. В., Кристапсонс М. Ш. Контроль качества в биотехнологии. Рига, Зинатне, 1990.

Щелкунов С. Н. Клонирование генов. Новосибирск, Наука, 1986.

ЛИТЕРАТУРА

Бейли Дж.г Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х частях. М., Мир, 1989.

Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология, М, ВО Агропромиздат, 1990.

Биотехнология клеток животных. В 2-х томах. Под ред. Р. Е. Спиера и Дж. Гриффитса. М., ВО Агропромиздат, 1989.

Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М., Мир, 1988.

Биотехнология растений. Под ред. С. X. Мантелла и X. Смита. М., ВО Агропромиздат, 1987.

Варфоломеев С. Д., Калюжный С. В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов. М., Высшая школа, 1990,

Виестур У. Э., Шмите И. А., Жилевич А. В. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. Рига, Зинат-не, 1987.

Воробьева Л. И. Промышленная микробиология. М., МГУ, 1989.

Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М., Высшая школа, 1991.

Блинов Н. П. Химическая микробиология. М., Высшая школа, 1989.

Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.

Иммунологические методы. Под. ред. Г. Фримеля. М., Медицина, 1987.

Иммунология. Под ред. У. Пола в 3-х томах. М., Мир, 1989.

Каратыгин И. В. Коэволюция грибов и растений. Санкт-Петербургский Гидрометеоиздат. С.-Пбг. 1993.

Коваль Э. 3., Сидоренко Л. П. Микодеструкторы промышленных материалов. Киев, Наукова Думка, 1989.

Кузник Э. 3., Васильев Н. В., Цыбиков Н. Н. Иммуногенез, гемостаз и неспецифическая резистентность организма. М., Медицина, 1989.

Ленинджер А. Основы биохимии в 3-х томах. М., Мир, 1985.

Лиепинын Г. К., Дунцэ М. Э. Сырье и питательные субстраты для промышленной биотехнологии. Рига, Зинатне, 1986.

Льюин Б. Гены. М., Мир, 1988.

Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Сб. научи, трудов под ред. С. Г. Инге-Вечтомова. А, Наука, 1986.

Муромцев Г. С., Бутенко Р. Г., Тихоненко Т. И., Прокофьев М. И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М.( ВО Агропро-миздат, 1990.

Перспективы биохимических исследований. Под ред. Дж. Туза и С. Прентиса, М., Мир, 1987.

. Петров Р. В. Иммунология. М., Медицина, 1987.

Промышленная микробиология. Под общей ред. Н. С. Егорова. М., Высшая школа, 1989.

Рыбчин В. Н. Основы генетической инженерии. Минск, Вы-шэйшая школа, 1986.

Сассон А. Биотехнология. Свершения и надежды. М., Мир., 1987.

Седых Н. В., Кристапсонс М. Ш. Контроль качества в биотехнологии. Рига, Зинатне, 1990.

Щелкунов С. Н. Клонирование генов. Новосибирск, Наука, 1986.


 Ваша оценка:

Связаться с программистом сайта.

Новые книги авторов СИ, вышедшие из печати:
О.Болдырева "Крадуш. Чужие души" М.Николаев "Вторжение на Землю"

Как попасть в этoт список

Кожевенное мастерство | Сайт "Художники" | Доска об'явлений "Книги"