Миронов А.А.(Миронин Сигизмунд Сигизмундович), Комиссарчик Я.Ю. Миронов В.А.. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине

Оглавление

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

А. А.МИРОНОВ, Я. Ю. КОМИССАРЧИК, В. А.МИРОНОВ

МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Ответственный редактор Н. Н. Никольский

Санкт-Петербург "НАУКА" 1994

Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. - СПб. Наука, 1994. - 400 с.
В монографии изложено большинство современных подходов к препарированию биологических объектов для исследования в трансмиссионных и сканирующих микроскопах различные способы их криофиксации и прямого исследования в электронном микроскопе (замораживание-скалывание), низкотемпературная дегидратация (замораживание-замещение) и дегидратация в критической точке, низкотемпературные заливочные среды и условия их пропитки и полимеризации, существующие методы гистохимии и иммуноцитохимии с использованием различных электронно-плотных меток и др.
В книге приведен также ряд рутинных методов, которые оправдали себя и до сих пор широко используются: различные способы химической фиксации, дегидратации, заливки в эпоксидные смолы, микротомирование стеклянными и алмазными ножами, контрастирование солями тяжелых металлов и др.
Большое место отведено критическому анализу возникающих в процессе препарирования артефактов. Рассмотрены причины их возникновения и пути их профилактики. Значительное внимание уделено количественному анализу в электронной микроскопии, в том числе рентгеновскому микроанализу.
Специальные разделы посвящены методам изучения проницаемости и транспорта веществ в клетках, тканях и органах, а также сочетаемости различных методов электронной микроскопии. Обстоятельно рассмотрены вопросы интерпретации и объемной реконструкции электронно-микроскопических изображений.
В конце книги дан перечень рекомендуемых авторами протоколов основных методов препарирования объектов для электронно-микроскопического исследования.
Книга рассчитана на широкий круг научных сотрудников, аспирантов, студентов и практических работников, занимающихся или интересующихся морфологическими аспектами различных биологических дисциплин.
Библиогр. 377 назв. Ил. 39. Табл. 5.

Рецензенты: Г.А. Алимов, М.Д. Донскова, С.А. Кроленко, В.А. Отеллин

ISBN 5-02-026743-0
А.А. Миронов, Я.Ю. Комиссарчик, В.А. Миронов, 1994
Российская академия наук, 1994
Художественное оформление - Ю.П. Амбросов, 1994

ПРЕДИСЛОВИЕ

В настоящее время, с одной стороны, морфологическая наука имеет в своем распоряжении большой набор методических приемов, позволяющих проводить анализ как на молекулярном, так и на органном и даже системном уровне. Электронный микроскоп превратился из уникального, экзотического прибора в обычный, доступный большинству морфологов инструмент исследования, спектр возможностей которого чрезвычайно широк. С другой стороны, при проведении диагностических и экспериментальных исследований все чаще возникает потребность в привлечении для уточнения диагноза и расшифровки патогенеза заболеваний методов высокого разрешения: просвечивающей (трансмиссионной) и сканирующей электронной микроскопии, замораживания - скалывания, молекулярных зондов, иммуноэлектронной микроскопии и т.д.
Электронная микроскопия в последние годы совершила качественный скачок в своем развитии. Разработаны и успешно используются новые методы выявления различных компонентов клеток и тканей, такие как иммуноэлектронная микроскопия (с помощью, антител) и гибридизация in situ; совершенствуются уже известные методические подходы как в плане аппаратурного обеспечения, так и в вопросах подготовки объектов к просмотру в микроскопе.
Стремительное развитие науки и техники делает особенно важным их информационное обеспечение. К сожалению, существующие за рубежом руководства практически недоступны для широкого круга отечественных ученых. Однако даже за рубежом отсутствует руководство, в котором были бы в достаточно краткой форме, но в полном объеме изложены все методы электронной микроскопии. Поэтому публикация всеобъемлющего отечественного руководства по гистологической технике в электронной микроскопии стала насущно необходимой.
Авторы предлагаемой к рассмотрению монографии имеют большой опыт работы в области практической электронной микроскопии: Я.Ю. Комиссарчик - профессор, доктор биологических наук, работает в области электронной микроскопии более 40 лет, возглавляет лабораторию ультраструктуры клеточных мембран Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург); А.А. Миронов - профессор, доктор медицинских наук, работает в области электронной микроскопии более 20 лет, является руководителем лаборатории электронной микроскопии Ивановского медицинского института (г. Иваново); В.А. Миронов - кандидат медицинских наук, в настоящее время работает на кафедре клеточной биологии и анатомии медицинского университета Южной Каролины (г. Чарльстон, США), является действительным членом обществ электронной микроскопии Германии и США. Авторы имеют множество публикаций методического плана, в том числе обзорных работ, посвященных тому или иному методу электронной микроскопии. Кроме того, Я.Ю. Комиссарчик разработал один из первых отечественных ультратомов.
Академик РАН Н.Н. Никольский
ВВЕДЕНИЕ

Возникновение электронной оптики, в частности электронной микроскопии (ЭМ), основывается на трех основных достижениях в области физики, относящихся к 1897-1926 гг. открытие электрона, установление волновой природы движущихся материальных частиц и обнаружение отклоняющего действия электрических и магнитных полей на заряженные частицы. Эти предпосылки позволили Э. Руска и М.Кнолю в 1931 г. разработать первый просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп (ТЭМ), а в 1935 г. - первый сканирующий электронный микроскоп (СЭМ). Если в 40-х годах в ТЭМ было достигнуто разрешение 4 нм, то в 50-х - уже 0.4 нм. В 1938 г. появился сканирующий трансмиссионный электронный микроскоп (СТЭМ) с диаметром электронного зонда 10 нм.
Первая промышленная модель электронного микроскопа (ЭМ) была выпущена в 1939 г. фирмой "Сименс и Гальске" (Нидерланды). Эффективное использование ТЭМ началось с 1950 г. Первый серийный СЭМ "Стереоскан" был разработан фирмой "Кембридж Инструменте" (Англия) и поступил в продажу в 1964 г.
Трое исследователей, начавших в этот период работы по электронно-микроскопическому изучению биомембран и функций органелл (в основном митохондрий и лизосом), Г.Палад, К. Де-Дюв и А.Клод, получили в 1974 г. Нобелевскую премию за достижения в области сравнительного ультраструктурного и биохимического анализа. А в 1987 г. Э.Руска за разработку первого электронного микроскопа был удостоен Нобелевской премии по физике.
Быстрое развитие техники и технологии создает принципиально новые возможности для ЭМ. Предельный уровень разрешения ТЭМ (0.1 нм) и СЭМ (2-3 нм) уже в настоящее время позволяет наблюдать крупные молекулы и надмолекулярные структуры in situ [127, 255, 284, 286].
В современных ЭМ успешно используется ряд конструктивных особенностей, значительно облегчающих их эксплуатацию: 1) съемка осуществляется на фотопленку, расположенную вне вакуумной системы; 2) в колонну ТЭМ встраивается телекамера, это дает возможность увеличить контрастность изображения и уменьшить интенсивность электронного пучка; 3) используются турбо-молекулярные насосы, что позволяет избежать загрязнения парами масла; 4) применяются устройства для изучения объектов на сверхмалых увеличениях с сохранением разрешения и использованием особомелкозернистой пленки; 5) внедрены приспособления, позволяющие фокусировать пучок электронов на небольшом поле объекта; 6) микроскопы комплектуются анализаторами изображения; 7) приборы оборудованы микропроцессорами, позволяющими фокусировать изображение, оптимизировать контрастность и экспозицию, сохранять изображение в памяти; 8) используются системы электромеханического перемещения образцов в колонне [127, 284].
Новые СЭМ, оснащенные электронной пушкой с холодной эмиссией электронов, имеют чрезвычайно малый (менее 1 нм) диаметр пучка электронов [167]. Это приближает достигаемое в них разрешение к уровню ТЭМ. В современных СЭМ высокого разрешения образцы вводятся прямо в поле нижней электромагнитной линзы, что дает возможность улавливать с практически одинаковой эффективностью электроны, вылетающие из любых участков образца.
В ближайшее время ожидается внедрение высокотемпературных сверхпроводящих материалов, обеспечивающих получение сверхвысокостабильных параметров СЭМ, и новых детекторов, позволяющих регистрировать одиночные электроны; кроме того, намечается все более широкое использование криометодов: замещения в замороженном состоянии, напыления в условиях сверхнизких температур. Еще большие перспективы открывает применение СТЭМ [127, 284].
Отличительными особенностями низковольтных СЭМ являются низкое ускоряющее напряжения (ниже 1 кВ), а также наличие работающего на основе холодной эмиссии источника электронов и короткофокусной проекционной линзы. Низковольтная сканирующая ЭМ обеспечивает более высокую топографическую контрастность и меньшую выраженность артефактов, связанных с лучевыми повреждениями объектов.
Низковольтная сканирующая ЭМ дает возможность изучать особенности строения зоны, расположенной непосредственно под поверхностью объекта. Применение низковольтной сканирующей ЭМ позволяет исследовать образцы без нанесения электропроводящего покрытия. Температура объекта в коммерческих низкотемпературных СЭМ (крио-СЭМ) поддерживается на уровне -160®С [142,151,285,].
Низкотемпературная сканирующая ЭМ имеет ряд преимуществ перед обычной сканирующей ЭМ: 1) поверхность фазового раздела содержит воду; 2) размеры клеток и тканей не искажены, в то время как после высушивания в критической точке величина линейного сжатия достигает 20 % и более, а при сублимации - до 7 %; 3) сохраняются все тканевые компоненты, удаляемые при препарировании объектов для обычных СЭМ; 4) фиксация происходит быстрее, метаболические процессы прекращаются почти мгновенно; 5) рентгеновский микроанализ (РМА) проводится без потерь и перемещения основных химических компонентов; 6) электронная бомбардировка не приводит к нагреванию объекта; 7) при раскалывании объектов прямо в колонне низкотемпературного СЭМ достигается комплементарность сколотых поверхностей, что упрощает реконструкцию объемного изображения объекта [292].
Однако у данного метода имеются существенные недостатки: 1) в процессе замораживания могут образовываться кристаллы льда, разрушающие структуры и перераспределяющие химические компоненты; 2) требуются специальные процедуры для предотвращения контаминации образцов при переносе их в колонну СЭМ; 3) цены на современные микроскопы становятся все более высокими [265].
В 1989 г. для исследователей, работающих с СЭМ, стал доступен новый тип этого прибора, названный "СЭМ в условиях окружающей среды" (environmental SEM), сущность которого состоит в том, что объекты во время исследования находятся не в высоком вакууме, а в условиях остаточной воздушной среды, что предохраняет их от полного высыхания. Некоторые организмы, например насекомые, способны выживать в этих условиях. Этот тип СЭМ позволяет исследовать не фиксированные, не замороженные и не покрытые проводящим слоем биологические образцы при давлении, в 106 раз превышающем таковое в обычных СЭМ. Разрешение таких микроскопов составляет 10 нм [105, 247].
В настоящее время ЭМ является методом, позволяющим изучать макромолекулярную структуру клеток, а в некоторых случаях переходить и на молекулярный уровень. Можно без преувеличения сказать, что ЭМ в современной биологии и медицине как бы связывает воедино различные пути исследований молекулярных основ жизни. В то же время (при увеличении порядка 1000-3000 раз) она сохраняет ряд возможностей методов световой микроскопии (СМ), а использование полутонких срезов перекидывает мосты между современными и классическими морфологическими подходами к изучению клеток и тканей. И все же хотелось бы подчеркнуть, что даже сейчас возможности ЭМ почти целиком определяются методами электронно-микроскопического препарирования, поскольку в большинстве случаев разрешение методов препарирования существенно ниже разрешения самих ЭМ. Именно это и определило направленность рукописи.
Основная задача книги - дать общее представление о методах ЭМ. Мы попытались создать унифицированную классификацию методов ЭМ-исследования и сопроводить описание методов кратким справочником, который включал бы в себя основные, хорошо зарекомендовавшие себя прописи. Процедуры, относящиеся к химии, биохимии и иммунологии, мы в книге, как правило, не приводим, отсылая заинтересованного читателя к соответствующей литературе, количество которой настолько велико, что нам пришлось цитировать лишь обзорные статьи и руководства, а также статьи последних лет.

Между тем известно, что в каждой лаборатории ЭМ существуют свои "секреты", которые остаются секретами не потому, что их тщательно оберегают, а потому, что в публикуемые статьи часто физически невозможно включить все те методические тонкости и уловки, которые применяются в повседневной работе. Таким образом, чтение любого руководства не всегда может заменить личное общение с авторами методов, поэтому роль конференций, симпозиумов, школ и других научных форумов в современной науке трудно переоценить.
В 1993 г., когда эта рукопись была сдана в издательство, исполнилось 30 лет со дня выхода в свет первой отечественной монографии по электронной микроскопии - "Основы гистологической техники электронной микроскопии", - автор которой, Л.С. Гольдин [16], являлся учителем одного из авторов настоящей книги, Я.Ю. Комиссарчика. В этом нам видится определенная преемственность данной монографии.

Глава 1 ФИКСАЦИЯ

Все биологические процессы, которые исследуют с помощью ЭМ, можно подразделить на четыре группы, определяющие возможные методы препарирования: 1) очень быстрые, к примеру слияние биологических мембран во время экзоцитоза (для их изучения используются сверхбыстрая криофиксация с соответствующим последующим препарированием); 2) быстрые процессы, например сокращение мышц, экзо- и эндоцитоз, трансцитоз, процессы везикуляции мембран, перемещения ионов и тд. (методы препарирования те же); 3) медленные процессы, например кластеризация внутримембранных частиц, перестройки других структур клеточной мембраны, изменения формы и размеров органелл, реорганизация структуры цитоскелета и щелевых соединений и т.п. (можно использовать рутинные методы ЭМ); 4) очень медленные процессы, например движения хромосом, клеточное деление [284].
В процессе препарирования образцов для ТЭМ выделяют следующие этапы: взятие материала, префиксация, дофиксация, промывание, постфиксация, обезвоживание, инфильтрация промежуточными растворителями, пропитывание заливочной смолой, заключение в смолу и перевод ее в твердое состояние, изготовление полутонких срезов (ПС) и ультратонких срезов, или ультрасрезов (УС), окрашивание (контрастирование) УС и их просмотр. В этот перечень при использовании различных методов ЭМ могут включаться этапы высушивания, замораживания, нанесения электропроводящего покрытия, напыления (оттенения) и др. [9,11, 76, 81, 193].
Цель фиксации - сохранить структуру ткани в состоянии, близком к прижизненному. Фиксация защищает ткани от повреждения во время заливки, резки и воздействия электронного пучка. Фиксация решает две взаимосвязанные задачи: 1) останавливает идущие в тканях метаболические процессы и препятствует посмертному распаду структур; 2) стабилизирует то пространственное положение молекул, надмолекулярных структур и органелл, которое они занимали при жизни в момент, предшествующий фиксации. При этом в результате фиксации могут выявляться структуры двух типов: 1) прижизненно существующие; 2) не существующие при жизни (артефакты), которые в свою очередь делятся на два подтипа - артефакты, закономерно возникающие при фиксации, и артефакты, связанные с нарушением условий препарирования.
В зависимости от способа прекращения метаболических процессов различают физическую и химическую фиксацию. Физическая фиксация осуществляется в процессе замораживания или теплового воздействия, чаще всего с помощью микроволнового излучения (МВИ) [193].

1.1. ВЗЯТИЕ МАТЕРИАЛА

Пробы для ЭМ берут у только что забитых животных как можно быстрее, чтобы предотвратить посмертные изменения. Агональная фаза фиксации - это время между прекращением артериального кровотока к тканям и моментом блокирования фиксатором процесса аутолиза. Следует учитывать, что при работе на человеческом материале она может оказаться довольно продолжительной. Правильное взятие материала - важная предпосылка успеха как фиксации, так и всей дальнейшей работы, поэтому исследователь должен делать это сам, не поручая другому лицу.
При работе с экспериментальными животными обязательным является соблюдение правил эфтаназии. Отметим, что при взятии материала для ЭМ сублетальные дозы анестетиков предпочтительнее декапитации или цервикальной диссоциации (обычно перелом шейного отдела позвоночника). Анестетики желательно подбирать для каждого вида животного. В ряде случаев для этой цели используют сухой лед. Идеального способа взятия материала не существует. Так, анестетики могут изменять физиологическое состояние клеток, а вырезание образцов ведет к механическим деформациям, вызывает состояние гипоксии.
Взятие материала для фиксации нужно осуществлять с величайшей осторожностью, поскольку механическое воздействие на ткани может сделать материал непригодным для исследования. Обычно в руководствах по ЭМ указывается, что размеры объектов, от которых можно с уверенностью получить хорошие срезы, не должны превышать 1 мм. Сразу вырезать такой кусочек из ряда органов часто не представляется возможным. Тем не менее мы не можем рекомендовать метод, который до сих пор применяют во многих лабораториях, - измельчение ткани в капле фиксатора. Не всегда оправданной представляется тактика первоначального взятия кусочков больших размеров с последующим вырезанием из них более мелких кусочков в процессе обработки. Лучше вначале разрезать образец свежим лезвием бритвы, опустить в фиксатор, а затем (примерно через 1 ч) с помощью нового лезвия бритвы приготовить (со стороны разрезанной профиксированной поверхности) тонкие (толщиной не более 1 мм) ориентированные пластинки, которые дофиксировать [88, 193].

1.2. ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ

Несмотря на наличие существенных ограничений, химическая фиксация наиболее широко используется для ЭМ. Она предполагает воздействие на образцы веществ, которые, химически связываясь с компонентами ткани, стабилизируют их. Возможны следующие варианты химической фиксации: перфузионная, иммерсионная, накалывание in situ. Для СЭМ фиксация может осуществляться одним из следующих способов: 1) заполнение (например, с помощью инъекции) просвета полого органа (кишка, желчный и мочевой пузырь, воздухоносные пути, желудочки мозга), 2) сосудистая перфузия, 3) иммерсия, 4) накалывание, 5) тканевая микроинъекция, 6) в парах фиксатора [9, 11, 215]. В последнем случае фиксация объектов может осуществляться в вакууме (например, с помощью молекулярных пучков четырехокиси осмия) после быстрого замораживания и сублимации воды [223].
Критическими факторами фиксации являются используемый фиксатор, рН, ионная сила раствора, ионный состав, диэлектрическая константа, осмолярность, температура, длительность фиксации, метод нанесения фиксатора.
Фиксирующие вещества применяются обычно в виде водных растворов. Величина рН этих растворов в течение фиксации поддерживается на уровне физиологических значений с помощью буферных растворов, а изоосмотическое давление создается добавлением некоторых осмотически активных веществ. Ткани, фиксированные при значениях рН фиксатора от 6 до 8, мало отличаются по структуре, однако в случае исследований, требующих предельных разрешений, соблюдение рН считается очень важным. Большая концентрация фиксатора требует меньшего времени фиксации, но значительно изменяет антигенные свойства и ультраструктуру тканей [17, 72, 193].
Высокая температура увеличивает скорость химических реакций и проникновения фиксатора, но одновременно растет и скорость аутолиза, низкая температура оказывает противоположное действие. Фиксация при t=О®С проводится для того, чтобы свести к минимуму посмертные изменения ткани и экстрагирование тканевых компонентов. Большинство исследователей используют фиксирующие растворы комнатной температуры [193]. В этом случае некоторые клеточные органеллы, например микротрубочки, выявляются лучше.
При химической фиксации необходимо соблюдать ряд условий. 1. Объем фиксатора должен в 10 раз превышать объем образца. 2. Если при погружении образца в фиксатор последний мутнеет, то его необходимо немедленно заменить. 3. Нельзя переносить образцы из одного флакона в другой с помощью пинцетов. Отработанные растворы либо удаляют пипеткой, либо сливают через край. Чтобы не потерять образцы, рекомендуется делать это над чашкой Петри или сливать жидкость через ситечко из инертного материала. При наклоне флаконы лучше развернуть этикеткой вверх, чтобы капли жидкости не смыли надпись. Для удаления остатков жидкости флаконы переворачивают вверх дном на кусок фильтровальной бумаги. Образцы при этом, как правило, прилипают ко дну флакона. 4. Следует учитывать скорость проникновения фиксатора в ткани (см. ниже). 5. Очень мало известно о результатах перефиксации. Отмечено, однако, что с увеличением длительности химической фиксации растут степень сжатия тканей и величина экстракции тканевых компонентов. Возможны и тканевые повреждения, если фиксирующие агенты являются сильными окислителями (четырехокись осмия, перманганат калия и др.) [25, 26].

1.3. ХИМИЧЕСКИЕ ФИКСАТОРЫ

Фиксатор для ЭМ должен отвечать следующим требованиям: 1) быстро проникать в ткани; 2) сохранять третичную структуру молекул антигенов и их доступность для взаимодействия с антителами; 3) его рН, молярность и ионный состав должны быть близкими к таковым у вне- или внутриклеточной жидкости. Требуется тщательный подбор метода фиксации для каждой новой задачи [367].
Все фиксаторы можно разделить на четыре группы: 1) быстро проникающие и быстро фиксирующие (акролеин); 2) медленно проникающие и медленно фиксирующие (четырехокись осмия); 3) медленно проникающие, но быстро фиксирующие (глютаральдегид); 4) быстро проникающие, но медленно фиксирующие (формальдегид) [15, 26, 193, 367].

1.3.1. Характеристика фиксаторов

Наиболее широко в ЭМ используются аддитивные фиксаторы - глютаральдегид, формальдегид, четырехокись осмия и акролеин, которые получили это название из-за того, что они как бы встраиваются в структуру фиксируемых веществ, прежде всего протеинов. Идеальных фиксаторов нет - любой из применяемых имеет свои положительные и отрицательные стороны.

1.3.1.1. Четырехокись осмия (ЧО)

ЧО (OsО₄, тетроксид осмия) представляет собой блестящие бесцветные или слегка желтовато-зеленоватые игольчатые кристаллы. Они светочувствительны и гигроскопичны. ЧО - неполярное вещество, проникающее как сквозь заряженные, так и незаряженные поверхности липидного бислоя и растворяющееся как в полярных, так и в неполярных средах. Насыщенный водный раствор при t=25®С содержит 7,24 % ЧО. Раствор ЧО в этаноле нестабилен.
ЧО взаимодействует с липидами по месту двойных связей, а затем реагирует с их полярными группами, она слабо реагирует с олеиновой, линолевой и молочной кислотами, фибрином, почти совсем не реагирует с пальмитиновой и стеариновой кислотами. ЧО способствует образованию поперечных связей между молекулами белков, в том числе за счет взаимодействия с SS- и SH-гpyппами и аминогруппами боковых цепей. Нуклеиновые кислоты и углеводы, вероятно, не реагируют с ЧО. Однако если нуклеиновые кислоты связаны с белками, как, например, в рибосомах или хромосомах, то такой комплекс оказывается реакционноспособным. Малорастворимые частицы агрегированного гликогена обычно удерживаются в клетках молекулярной сетью фиксированных белков. Небольшие растворимые молекулы, как правило, фиксируются плохо [105]. ЧО блокирует ферментативную активность и стабилизирует липопротеиновые комплексы, фосфолипиды ядра и цитоплазмы в первую очередь за счет реакций с липидами, а также с SH- и SS-группами белков. Кроме того, ЧО "окрашивает" субмикроскопические структуры клеток, меняет антигенные свойства тканей. Немедленно после контакта с ней плазмалемма теряет свои барьерные свойства для малых молекул. ЧО действует и как мордант, т.е. вещество, которое способно связываться с красителем, усиливая контрастность структуры в ЭМ. В частности, ЧО является мордантом (см. гл. 7) для ионов свинца [193].
ЧО чаще используется в качестве постфиксатора. При этом ненасыщенные связи жирных кислот оксигенируются ею, а сама ЧО восстанавливается до осмиевой черни. Образцы приобретают черный цвет. Контрастность биологических тканей возрастает. Осмиевая чернь, образующаяся в тканях, представляет собой смесь свободного металла, оксидов и циклических осматополимеров. В процессе обезвоживания в этаноле восстановление ЧО продолжается, что приводит к дальнейшему почернению объектов.
При обработке фиксированных в ЧО тканей избытком тиокарбогидразида его молекула присоединяется одним концом к атому Os в ткани, при повторной экспозиции в растворе ЧО с этими участками дополнительно связываются атомы ЧО, что усиливает контрастность осмиофильных компонентов клеток [193, 367].
ЧО образует поперечные связи с белками, в результате чего возникает гелеподобная структура, но и длительная инкубация с ЧО может привести к разрывам белковых молекул. Продукты реакции многих белков и липидов с ЧО растворимы в воде, особенно при длительной фиксации, поэтому оправдана кратковременная фиксация или использование при длительной фиксации хромовой кислоты в качестве стабилизатора липидов [105, 193].

1.3.1.1.1. Режим использования

В настоящее время ЧО чаще всего используется в качестве постфиксатора. Скорость проникновения ЧО в ткани (0.5 мм/ч) ниже, чем глютаральдегида (ГА). Поэтому в центре кусочка фиксация иногда хуже, чем на периферии, где он может быть даже перефиксирован.
Для фиксации обычно используют 1%-ные растворы ЧО на буфере. Продолжительность постфиксации 1 ч. Если применяется одноступенчатая процедура, то время удлиняется до 2 ч (t=4®С). Постфиксация может продолжаться до 12 ч. При фиксации ткани в незабуференной ЧО рН за 48 ч падает с 6.2 до 4.4. Продолжительность воздействия ЧО влияет на структуру тканей. Очень короткая фиксация приводит к недофиксации, слишком продолжительная - к экстракции тканевых компонентов, особенно во время последующего обезвоживания [193].
Фиксацию цитологических отцечатков и мазков желательно проводить в парах ЧО. Однако в этом случае фиксируется только поверхностная зона объекта. Поэтому фиксация в парах ЧО применима главным образом для мелких объектов - вирусов, бактерий, одиночных клеток крови, культуры тканей, мелких нервов и др. На практике на стекло помещают каплю с объектами и прикрывают этим стеклом (объектом вниз) сосуд с раствором ЧО на 1-3 ч (рис. 1).
ЧО не рекомендуется использовать для перфузии, так как она вызывает резкий спазм кровеносных сосудов и тромбоз капилляров. Пары ЧО могут применяться для осмирования образцов после их лиофилизации. Процесс продолжается в течение 12 ч. Следует отметить, что объекты после этого становятся серыми. Но при добавлении воды немедленно приобретают черный цвет [105, 193] (см. Приложение, 1.7).

0x01 graphic

Рис. 1. Устройство для фиксации объектов в парах водного раствора ЧО. а - объект; б - фиксатор; в - предметное стекло с клетками (капли с объектами) (по: [9]).

1.3.1.1.2. Приготовление растворов

Чаще всего ЧО поставляется фирмами в виде запаянных в ампулы кристаллов, из которых потом готовят 2%-ный раствор ЧО. Сосуд для раствора ЧО должен быть сначала вымыт (например, азотной кислотой - для удаления органических примесей, а затем водой - для удаления следов кислоты). В абсолютно чистую банку из темного стекла наливают нужное количество нейтральной бидистиллированной воды. Тщательно моют стеклянную ампулу с кристаллами ЧО, затем делают на ней надрез (алмазом или напильником), снова споласкивают водой, помещают в сосуд с водой и там разбивают абсолютно чистой стеклянной палочкой. ЧО растворяется медленно - при комнатной температуре в течение 2-3 сут. Для ускорения растворения кристаллов ЧО рекомендуется пользоваться магнитной мешалкой, перемешивая раствор-металлической палочкой в стеклянной оболочке. Процесс можно ускорить с помощью быстрого нагревания на паровой бане или воздействия ультразвука [72, 105].
Обычно раствор ЧО хранят в темной герметично закрытой стеклянной посуде при комнатной температуре. Исходный раствор ЧО длительное время можно хранить в холодильнике. Раствор должен быть прозрачным и иметь слегка желтоватый цвет. Для его стабилизации с целью предохранения ЧО от самопроизвольного восстановления рекомендуется добавлять на 150 мл раствора небольшой кристаллик хромового ангидрида или несколько капель 1%-ного раствора бихромата калия, кроме того, фиксатор можно приготовить на 0.1%-ном растворе хромовой кислоты. В этом случае в стеклянном флаконе с хорошо притертой пробкой фиксатор сохраняется годами.
Пыль и воздействие света быстро портят раствор ЧО. Для ингибирования процесса восстановления ЧО в раствор можно добавить несколько кристаллов MgCh. Появление мути, осадков или изменение цвета с соломенно-желтого на коричневый, зеленый, бордовый или фиолетовый свидетельствуют о непригодности раствора для использования. Если базовый раствор становится фиолетовым (лиловый) или слегка коричневым из-за образования диоксидов Os, то он может быть регенерирован добавлением капли перекиси водорода [72, 105].
Пары осмия проникают наружу практически через любую крышку и вызывают потемнение внутренней поверхности холодильника, если там есть следы жиров. Поскольку ЧО очень летуча, то хранить ее лучше в отдельном холодильнике, либо помещать сосуд с раствором ЧО в больший сосуд с массивной резиновой крышкой или с крышкой, снабженной резиновым уплотнением (хранить бутылку с осмием в еще одной экранирующей бутылке). Лучше всего банку с раствором ЧО закрыть тефлоновой крышкой и запечатать парафильмом (после каждого открывания пробку следует протирать чистой фильтровальной бумагой). Через другие пластики пары ЧО легко проникают. Менее желательно использовать двойные бутыли с притертыми пробками, так как они позволяют ЧО испаряться, при этом концентрация ЧО в растворе снижается, что приводит к потере стандартизации результатов. В некоторых лабораториях 2%-ный раствор ЧО разливают по ампулам и хранят в замороженном состоянии. Использованный ЧО можно регенерировать (см. Приложение, 3.3) [11, 15, 16, 105].

1.3.1.2. Глютаральдегид (ГА)

1.3.1.2.1. Механизмы действия

В основе механизма действия ГА лежит стабилизация белковых молекул с образованием поперечных связей, что является особенно важным для сохранения их локализации в клетке. В то же время непрочность ряда связей, образуемых ГА, а также то, что фосфолипиды и ненасыщенные липиды не стабилизируются при этой фиксации, вызывает необходимость дополнительной фиксации в ЧО.
При использовании ГА протекает следующая химическая реакция: 2 протеина + ГА - протеин-ГА-протеин + 2Н₂О. ГА реагирует с аминогруппами белков, а не с гидроксильными группами. Тем самым ГА как бы сшивает растворимые белки цитозоля и одновременно фиксирует их, препятствуя их перераспределению. В некоторой степени ГА реагирует с липидами, карбогидратами, нуклеиновыми кислотами.
ГА практически не фиксирует ДНК прокариотов, так как они не содержат достаточного количества связанных белков, а имеющиеся быстро теряются в начальный момент фиксации. Поэтому во время дегидратации молекулы ДНК агрегируют случайным образом. После воздействия ГА ДНК становится более резистентной к ДНКазе, так как диальдегиды реагируют с аминогруппами цитозина и гуанина [193].
Поглощение ГА тканями продолжается 5-10 мин, поэтому продолжительность перфузионной фиксации должна составлять приблизительно 10 мин. Аэрация фиксатора улучшает связывание ГА тканями. После фиксации в ГА клетки в ряде случаев сохраняют осмотическую активность. Проникновение ГА в ткани делает их бледно-желтыми (образование оснований Шиффа) и твердыми. Скорость проникновения ГА в ткань низкая. Сжатие тканей вследствие фиксации ГА достигает 5-10 % [72, 193].
ГА вызывает разрушение сети актиновых микрофиламентов (МФ), зависимое от осмолярности буфера в фиксаторе, и инициирует появление гранулярной субстанции на образцах, которая отсутствует в криофиксированных клетках. В присутствии ГА движение органелл прекращается через 30-45 с, а везикуляция продолжается в течение 2.5 мин. ГА способствует слиянию микровезикул с клеточными мембранами. Если применяется очень низкая концентрация ГА, то появляется множество миелиновых фигур. Сходный артефакт вызывается очищенным ГА [23, 105, 178, 179].

1.3.1.2.2. Режим использования

Для иммерсионной фиксации удобно использовать ГА, имеющий, гриф: "для электронной микроскопии" и продающийся в стеклянных запаянных ампулах. Для перфузионной фиксации этот раствор слишком дорог - в большинстве случаев применяется ГА с грифом: "для биологических целей". Концентрация ГА может варьировать от 2 до 6 %. Изменение концентрации ГА в этих пределах не оказывает заметного воздействия на структуру интактной ткани, особенно в присутствии оптимального по осмолярности растворителя. Однако для рутинной ТЭМ концентрация не должна превышать 25 %. Продолжительность фиксации зависит от плотности образца. Средняя продолжительность фиксации ГА от 30 мин до 2-4 ч.
В некоторых случаях время фиксации может достигать 24 ч. Резко укороченные сроки фиксации (10-15 с) без дофиксации в ЧО с последующей заливкой в водорастворимые смолы используют только для проведения гистохимических реакций. При необходимости получения высоких разрешений не следует фиксировать ткань более 15-2 ч. Охлаждать фиксатор до t=4®С в большинстве случаев не требуется. Для животных клеток чаще всего рекомендуется 2 %-ный раствор ГА на 0.1 М какодилатном буфере, содержащем 100 ммоль/л сахарозы (рН 7.2). Надежная сохранность клеток достигается путем использования вначале 0.1-0.2 %-ного, а затем 1-3%-ного раствора ГА. При этом не происходит коагуляции плазменных протеинов и загрязнения поверхности клеток. Оптимальная фиксация может быть также достигнута в 1.2-1.5%-ном растворе ГА на 0.1 М фосфатном буфере (ФБ), рН 7.4, содержащем 2.5 % поливинилпирролидона. Гарантированная сохранность тканей во всех отделах объекта достигается при использовании ГА только в том случае, если размер кусочка не превышает 1 мм3 [178, 179, 193]. Предпочтительными для разведения ГА являются фосфатный и какодилатный буферные растворы. Высокий рН (8.0) растворов ГА более эффективен при фиксации растений, однако в этом случае происходит быстрая полимеризация ГА. Иногда фиксацию начинают при рН 7.0, а затем рН поднимают до 8.0 путем постепенного добавления 0.1 М NaOH. Фиксация тканей в ГА при увеличении температуры до 45®С также позволяет вполне удовлетворительно сохранять ультраструктуру [178, 192].
Добавление в 3 %-ный раствор ГА небольшого количества аминов существенно улучшает сохранность актиновых филаментов. К примеру, лизин эффективен в концентрации 20-25 ммоль/л, соотношение концентраций амина и ГА равно 1 : 12 [104]. Продукты реакции ГА с первичными аминами являются активными компонентами фиксатора [178].

1.3.1.2.3. Состав коммерческих растворов ГА

ГА поступает в продажу в виде 25-и 50 %-ных бесцветных водных растворов. Чистый раствор содержит ГА в мономерной форме, которая имеет максимум поглощения в области 235 нм и является действующим началом фиксатора. Обычно его хранят в стеклянной посуде с плотной крышкой или в запаянных ампулах под азотом при t=4®С или t=-20®С. Обычно коммерческий ГА имеет два пика поглощения в ультрафиолетовой области спектра -235 нм (мономер) и 280 нм (димер). Оптимальный уровень соотношения между пиками от Г: 1 до 1 : 2. Коммерческий раствор ГА с рН 4.0 вполне пригоден для использования. Если во время хранения рН раствора понижается до 3.4, то его использовать нежелательно. Падение рН связано с образованием полимеров, которые резко снижают качество фиксатора и часто делают его совсем непригодным. Перед употреблением рекомендуется проверить на спектрофотометре наличие полимеров и, если требуется, очистить раствор. В настоящее время коммерческие растворы ГА содержат стабилизаторы, предотвращающие образование полимеров. Часто при употреблении смесей из такого ГА фиксатор мутнеет и его необходимо профильтровать перед употреблением. Однако отмечено, что высокое содержание мономерного ГА не дает фиксатору какого-либо преимущества в случае рутинной ТЭМ. В то же время, мономерный ГА лучше сохраняет антигенные свойства тканей [178, 193].
Растворы ГА при комнатной температуре образуют сложные смеси. Такие смеси состоят примерно из 4 % альдегида, 16 % моногидрата, 9 % дигидрата и 70 % полуацеталя. В разбавленном растворе полимеризации ГА практически не происходит. Среди примесей коммерческого ГА встречаются глютаровая кислота, акролеин, глютарадозин, этанол, метанол, различные полимеры и продукты фотохимической деградации.
Мономерный ГА может быть отделен от других компонентов с помощью вакуумной дистилляции, фильтрации через активированный уголь или через ионообменные смолы. Фильтрация через уголь - наиболее простой, но малоэффективный способ (см. Приложение, 3.2). При дистилляции под атмосферным давлением дистиллят собирают при t=100®С порциями по 50 мл, в которых определяют рН. Если рН ниже 3.4, то порцию выбрасывают. Дистилляцию под вакуумом проводят в колбах при нагревании до t=65®С. После снятия вакуума дистиллят (вязкая прозрачная жидкость) разводят таким же количеством свежепрокипяченной деминерализованной воды путем медленного добавления последней (t=75®С) к дистилляту на магнитной мешалке под азотом.
Осмолярность 2%-ного коммерческого раствора ГА из различных источников варьирует от 190 до 280 мОсм. После очистки коммерческого ГА с помощью активированного угля осмолярность растворов ГА на 0.1 М ФБ (рН 7.2-7.3), оцененная с помощью осмометра, будет следующей: 1.2%-ный ГА - 370 мОсм, 2.3%-ный - 490 мОсм, 4.0%-ный - 685 мОсм.
ГА должен храниться (особенно после очистки) в закрытой посуде, так как быстро окисляется кислородом до глютаровой кислоты. Длительно хранившийся ГА рекомендуется очищать. ГА при хранении вне ампулы будет полимеризоваться, и при его добавлении к раствору образуется белесоватая муть. Такой раствор использовать нельзя [178, 192].

1.3.1.3. Формальдегид (ФА)

При взаимодействии ФА с тканями наиболее реактивными местами являются первичные амины (например, лизин) и тирлы (например, цистеин), а после сшивания этих групп начинается реакция с менее активными группировками, такими как первичные амиды (глютамин, аспарагин), гуанидиновые группы (аргинин) и тирозиновые карболовые кольца. ФА плохо реагирует с ДНК, чуть лучше - с РНК. При растворении ФА в воде быстро образуется метиленгликоль.
Равновесие этой реакции сдвинуто в сторону гликоля, и соответственно образование ФА занимает много времени (часы). Когда ткань погружена в раствор ФА, последний в нее быстро проникает (метиленгликоль), но плохо фиксирует (карбонилформальдегид) -это своеобразный парадокс ФА. При фиксации водным раствором ФА полное равновесие реакций образования химических связей в объекте достигается за 24 ч при t=20®С и за 16 ч при t=37®С [148].
Раствор ФА вызывает определенные альтерации плазмалеммы и митохондрий, хотя не ясно, связано ли это с присутствием метиленгликоля, или нет. Под воздействием ФА могут формироваться блебсы на поверхности клеток и возникать везикуляция клеточной мембраны. Для улучшения фиксации можно рекомендовать вначале перфузировать препарат ФА при рН 65 (достигается быстрота и гомогенность распределения вещества), а затем увеличивать рН до 11, что приводит к окончательной стабилизации препарата [96, 148, 178, 193].
Сам ФА при стандартной концентрации 4 % (1.33 М без буфера) имеет осмолярность несколько меньшую (1300 мОсм), чем расчетная (1330 мОсм). Соответственно добавление буфера делает фиксатор чрезмерно гипертоничным. Зачастую осмолярность ФА (в действительности метиленгликоля) при вычислении осмолярности фиксатора в расчет не принимается.
Формальдегид (ФА) поступает в продажу в виде параформальдегида (порошок белого цвета). Для ТЭМ желательно использовать химически чистый параформальдегид. ФА должен быть свободен от метанола и муравьиной кислоты. Перед употреблением обычно готовят свежий раствор ФА на бидистиллированной воде [193] (см. Приложение, 3.4 и 3.6).

1.3.1.4. Акролеин

Коммерческий акролеин содержит 0.1 % гидрохинона (ингибитор оксидации). Если раствор мутный или рН его меньше 6.4, то необходима дистилляция. В растворы акролеина нельзя добавлять сахарозу. После акролеиновой фиксации обязательна постфиксация в ЧО. Часто акролеин используют в комбинации с другими альдегидами. Предложено множество различных прописей смеси акролеина с другими фиксаторами (см. Приложение, 3.9.3-3.95). Из-за относительно высокой скорости проникновения акролеина его растворы обеспечивают удовлетворительную фиксацию сравнительно крупных образцов [178, 192].

1.3.2. Выбор фиксаторов

Выбор в большой степени зависит от цели исследования (см. Приложение, 3.5-3.10). Так, обнаружено, что при фиксации в ГА экстрагируется 37 %, в ЧО 75 %, а в ФА 96 % свободных аминокислот из тканей [192]. Важным показателем является скорость проникновения фиксатора в ткани. За 4 ч 5%-ный ФА удовлетворительно фиксирует ткань на глубину 25 мм, 3%-ный ГА - на 0.5 мм, 2%-ный ЧО - на 0.8 мм. Скорость проникновения фиксатора можно увеличить путем добавления диметилсульфоксида (ДМСО) до концентрации 2 %. Добавление ДМСО увеличивает проницаемость тканей, однако он проникает в ткань быстрее фиксирующего вещества и губительно действует на живую ткань, повреждая ее. Поэтому применение ДМСО для рутинной ЭМ не всегда целесообразно. Для качественной фиксации всех компонентов тканей лучше всего использовать смеси различных фиксирующих веществ. Для рутинных ЭМ-исследований рекомендуется забуференная смесь, содержащая 4 % ФА и 1 % ГА (можно хранить в течение 3 мес). Популярен фиксатор Карновского [193] (см. Приложение, 3.9.1 и 3.9.2).
Ненасыщенные липиды и фосфолипиды не стабилизируются при фиксации альдегидами. Если не проводить постфиксации в ЧО, то эти вещества экстрагируются при обезвоживании. Однако альдегиды фиксируют белки эффективнее, чем ЧО. Качество фиксации в значительной степени зависит от чистоты применяемых альдегидов. ФА используют, когда необходимо сохранить активность ферментов и антигенные свойства исследуемых тканей. Еще чаще в этих случаях используют смесь ГА и ФА. Добавление акролеина к ФА уменьшает экстракцию протеинов из тканей. Хорошая фиксация эмбриональной ткани достигается в смеси, которая содержит 3 % ГА, 2 % ФА, 1 % акролеина, 25 % диметилсульфоксида. Смесь 2 % ФА и 2 % ГА на буфере (200 мОсм) обеспечивает удовлетворительную фиксацию тканей печени на глубину 2.0; 2.5 и 5.0 мм через 2, 4 и 24 ч соответственно [148, 178, 193]. Хотя при смешивании ГА и ЧО реагируют между собой с образованием осмиевой черни и глютаминовой кислоты, однако такие смеси используются на практике. Реакция между ЧО и ГА имеет лаг-период продолжительностью 30 мин. Если за это время успеть провести фиксацию, то осадок не образуется и получаются неплохие результаты. При одновременной фиксации в ГА и ЧО лучше выявляется структура мембран и меньше экстрагируются нуклеиновые кислоты. Добавление 0.05 % ЧО к ГА улучшает фиксацию внутриклеточных структур, так как делает мембраны более проницаемыми для ГА.
Для визуализации эндоплазматического ретикулюма применяется специальный режим фиксации: фиксатор должен содержать хелатирующее вещество и дивалентные катионы - кальций или никель [95].
При добавлении к фиксаторам таниновой кислоты (ТК) улучшается сохранность ряда структурных компонентов клеток, например мембран, микротрубочек и микрофиламентов. ТК действует как мордант, усиливающий окрашивание структур тяжелыми металлами - ЧО и цитратом свинца (ЦС). ТК легко проникает в поврежденные клетки, увеличивая их плотность, что позволяет отличать такие клетки от интактных, мало растворима в ФБ, выпадает в осадок при рН выше 7.2-7.4. Лучше использовать ТК с низкой молекулярной массой (ММ) и предпочтительно после действия ЧО [323, 324] (см. Приложение, 3.10.5). Следует помнить, что промывание объектов только водой не удаляет избытка ТК, поэтому требуется обработка сульфатом натрия.
Для постфиксации иногда используют смесь ЧО и феррициа-нида калия, при этом обеспечивается хорошее выявление не только мембран, но и хроматина, однако рибосомы и некоторые фибриллярные структуры не окрашиваются. Для их визуализации необходимо контрастировать объекты уранилацетатом (УА) [12, 178] (см. Приложение, 3.10.1).

1.3.3. Буферные растворы

Важнейшее значение для качественной фиксации имеет состав буферных растворов, используемых для приготовления фиксаторов (см. Приложение, 2.2). К примеру, при фиксации в альдегидах и дофиксации в ЧО растворы лучше приготавливать на одном и том же буферном растворе с одинаковыми значениями рН и осмо-лярности, а при ЭМ-исследовании клеток культуры фиксатор желательно готовить на культуральной среде. Составляющие буфера для фиксатора рекомендуется готовить ex tempore. Сахарозу (3-6 %) и глюкозу (4 %) следует растворять непосредственно перед употреблением [178, 193].
Буферные растворы фиксаторов должны отвечать следующим требованиям: 1) обеспечивать сохранение рН в пределах от 6.0 до 8.0; 2) плохо проникать через клеточные мембраны; 3) иметь низкую ионную силу; 4) характеризоваться отсутствием субстанций, реагирующих с компонентами фиксатора; 5) величина диссоциации не должна зависеть от концентрации; 6) устойчивость к оксидации, стабильность; 7) дешевизна и легкость приготовления. Если во время фиксации живой ткани не используются буферные растворы, то рН фиксирующего раствора быстро падает. Применение буферных систем, которые поддерживают рН на уровне физиологических значений (7.2-7.4 для большинства тканей млекопитающих), существенно снижает повреждающее действие фиксации. Очень удобно определять рН фиксирующих растворов с помощью добавления к ним нейтрального красного, который имеет малиновый цвет при рН от 7.1 до 7.6 [193] (см. Приложение, 1.1).
В ЭМ чаще всего используются фосфатные буферы (ФБ), а также S-коллидиновый, трис-малеатный и какодилатный буферные растворы. ФБ принято считать "физиологическими буферами", поскольку их составляющие содержатся в живых организмах. Они стабильно поддерживают рН на уровне 7.4 и обладают высокой буферной емкостью, но плохо держит рН выше 7.5. Недостатком ФБ является и то, что при их использовании иногда (особенно при цитохимических методиках) образуются осадки. Кроме того, ФБ непригодны для приготовления растворов УА. ФБ в процессе хранения часто зарастает микроорганизмами и грибами. Поэтому после приготовления ФБ желательно отфильтровать, прокипятить и хранить при t=4®С. Такой буфер сохраняет рН в течение нескольких недель. Смесь КН₂РО₄ + Na₂HPО₄ более устойчива, чем смесь одних натриевых солей [178].
Какодилатный буфер (КБ) пригоден как для осмиевых, так и для альдегидных фиксаторов. КБ легко готовить, он стабилен при хранении, но непригоден для приготовления растворов УА. КБ эффективен в интервале значений рН от 6.4 до 7.4, широко используется в ЭМ-гистохимии, поскольку удаляет из тканей ионы фосфата, не зарастает грибами, так как содержит мышьяк, оказывает сильное токсическое влияние (осторожно!) на живые клетки [70, 178].
Коллидиновый буфер (используют только очищенный S-коллидин) позволяет не применять осмотические добавки, стабилен даже при комнатной температуре, не меняет рН в течение года, способствует проникновению фиксатора в ткани и не зарастает бактериями и грибами в течение длительного времени. Однако он токсичен и имеет неприятный запах. Коллидиновый буфер эффективен в интервале рН от 6 до 8. Он способствует экстрагированию фосфолипидов и протеинов. Смесь ФА с коллидином может повреждать мембраны [178, 193].
Веронал-ацетатный буфер широко применялся ранее. Он оказался непригодным для альдегидных фиксаторов, поскольку реакция, происходящая между фиксатором и буфером, лишает последний буферных свойств. Как веронал-ацетатный буфер, так и Трис-буфер вступают в химическую реакцию с альдегидами. Веронал-ацетатный буфер плохо растворим в воде, и поэтому концентрированные растворы приготовить сложно. Необходимы осмотические добавки. Использование веронал-ацетатного буфера ухудшает условия окрашивания полутонких срезов (ПС). Веронал-ацетатный буфер эффективен в интервале рН от 4.2 до 5.2 [178].
Буферы на базе сложных органических веществ, называемых Трис, ГЕПЕС и ПИПЕС, применяют в ЭМ реже, в основном в тех случаях, когда требуется длительная фиксация материала. Органические буферы могут реагировать с ЧО. Они несколько уменьшают экстракцию компонентов клеток, делая их более электронно-плотными. ПИПЕС используют, если важно сохранить липиды мембран. Трис-буфер плохо удерживает рН ниже 7.5 и вступает в реакцию с альдегидами. При повышении температуры его рН, как правило, снижается, однако повышение концентрации буфера увеличивает буферную емкость системы и предупреждает падение рН [70, 178, 193].

1.3.4. Осмотическое давление

Важное значение для сохранности тканей и клеток имеет осмолярность фиксатора. При неправильном подборе осмолярности появляется множество артефактов: клеточные органеллы сморщиваются (если раствор гипертонический) или набухают (если раствор гипотонический) [231].
Концентрация ионов в растворе равна молярной концентрации растворенного вещества, умноженной на число частиц, образующихся при диссоциации каждой молекулы, и пропорциональна осмотическому давлению (см. Приложение, 1.2). Однако эта. зависимость не является линейной. В растворе молекулы и ионы взаимодействуют друг с другом. С другой стороны, осмотическое давление раствора, содержащего белки и соли, сильно отличается от осмотических свойств раствора, содержащего только электролиты. Осмотическое давление плазмы крови составляет приблизительно 0.3 Осм. Это давление является изотоническим (т. е. в нем клетки не меняют свой объем). Таким же действием обладает 0.16 М (0.9 %-ный) раствор NaCl. Эффективное осмотическое давление (ЭОД), например для ГА, можно вычислить по формуле: ЭОД - (мОсм ГА : 2) + мОсм растворителя. Общая осмолярность фиксатора включает осмолярность буфера и фиксирующего агента. Чаще всего наилучшие результаты дает слегка гиперосмолярный фиксатор. Для большинства тканей осмолярность буферных растворов может варьировать от 0.05 до 0.2 мОсм. Однако классический фиксатор Карновского имеет общую осмолярность 2010 мОсм. [70, 193].
Наиболее чувствительными органоидами к осмолярности являются митохондрии: они "чувствуют" изменения в 20 мОсм. В нативных условиях клеточная мембрана обладает свойством избирательной проницаемости для различных ионов. В процессе фиксации осмолярность фиксатора в тканях меняется: фиксатор может разводиться внутриклеточной жидкостью. В некоторых тканях, например в почке, имеются клетки с разной осмолярностыо.
Осмолярность не зависит от температуры. Если растворы не диссоциируют, то молярность равна осмолярности. Из-за того что диссоциирующие на ионы вещества могут взаимодействовать, их осмолярность меньше, чем расчетная. Следовательно, растворы одинаковой молярности могут иметь разную осмолярность. Экспериментально показано, что оптимум осмолярности фиксирующих растворов лежит в интервале 285-540 мОсм. При увеличении или снижении осмолярности вне этого интервала в клетках обнаруживаются повреждения митохондрий и гладкой эндоплазматической сети [180]. Нежелательно, чтобы общая осмолярность фиксатора превышала 500 мОсм, а растворителя 300 мОсм. Для лучшей сохранности ультраструктур к фиксаторам, особенно содержащим ФА и ЧО, рекомендуется добавлять сахарозу или глюкозу. 05 М сахароза имеет осмолярность 670 мОсм. К этим цифрам следует добавить величину осмолярности среды, в которой растворен фиксатор. Поливинилпирролидон и декстран, добавляемые в фиксатор, предупреждают отек клеток [23, 178].
Добавление к фиксатору NaCl ухудшает качество фиксации, так как в раствор вносятся свободно перемещающиеся ионы, несущие электрический заряд. Добавление сульфата аммония и КН2РО4 к фиксатору стабилизирует нативную конформацию протеинов. При добавлении к фиксатору CaCh (например, 10 ммоль/л) наблюдается: 1) уменьшение набухания клеточных компонентов; 2) улучшение сохранности клеточной формы; 3) уменьшение экстракции клеточного материала; 4) стабилизация мембран. В то же время, поскольку CaCh стимулирует секрецию и сокращение гладкомышечных клеток, его заменяют на MgCb. Кроме того, MgCb не вызывает преципитации протеинов. Сахароза и поливинилпирролидон ингибируют активность некоторых ферментов [178, 193].
Лучше всего использовать растворитель с осмолярностью 295-310 мОсм/л. В случае использования ГА наилучшие результаты получены при осмолярности фиксатора около 300 мОсм. Изменения концентрации ГА от 2 до 5 % не оказывают заметного воздействия на структуру интактной ткани, особенно в присутствии оптимального по осмолярности растворителя. Считается, что молекулы самих фиксаторов не оказывают существенного влияния на осмолярность фиксирующих тканей. Поэтому варьируют составом буферных растворов. Однако это справедливо в основном для ГА, который быстро связывается с реакционноспособными группировками в тканях. ФА не обладает такой афинностью как ГА, и может на начальных этапах фиксации вносить вклад в осмолярность фиксатора.
Точно сказать, какое влияние на клетки и ткани оказывают различные компоненты фиксатора, невозможно. Поэтому чаще всего осмолярность подбирается опытным путем. Когда для фиксации используют ЧО, в ткани сначала проникает среда, в которой растворено фиксирующее вещество, а затем - более тяжелые молекулы ЧО. Если применяют метод двойной фиксации, например фиксируют сначала в ГА, а затем осмием, то целесообразно использовать один и тот же буфер для обоих фиксаторов. При оптимальной осмолярности буферного раствора фиксатора повышение или понижение концентрации альдегида и какодилатного буфера на 50 % мало влияет на сохранность структуры клетки [23].

1.3.4.1. Промывание

Спорным является вопрос о том, необходимо ли отмывать первый фиксатор перед постфиксацией в ЧО. Ряд авторитетных исследователей считают, что для промывания лучше использовать умеренно гипертонические растворы. Другие вообще этому вопросу не придают большого значения, так как полагают,, что после фиксации вряд ли важно соблюдать изотоничность растворов.
Тем не менее в большинстве случаев после префиксации ткани в альдегиде ее промывают в буфере, осмолярность которого должна . соответствовать 350 мОсм. Это снижает осмотический шок между гипертоническим ГА и изотонической ЧО [65, 105, 178, 193]. Для сохранения изотоничности следует применять сахарозу. В качестве промывающего раствора лучше всего использовать тот же буферный раствор, что и для приготовления фиксатора. Промывание объектов рекомендуется проводить не менее чем в трех сменах раствора. Неотмытый фиксатор создает мелкий зернистый фон на ЭМ-изображениях. Промывание в течение ночи полностью удаляет непрореагировавший ГА [23, 28, 193].

1.3.5. Способы химической фиксации

1.3.5.1. Перфузионная фиксация

Преимуществами перфузионной фиксации являются, во-первых, быстрая и однородная доставка фиксатора к тканевым элементам (при этом меньше влияют диффузионные градиенты и последствия ишемии), во-вторых, сохранение естественных взаимоотношений в ткани, что снимает проблемы дисторсий, вызванных сосудистым коллапсом. Она незаменима при СЭМ нативных препаратов. Однако перфузионная фиксация имеет следующие ограничения: 1) трудности при ее осуществлении на человеческом материале; 2) невозможность применения на бессосудистых тканях; 3) ограниченность использования на биопсийном материале; 4) необходимость адекватной анестезии или анальгезии (между тем, до сих пор не совсем понятно влияние анестетиков на субмикроскопическую организацию тканей); 5) трудоемкость и необходимость соответствующего оборудования; 6) большая опасность для исследователя (лучше всего делать перфузию под вытяжным шкафом); 7) возможность изменения объема объектов, что связано с онкотическими воздействиями; 8) отек, вызванный фильтрацией фиксатора в ткань; 9) неоднородность перфузии. К недостаткам перфузии следует отнести также большой расход реактивов [23, 178, 192].

1.3.5.1.1. Отмывание

Необходимость удаления крови из сосудистого русла обусловлена тем, что белки и форменные элементы крови при фиксации осаждаются на поверхности эндотелия и затрудняют изучение объекта, особенно в СЭМ. В большинстве исследований для отмывания крови применяются сбалансированные солевые растворы (Хэнкса, Эрла, Рингера, среда 199, ФБФР и т.д.) с добавлением гепарина (см. Приложение, 2.1). Гепарин используется в дозе 05-1.0 мл на 1 кг массы тела. Гепарин уменьшает число кратеров и пузырей на поверхности эндотелия. Однако обнаружен и Противоположный эффект. Одним из способов исключения прямого контакта гепарина при его высоких концентрациях с эндотелиоцитами является внутримышечное введение до начала эксперимента [23].
Дискуссионным остается также вопрос о необходимости включения в промывающие растворы онкотических добавок: альбумина, декстрана, поливинилпирролидона и т.п. Эти вещества в ряде случаев вызывают гистаминоподобный эффект и могут изменять заряд на поверхности эндотелия. Одна из причин противоречивости данных, касающихся микрорельефа эндотелия, кроется в отсутствии стандартизации всех используемых промывающих растворов. Наиболее подходящими растворами для отмывания крови являются среда 199, растворы Хэнкса и Эрла (рН 7.2-7.5). Во время промывания перфузионное давление должно поддерживаться на уровне среднего артериального. Длительность процедуры не должна превышать 1-1.5 мин, если это время оказывается недостаточным, то необходимо к промывочной жидкости добавить 1-2 % поливинилпирролидона или альбумина и раствор подвергнуть оксигенации. Перфузия сосудов оксигенированным сбалансированным солевым раствором, содержащим метаболиты и нейтральные онкотические добавки (например, сыворотки), в течение 5-10 и даже 60 мин не вызывает структурных повреждений эндотелиоцитов [23, 178, 193].
Не менее важен и вопрос о введении в промывающий раствор спазмолитиков. Для предупреждения спазма сосудов применяется новокаин. Хорошим релаксантом является MgCb. В качестве вазодилятатора можно использовать нитрит натрия, который добавляют в промывочную жидкость (0.5 мл 1%-ного раствора на 200 г массы животного). В этом случае возможно блокирование функции артериол. Наиболее подходящим спазмолитиком является ксилокаин. Для определения степени проникновения промывающего раствора и фиксатора в ткани к ним можно добавлять каплю 1%-ного раствора трипанового синего.
Материал, маскирующий микрорельеф изучаемой поверхности в СЭМ, можно также удалять тонким пинцетом или обработкой свежей либо фиксированной ткани тестикулярной гиалурони-дазой или коллагеназой I типа. Для очистки поверхности объектов от слизи и других загрязняющих структур можно использовать ультразвук или струю жидкости. После высушивания слизь можно сдуть чистым сухим инертным газом. Слизь обычно удаляют на стадии препарирования объектов в 80%-ном этаноле [23, 178].

1.3.5.1.2. Введение фиксатора

После удаления крови сосуды перфузируют фиксирующим раствором. В ряде случаев можно не удалять кровь полностью, а сразу начинать перфузию фиксаторами. Однако при этом поверхность эндотелия иногда покрывается прилипшими клетками крови. Если перфузионная фиксация проводится без отмывания крови, то в первые 10-15 с перфузионное давление должно быть повышено. Этим же способом можно предупредить коллапс сосудов и полнее удалить из них кровь. Особенностью препарирования органного трупного материала в связи с особой чувствительностью переживающих тканей к промыванию является использование для отмывания сосудов от крови разведенного фиксирующего раствора [3].
Чтобы сохранить детали строения поверхности эндотелия, очень важно начать перфузию прижизненно, постоянно контролируя давление внутри сосуда, особенно в момент начала введения фиксатора. Для предупреждения развивающегося в это время опистотонуса животным за несколько секунд до фиксации вводят суксаметоний или другой миорелаксант. Иногда промывают сосуды раствором, содержащим сильно разведенный фиксатор. Для большинства целей достаточно 5-минутной перфузии фиксатором, после чего кусочки органа могут быть вырезаны из ткани и помещены в свежую порцию ГА [23, 178].
Величину перфузионного давления лучше поддерживать на уровне среднеартериального или систолического давления, свойственного данному животному. Если фиксация осуществляется под давлением, равным диастолическому, то продольные складки сосудов становятся более глубокими, а использование перфузионного давления ниже диастолического приводит к появлению веретенообразных эндотелиоцитов. Локальное внутрисосудистое давление должно быть равно локальному систолическому артериальному давлению. Однако чрезмерно длительная перфузионная фиксация под физиологическим давлением ведет к растяжению просвета сосудов. В течение 2-часовой перфузии раствором ГА происходит увеличение диаметра артерий и других сосудов. Колебания давления в сторону повышения могут также существенно повреждать поверхность эндотелия.
Необходимо, чтобы гидродинамические параметры перфузии тщательно контролировались перед введением фиксатора и во время фиксации, а также чтобы сосудистые реакции, вызываемые действием фиксатора, были известны. Для прикидочной оценки необходимого количества перфузионного раствора нужно исходить из следующего эмпирического правила: количество перфузата должно составить 15 % от массы тела; 5 % от массы головы и 1-2 % от массы мозга. Перфузат желательно оксигенировать, но следует избегать попадания пузырьков воздуха в систему. Сосуды с растворами должны быть достаточно емкими, чтобы их не надо было заполнять во время работы. В системе необходим фильтр.
Лучшие результаты дает ретроградное введение полиэтиленовой канюли в общую подвздошную артерию. К сожалению, такой подход применим только для мелких лабораторных животных. Даже в случае кроликов и кошек, когда требуется большой расход фиксатора, этот метод оказывается малопригодным. Одним из выходов из данного положения может быть перевязывание всех ветвей аорты, не используемых в данном эксперименте, или пережатие крупных коллатеральных сосудов исследуемой области [23, 177, 178].
При работе с мелкими лабораторными животными удобно использовать перфузию через аорту. Для этого наркотизированному животному двумя окологрудинными разрезами вскрывают грудную клетку (в это время спонтанное дыхание прекращается). На основание образовавшегося лоскута передней грудной стенки накладывают зажим Кохера и над зажимом лоскут иссекают. Вскрывают перикард.
Под восходящую аорту подводят лигатуру. Вскрывают левый желудочек и через полость вводят канюлю в аорту. Закрепляют канюлю лигатурой. Пускают фиксирующий раствор. Вскрывают правое предсердие для оттока раствора. Брюшная аорта для экономии раствора может быть пережата. Время с момента прекращения спонтанного дыхания до момента введения фиксирующего раствора в аорту не должно превышать 15 мин. Рекомендуется использование искусственного дыхания и гипотермии. При экспериментах на более крупных животных целесообразно применять местную перфузию, вводя фиксатор в сонные или позвоночные артерии (для мозга). Давление фиксирующего раствора при выходе из канюли не должно превышать общего артериального давления животного более чем на 10-15 %. После перфузии рекомендуется дофиксировать материал погружением в тот же фиксирующий раствор [23, 178, 193].
Канюлировать левый желудочек сердца можно особыми канюлями с ободком на конце, которые после прокола захватываются сокращающимся миокардом и надежно крепятся в стенке сердца. Однако при исследовании крупных кровеносных сосудов канюлирование сердца опасно тем, что в момент введения канюли происходит падение давления в сосудистой системе. Кроме того, вскрытие грудной полости приводит к пневмотораксу и гипоксемии. По этим же причинам неадекватна перфузия, начатая после умерщвления животного. Для фиксации печени лучше всего использовать перфузию через воротную вену под низким давлением. Для сосудистой перфузии желательно использовать альдегиды в более низких концентрациях (1 % ФА + 1 % ГА). Многое зависит от того, какой исследуется орган. Так, для предупреждения артефактов при перфузионной фиксации центральной нервной системы рекомендуется вначале использовать концентрированный раствор ГА (до 19 %), а через несколько десятков секунд - раствор обычной концентрации [178, 371]. Наиболее оптимальная фиксация клубочков и проксимальных канальцев в почках достигается с помощью перфузионной префиксации 3%-ным раствором ФА на ФБ (осмолярность 1100 мОсм, рН 7.1), дофиксации в этом же растворе и постфиксации в 1%-ном растворе ЧО на ФБ [315].
Таким образом, принципиально важными моментами начальных этапов перфузионной фиксации являются ограничение времени отмывания сосуда, использование перфузионной фиксации in situ при условии поддержания перфузионного давления на уровне среднеартериального, а также фиксирующих растворов с рН в пределах 7.1-7.6 и осмотичностью 300-600 мОсм. Для исследования (после перфузионной фиксации) в СЭМ лучше брать крупные кусочки.
Это позволяет точнее локализовать повреждения и сравнивать их с окружающей нормальной тканью. Введение в перфузат онкотических добавок предупреждает расширение межклеточных пространств. Так, при фиксации тканей мозга необходимо добавление поливинилпирролидона [23].
При проведении экспериментальных работ, в которых требуются исследования органа с помощью других методов, можно рекомендовать перфузионную фиксацию части (сегмента) органа. Для этого игла соответствующего диаметра вставляется в крупный кровеносный сосуд или тщательно прижимается к его входу, отмывание (до 30 с) и перфузию (3-5 мин) сосудистого русла проводят под давлением 20-30 мм рт.ст. Если у извлекаемого органа сохраняется питающая его артерия, то последняя канюлируется, и орган отмывается от крови и перфузируется фиксатором. Перфузионное давление для органов, имеющих единое магистральное кровоснабжение, не должно превышать 80 мм рт.ст., в других случаях оно должно быть ниже 60 мм рт.ст.

1.3.5.2. Иммерсионная фиксация

В большинстве руководств по ЭМ для иммерсионной фиксации рекомендуется новым лезвием бритвы нарезать кусочки толщиной менее 1 мм и погрузить их в ГА. Резать надо на парафине, тефлоне или на вощеной бумаге, реже используется корковая пластинка. Ткань следует быстро погрузить в фиксатор. Ни в коем случае нельзя дать образцу подсохнуть. Соотношение объемов образца и фиксатора должно быть 1 : 10. Фиксацию можно проводить при комнатной температуре. Для лучшего проникновения фиксатора желательно фиксирующий раствор с объектом помешивать. Можно начинать капать фиксатор на образец до его вырезания из организма.

Мы рекомендуем после обнажения органа нанести на него несколько капель фиксатора и провести точно ориентированный разрез так, чтобы поверхность среза сразу стала хорошо доступной для фиксатора. Ткань должна быть разрезана свежим лезвием бритвы одним движением. Разрезанный таким образом образец иссекается и помещается в пузырек с фиксатором. Затем с помощью лезвия бритвы осторожно срезается тонкая (толщиной не более 1 мм) пластинка ткани. Можно использовать специальные приспособления с ограничителями. Пластинка помещается в свежую порцию фиксатора и подвергается дальнейшим манипуляциям. При проведении гистохимических и иммуногистохимических исследований применяется изготовление срезов в вибратоме [178, 193].

1.3.5.3. Инъекция

Метод инъекции сохраняет внутреннюю структуру органа лучше, чем метод накалывания. Для этого обычно охлажденный фиксатор вводится в ткань с помощью шприца или микропипетки [164].

1.4. МИКРОВОЛНОВОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ (МВИ)

В последние годы в ЭМ для ускорения проникновения фиксатора в клетки и ткани применяют МВИ с диапазоном частот от 300 МГц до 300 ГГц. МВИ используется для стабилизации ткани, ускорения процесса препарирования, быстрой остановки метаболических процессов. Образцы после микроволнового облучения некоторое время могут храниться при t= 4®С, затем для ТЭМ они должны постфиксироваться в ЧО. МВИ применяется не только при фиксации, но и при обезвоживании, окраске и иммуномечении [58, 101, 222, 233, 276].

1.4.1. Механизмы действия МВИ

МВИ увеличивает скорости диффузии растворов и химических реакций. Изменение внутренней температуры реагентов является ключевым механизмом этого процесса. Использование МВИ во время фиксации альдегидами приводит к тому, что, во-первых, альдегиды из полимеров переходят в мономеры, во-вторых, увеличивается скорость их проникновения в ткани, в-третьих, ускоряются химические реакции фиксирующих растворов с компонентами тканей. Механизм действия МВИ во время фиксации расшифрован не полностью. МВИ нагревает ткань и окружающую жидкость, что приводит к увеличению текучести липидов в мембранах, способствует ориентации полярных групп в сторону водной фазы и тем самым облегчает их реакцию с 40. МВИ увеличивает скорость диффузии ЧО за счет осцилляции (2450 млн в секунду) молекул, которые связывают Os, а это приводит к ускорению перемещения ЧО в тканях [241, 242].
Сочетание МВИ с применением разбавленных альдегидных фиксаторов позволяет сохранять как субмикроскопическую организацию, так и антигенные свойства тканей. Применение МВИ позволило показать, что наличие темных и светлых клеток в тканях является артефактом рутинной фиксации [222, 233]. Фиксирующий эффект МВИ в ряде случаев сопоставим с результатами, получаемыми с помощью сверхбыстрого замораживания. Так, 1 изучение бактерий показало, что после параллельного воздействия химических фиксаторов и МВИ сохраняемость ультраструктуры такая же, как и при препарировании методом сверхбыстрого замораживания-травления [262]. МВИ дает хорошие результаты в гистоавторадиографии и рентгеновском микроанализе (РМА). В отношении сохранения ферментативной активности полученные результаты неоднозначны: некоторые ферменты резистентны к действию микроволн, например щелочная фосфатаза, другие быстро повреждаются (кислая фосфатаза, глюкоза-6-фосфатаза). С помощью МВИ можно фиксировать образцы размером до 1 см. Однако для лучшей фиксации тканевые блоки после воздействия МВИ должны инкубироваться в фиксаторе 10-60 мин для целей иммуно-ЭМ или ЭМ-гистохимии и 30-180 мин для обычного ультраструктурного анализа [258, 274].
При воздействии МВИ физическое состояние биологических мембран изменяется, об этом свидетельствует диффузия ферментов из лизосом. В процессе фиксации с использованием МВИ антигены на поверхности клеток, выстилающих крупные полости, в ряде случаев повреждаются. Кроме того, обнаруживается усиленная вакуолизация цитоплазмы, сопровождаемая вымыванием из матрикса гликогена. Для предупреждения этого явления к фиксатору добавляют глюкозу или полиэтиленгликоль, что ведет к увеличению осмолярности фиксатора и, по-видимому, уменьшает вибрацию молекул воды в тканях. МВИ позволяет также существенно ускорить процесс обезвоживания и инфильтрации, улучшить окрашивание образцов химическими реагентами, увеличить скорость диффузии антител и их реакции с антигенами [222, 274, 374].

1.4.2. Устройства для МВИ

Чаще всего для фиксации (и проводки) образцов используются бытовые микроволновые печи. Работы с установками для МВИ следует вести в вытяжном шкафу. Для получения воспроизводимых результатов перед началом работы в каждой данной микроволновой печи и с каждой данной склянкой необходимо провести картирование температурного режима, а затем строго соблюдать выбранные режимы [241, 242].

1.4.3. Режимы фиксации

Для обычной ТЭМ удовлетворительные результаты при фиксации с применением МВИ дают смеси ГА и ФА (см. Приложение, 3.10.9). Хорошая сохранность ультраструктуры клеток и тканей достигается в фиксаторе Карновского и ЧО в течение нескольких секунд (6-30 с). При фиксации образцов в ФА с использованием МВИ для гистохимического исследования наилучшие результаты получены при концентрации ФА 4-8 % и наличии в нем 10 % глюкозы или 5-10 % полиэтиленгликоля-2000 при 45-50®С и начальной температуре фиксатора 20®С. Скорость фиксации объектов по сравнению с обычной фиксацией увеличивается при этом в 10-40 раз. Для защиты структуры мембран от микроволновых повреждений в фиксатор добавляют небольшое количество CaCh или MgCh. Фиксатор, содержащий 0.05-0.1 % таниновой кислоты (ТК), эффективен для фиксации растворимых пептидов и протеинов. Некоторые ткани - хрящ, кость, зубы, легкие - требуют особых режимов МВИ, поскольку вода и воздух, находящиеся в них, могут при нагревании быстро увеличить свой объем и повреждать ткань. Для таких тканей рекомендуют дробное облучение (4-5 раз по 5 с с интервалом в несколько секунд). После воздействия МВИ объекты немедленно должны быть помещены в холодный раствор [186, 242, 276, 374].

1.4.4. Температурный режим фиксации

При использовании МВИ температура фиксатора является более важным параметром, чем продолжительность излучения. Под воздействием микроволн объекты нагреваются значительно сильнее, чем окружающая жидкость. Скорость подъема температуры образца при этом зависит от интенсивности радиации, от диэлектрических свойств объекта и раствора, теплоемкости и термопроводности образца, его ориентации и формы и др. В камере необходимо иметь высокочувствительный термометр и таймер с миллисекундным отсчетом или использовать окрашенные красителем Гимза кусочки агарового геля, которые изменяют свой цвет с пурпурного на голубой при температуре 45-55®С (см. Приложение, 3.1). Максимальное нагревание объекта не должно превышать 35-40®С [242, 276].

1.5. ФИКСАЦИЯ И ИММУНО-ЭМ

1.5.1. Требования к фиксации

Одной из основных проблем иммуно-ЭМ является необходимость одновременного сохранения антигенных детерминант и ультраструктуры тканей. ФА "нежно" фиксирует ткани, но плохо сохраняет их субмикроскопическую организацию. ГА обеспечивает хорошую сохранность ультраструктуры, но изменяет антигенные свойства и образует в тканях поперечные сшивки, которые уменьшают доступность антител к антигенам. Степень блокирования антигенных детерминант прямо пропорциональна концентрации ГА. Если концентрация ГА минимальна (0.5 % и менее), то степень маскировки антигенов незначительна. В настоящее время наиболее широко используется чистый ФА или ФА в комбинации с ГА при низких (0.1-0.5 %) концентрациях последнего.
Осмолярность и рН должны находиться в физиологических пределах. Для лучшего сохранения антигенных свойств можно использовать смеси ацетимидата и ФА, ФА и лизина-периодата, либо ГА и пикриновой кислоты. Поперечные сшивки белков, образуемые ФА, могут исчезать, если фиксированный кусочек инкубировать в буфере длительное время. Избыток ФА следует тщательно отмыть, а оставшиеся реактивные альдегидные группы подавить. В ряде случаев для блокирования свободных альдегидных групп после фиксации альдегидами ткань обрабатывают 0.05 М раствором хлористого аммония или раствором глицина (см. гл. 13). Фиксация при помощи ЧО ведет к фрагментации полипептидов и часто к потере антигенных свойств [105, 178, 193].
Добавление в формальдегидный фиксатор первичных аминов (циклогексиламина) улучшает сохранность ультраструктуры и антигенных свойств [243]. Качество альдегидной фиксации можно значительно улучшить, если добавить в фиксатор лизин или имид. Карбодиимид взаимодействует со свободными карбоксильными и аминогруппами. ГА присоединяется прежде всего к аминогруппам. После фиксации объекта в ГА в тканях остается множество свободных альдегидных групп, которые могут связывать антитела [105, 193].

1.5.2. Блокирование остаточных альдегидных групп

Для блокирования остаточных альдегидных групп используются 0.1 М Трис-глициновый буфер (рН 7.2), 1%-ный свежеприготовленный раствор борогидрида, 0.05 М глицин на физиологическом растворе с ФБ (ФБФР), 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), свободного от глобулинов, 1%-ный овальбумин, а также неиммунная сыворотка от животного того же вида, что и донор второго антитела. Время инкубации в этих растворах обычно составляет 10-60 мин. Если фиксатор включает ГА, то объект лучше обработать борогидридом или глицином, так как это уменьшает число остаточных альдегидных групп. Обычно используют 1%-ный борогидрид или глицин в ФБФР [138]. Выбор метода фиксации определяется спецификой конкретной реакции антиген-антитело и предполагаемой локализацией ( антигена [238].

1.6. ОСОБЕННОСТИ ФИКСАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК

Культивируемые клетки в ряде случаев фиксируют в парах фиксатора (см. рис. 1). Монослой клеток после альдегидной фиксации можно легко отделить от дна чашки путем аккуратного соскабливания резиновой или мягкой пластмассовой пластинкой или шпателем. При этом разрушается ничтожная часть клеток. Остальные клетки после центрифугирования и дальнейшего препарирования обнаруживают хорошую сохранность ультраструктуры. Можно также нефиксированные культивируемые клетки аккуратно соскоблить с помощью резинового шпателя, а затем зафиксировать [193].

1.7. ХРАНЕНИЕ ФИКСИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА

После фиксации изредка возникает проблема хранения фиксированного материала. Чаще всего хранение объектов после фиксации приводит к ухудшению качества получаемых ЭМ-изображений. Обычно накопление и хранение материала осуществляются в том же охлажденном буферном растворе, на котором готовился фиксатор. Однако ФБ при этом быстро зарастает микроорганизмами. Для предупреждения зарастания в фиксатор следует добавить 0.1-0.2 % ГА или ФА, конечно, если это не повлияет на антигенные свойства тканей.

1.8. АРТЕФАКТЫ 1.8.1. Артефакты, возникающие при взятии материала

Критерием хорошей фиксации является отсутствие отека цитоплазмы и органелл [315]. Причинами артефактов в этом случае могут быть интоксикация наркотическими веществами, болевой шок, нарушение кровообращения и длительное кислородное голодание, механические травмы. Эти артефакты в основном выражаются в изменении нормальных геометрических соотношений структур, в наличии глубоких разрывов мембран клеток и клеточных органелл, а также интерстициального отека с нарушением нормальной топографии тканевых элементов, в резком изменении осмиофильности и электронной плотности клеток, в набуханий митохондрий и пресинаптических терминалей с характерной перегруппировкой синаптических пузырьков и т.п. [11, 121].
Для предупреждения этих явлений необходимо обеспечить адекватные условия наркоза и умерщвления животных, меньшую травматичность выделения кусочков тканей, быстроту вырезания и погружения их в фиксирующий раствор.
Механические манипуляции с препаратами ведут к повреждениям клеток и тканей. Гипоксия также вызывает альтерации ультраструктур. Везикулы могут возникать в результате разрыва и последующего слияния мембран [11, 121].

1.8.2. Артефакты, возникающие при фиксации

Эти артефакты чрезвычайно многочисленны и разнообразны. К наиболее частым из них относятся прерывистость плазматических мембран (на больших увеличениях мембраны имеют вид штриховых линий), набухание цистерн эндоплазматической сети, матрикса и полостей крист митохондрий, вакуолизация цитоплазмы, набухание тел клеток, ядер и отростков, извилистость контуров мембран. Часто погрешности при взятии материала или фиксации проявляются в виде характерных аутолитических изменений.
Причины этих артефактов в основном обусловлены неправильным выбором способа фиксации, использованием старых или грязных растворов, ошибками в процессе приготовления фиксирующего раствора, неадекватными значениями рН и осмолярности, неправильным проведением фиксации (например, неадекватными длительностью и температурой, низким давлением фиксирующей жидкости при перфузии) и т.д. Изменения объема, вызванные осмолярностью фиксатора, как правило, обратимы. Искусственные нарушения структур могут возникать как до, так и после фиксации. Тем не менее часто бывает очень трудно определить, где и когда возник артефакт [11, 121].

1.8.3. Артефакты, связанные с иммерсионной фиксацией

Гипоксия вызывает разбухание элементов эндоплазматической сети, митохондрий и других органоидов. Промывание сосудистого русла гипертоническим раствором существенно меняет строение плотных соединений эндотелия, открывая их, а промывание полостей растворами с низкой температурой ведет к сглаживанию рельефа поверхности клеток [177, 178]. Время между моментом прекращения кровотока и моментом начала фиксации не должно превышать 15 мин [121, 132].

1.8.4. Артефакты, обусловленные постфиксацией

При недостаточной фиксации в ЧО мембраны не имеют трехслойного строения. При слишком длительной фиксации теряется четкая структура мембран. Длительная альдегидная фиксация и сильное осмирование приводят к образованию гранулярного изображения в ТЭМ, что обычно рассматривается как артефакт [11, 121,212].
Глава 2 ЗАМОРАЖИВАНИЕ

2.1. МЕХАНИЗМЫ ЗАМОРАЖИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Процесс замораживания является важнейшим этапом многих методов ЭМ в биологии. Сложность и многоступенчатость этого процесса связаны с многокомпонентностью объектов и соответственно с различной температурой перехода компонентов из жидкого состояния в замороженное. Некоторые из них, например вода, при различных скоростях охлаждения переходят в разные состояния, отличающиеся конечной структурой и занимаемым объемом. Замораживание стабилизирует биологические образцы, но в то же самое время может существенно их повреждать. Это обусловлено кристаллизацией воды, которая разрушает клеточные структуры. Криофиксация относится к процессам иммобилизации биологических объектов с помощью очень быстрого охлаждения, при этом кристаллы льда либо вообще не образуются, либо эти кристаллы достаточно малы, чтобы не вызвать существенных структурных повреждений. Криофиксация оказывает на образец только физическое влияние. Поэтому правильнее говорить не о криофиксации, а о криоконсервации, или криостабилизации. Прекращение кровотока и иссечение ткани быстро ведет к потере и перераспределению ионов. Поэтому разработаны методы замораживания in situ, например с помощью охлажденной полой иглы [32, 303, 337].
Криофиксация имеет следующие преимущества: 1) сохраняет нативный состав элементов в объекте; 2) блокирует скоротечные биохимические и морфологические изменения; 3) предупреждает денатурацию белков; 4) дает возможность препарировать и изучать образцы в их естественном состоянии и окружении; 5) делает образцы твердыми, что позволяет изготавливать УС или сколы. Желательно замораживать объекты in situ [302].
Можно выделить три состояния замороженных объектов: 1) возникающий лед имеет макрокристаллическое строение (размером кристаллов более 3 нм); 2) образуются микрокристаллы льда (2-3 нм); 3) лед приобретает аморфную структуру (электрон-но-микроскопически кристаллы не определяются). Для большинства ЭМ-исследований первое состояние не пригодно из-за повреждения ультраструктур. Для практических целей достаточно достижения второго состояния. С физической точки зрения, только аморфное состояние льда отвечает идеальной криофиксации [32].
Достигаемое состояние льда в тканях образца определяется скоростью охлаждения, которая в свою очередь лимитируется тремя факторами: 1) теплоемкостью образца, 2) теплопроводностью воды и 3) скоростью отвода потока тепла от препарата. Быстрое замораживание дает много мелких кристаллов, медленное - мало, но крупных. Очевидно, что в биологических исследованиях может быть изменен только первый (уменьшение объекта) и последний параметры, поскольку замена воды другим растворителем резко меняет свойства биологических мембран, приводя к потере многих возможностей метода замораживания-скалывания. Теоретически скорость отвода тепла от поверхности образца может достигать 10®С/с и более. Однако с увеличением расстояния от поверхности скорость охлаждения составляет не более 10®С/с. На расстоянии 10 мкм величина этого параметра падает до 10®С/с. Однако на практике эти цифры существенно ниже [32].
В случае чистой воды для достижения состояния витрификации необходима скорость охлаждения 10®С/с. При этом толщина слоя, в котором данный эффект будет обеспечен, составит не более 100 нм. Клетки и ткани требуют скорости охлаждения не менее 104®С/с и могут быть удовлетворительно криофиксированы в слое толщиной 10 мкм и менее. В то же время если такие образцы защитить криопротекторами, то требуемые скорости могут составлять 100®С/с, а достижимая глубина витрификации будет 1000 мкм [32]. Проверка указанных параметров на биологических тканях показала, что, например, на заднем эпителии роговицы при обычном препарировании кристаллы льда начинают формироваться уже на глубине 3 мкм. Скорость охлаждения 6000-10000®С/с предотвращала образование льда в цитоплазме, но в вакуолях он формировался даже на глубине 1 мкм [32].
Размеры образующихся кристаллов зависят от величины, интервала между точками замерзания воды и ее витрификации. Когда температура объекта после достижения точки замерзания снижается медленно, кристаллы льда образуются крупные. Если скорость отвода тепла больше, чем скорость его выделения, то рост кристаллов уменьшается. При t=-40®С система входит в зону гомогенной кристаллизации, когда каждая молекула воды становится потенциальным центром кристаллизации. Поскольку таких центров много, то размеры кристаллов лимитированы. В чистой воде зона кристаллизации расположена в температурном интервале от 0 до -133®С. Величина интервала зависит от количества воды в биологических объектах, например в морозостойких клетках, где содержание воды уменьшено, зона кристаллизации находится между -13 и -43®С. Быстрое замораживание позволяет стабилизировать ткани в состоянии, близком к естественному. В этом случае практически не возникает осмотического повреждения и преципитации белков. Единственным строгим и надежным методом контроля за качеством замораживания является анализ гидратированных замороженных Y.C методом дифракции электронов [32].

2.2. МЕТОДЫ БЫСТРОГО ЗАМОРАЖИВАНИЯ

Быстрое замораживание образцов реализуется с помощью ряда приемов: 1) погружение в охлажденную до сверхнизких температур промежуточную жидкость - криоген; 2) разбрызгивание крио-гена на образец; 3) распыление объекта на охлажденную жидкость; 4) метод "сандвича"; 5) замораживание объекта на охлажденном металлическом зеркале; 6) замораживание при высоком давлении. Подробное описание технических деталей методов и устройств для замораживания приводится в монографиях и обзорах [32, 75, 285, 304].

2.2.1. Использование криогенов

В качестве криогенов обычно применяются углеводороды и флюорокарбоны (фреоны, изопрены, пропан и др.), которые предварительно охлаждаются в жидком азоте, кислороде или гелии (рис. 2). На практике для этой цели объект обычно погружают в пропан или фреон-22, охлаждаемые в жидком азоте. Фреон-22 замерзает при t=-164®С, пропан при t=-190®С, жидкий азот при t=-210®С. Скорость замораживания при использовании пропана достигает 19100®С/с, фреона-22 - до 9000®С/с, фреона-12 - до 6580®С/с, шуги (затвердевающий жидкий азот) - до 1700®С/с. Пропан является более эффективным криогеном, так как скорость охлаждения в нем выше. Для быстрого замораживания не применяется жидкий азот, поскольку при погружении в него объекта образуется газовая прослойка, обладающая термоизолирующими свойствами. Однако жидкий азот в суперкритическом состоянии при температуре, близкой к точке плавления (t=-210®С), и при давлении, превышающем критическое 1(335 атм), иногда используют в качестве криогена. Для этих целей разработаны специальные установки [298].

0x01 graphic

Рис. 2. Устройство для быстрого замораживания объектов. 1 - медный стержень, погруженный в жидкий азот; 2 - камера с криогеном; 3 - сжиженный криоген; 4 - объект; 5 - контейнер; 6 - жидкий азот; 7 - баллончик с криогеном.

Обычно объекты замораживают во фреоне-12 (или во фреоне-22). Фреон-12 - это газ, становящийся жидким при t=-30®С при атмосферном давлении. Перед использованием его сжижают, пропуская через медную трубку, отрезок которой погружен в жидкий азот; конец трубки выведен в металлический контейнер, плавающий на поверхности жидкого азота в сосуде Дьюара [65]. При погружении объектов на металлическом блоке в криоген лучше пользоваться пластмассовым пинцетом. Перемешивание крио-генов значительно увеличивает скорость охлаждения [32, 300, 304].

2.2.2. Использование принципа пульверизатора

В процессе исследования суспензий одиночных клеток и клеточных органелл размеры объектов легко уменьшить до 10 мкм, при этом их можно быстро заморозить, разбрызгивая раствор пульверизатором на полированную поверхность охлажденного металлического блока [32].

2.2.3. Метод "сандвича"

Разработана методика сверхбыстрого замораживания взвеси объектов в жидком пропане с помощью метода "сандвича": взвесь помещают в щель шириной не более 10-15 мкм между двумя медными пластинками, толщина которых 50 мкм, и быстро погружают в интенсивно перемешиваемый жидкий пропан. "Сандвич" можно также охлаждать струей охлажденного пропана. Наиболее эффективным оказался метод "сандвича" с двухсторонним охлаждением. В этом случае тонкий кусочек ткани или монослой клеток помещают между двумя полированными медными пластинками, которые с двух сторон охлаждаются струями пропана [32, 120, 300, 304].

2.2.4. Метод холодного блока

На практике метод сверхбыстрого замораживания образца с применением металлического зеркала может быть реализован следующим образом. Стержень с полированной поверхностью находится под жидким гелием. На короткое время стержень поднимают над поверхностью гелия и касаются его полированной поверхностью объекта. Затем стержень вместе со слоем примороженной ткани снова погружают в жидкий гелий (вместо гелия может быть использован азот), где объект хранится до последующего препарирования. При таком охлаждении кристаллы льда в образце не обнаруживаются до глубины 5-12 мкм. В настоящее время существуют сравнительно недорогие и простые приборы для подобной криофиксации, где стержень охлаждается жидким азотом. Кристаллы льда при его использовании не обнаруживаются на глубине до 10 мкм [32, 84, 304].
Хорошие результаты и воспроизводимость дает метод замораживания с помощью полированного холодного медного блока с одновременным микроволновым облучением (в течение 50 мс). Такой подход позволил увеличить толщину аморфной зоны в объекте до 15 мкм [170, 370].

2.2.5. Замораживание под давлением

Этот метод позволяет уменьшить критический уровень охлаждения в 100 раз и сохранить интактную структуру тканей в поверхностном слое толщиной 150 мкм. Если охлаждение образца осуществляется между двумя металлическими поверхностями, то толщина слоя ткани, где происходит витрификация воды, может достигать 600 мкм. Использование замораживания под высоким давлением основано на принципе Ле Шателье. Как известно, замораживание приводит к увеличению объема воды, а высокое давление мешает его возрастанию, тем самым предотвращая кристаллизацию. Эффект реализуется путем снижения точки замерзания и уменьшения уровня нуклеации и роста кристаллов. В настоящее время серийно выпускаются коммерческие аппараты для замораживания под давлением [32, 132, 287, 300, 304].

2.3. КРИОПРОТЕКТОРЫ

В большинстве исследований при замораживании тканевых образцов, обводненных более чем на 50-60 %, чаще всего используют химический способ уменьшения количества свободной воды с помощью криопротекторов. В качестве последних обычно применяют глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), сахарозу и некоторые другие вещества, молекулы которых, проникая в образец, активно структурируют воду. Для нефиксированных объектов этот метод не используется, так как в этом случае криопротекторы повреждают ткани и клетки. Криопротекторы бывают проникающими (глицерин, ДМСО) и крупномолекулярными непроникающими (поливинилпирролидон и др.). Непроникающие криопротекторы в клетки не входят, однако за счет обезвоживания объектов их кристаллизация существенно уменьшается [32].

2.4. ЗАМОРАЖИВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ПРИ КРИОУЛЬТРАТОМИИ

При изготовлении крио-УС объекты также должны быть защищены от кристаллизационных повреждений. Это обычно достигается с помощью криопротекторов. Чаще всего образцы пропитываются концентрированными растворами сахарозы. Для этого кусочки ткани толщиной не более 1 мм погружают в раствор сахарозы (1.6-2.3 М), а затем замораживают в жидком азоте. При низких концентрациях сахарозы (0.6-1.0 М) образцы лучше замораживать в жидком фреоне-12 при t=-158®С или в жидком фреоне-22 при t=-160®С. При использовании 1.6-2.3 М сахарозы объекты оказываются "мягкими" даже при t=-80®С. В этом случае резка осуществляется при температуре от -90 до -120®С [349]. Для получения относительно тонких срезов (20-30 нм) необходимо снижать концентрацию сахарозы, а следовательно, использовать более быстрое охлаждение [32]. Перед пропитыванием сахарозой (в ФБФР) или после нее (в сахарозе) ткань может храниться в холодильнике в течение недели или больше с незначительной потерей антигенности. В растворы желательно добавить 05 % ФА, чтобы не произошло снижения степени фиксации. Если использовался ГА, то ФА можно не добавлять.
Итак, для того чтобы избежать повреждений тканей при замораживании, их обычно пропитывают в 2.3 М сахарозе и затем замораживают в жидком азоте, в шуге (тающем азоте) или в тающем фреоне-22, охлажденном с помощью жидкого азота. Укрепление объектов на блоке криоультратома перед замораживанием обычно длится несколько минут. Следует помнить, что маленькие образцы быстро дегидратируются во время этой процедуры, что может серьезно ухудшить условия резания замороженных объектов [32].
В ряде случаев для изготовления крио-УС используют 2.07-1.61 М сахарозу, содержащую 10-30 % поливинилпирролидона (ПВП). Замораживание и резание образцов при этом облегчается. С помощью углекислого натрия рН смеси должен быть доведен до 7.0. Данный криопротектор рекомендуется использовать при иммуно-ЭМ, он не вызывает осмотических повреждений клеток даже при продолжительной инкубации [350].
Вместо сахарозы иногда используют 4.5-5 М фруктозу. Если же нельзя использовать сахара, то вместо них можно применять полиэтиленгликоль-300 или 500. Однако длительная обработка им объектов повреждает клеточные мембраны. Глицерин, применяемый в качестве криопротектора, существенно затрудняет проведение электронно-гистохимических исследований, так как глицерин значительно снижает активность ряда биохимических процессов. Использование полиэтиленоксида облегчает процесс изготовления Крио-УС, которые в этом случае получают при температуре объекта от -120 до -150®С, температуре ножа -40®С и низкой скорости резания [32, 300, 304].
Глава 3 ЗАЛИВКА

Заливка представляет собой следующий важный этап препарирования объектов для ЭМ-исследования (см. Приложение, 3.1). Использование термина "заливка" обусловлено тем обстоятельством, что, во-первых, этот термин стал общепринятым в ЭМ и используется уже более 40 лет (см.: [16]), во-вторых, более адекватный с литературной точки зрения термин "заключение" в ЭМ может иметь два значения: заключение объектов в заливочные смолы и заключение срезов в прозрачные среды. Для того чтобы избежать путаницы, мы пользуемся при дальнейшем изложении первым термином.
Цель заливки - равномерно пропитать ткань заливочным материалом и получить после отвердения блок, обладающий оптимальным для ультратомии сочетанием твердости и эластичности [53, 76, 333]. Этот этап препарирования настолько важен, что обычно электронные микроскописты отказываются изучать материал, неадекватно обработанный до поступления в их лабораторию [135].

3.1. ПРОМЫВАНИЕ

Промывание объектов после фиксации в ЧО не является обязательным, можно заменить его несколькими споласкиваниями в этаноле при низких его концентрациях.

3.2. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Поскольку большинство заливочных сред нерастворимо в воде, то фиксированные объекты нуждаются в обезвоживании: необходимо заместить воду в образце промежуточным растворителем (дегидратантом), который хорошо смешивается с водой и с заливочной средой. При использовании водорастворимых заливочных сред можно обойтись без органических растворителей. Обезвоживание в этом случае осуществляется в ходе пропитывания. Перед пропитыванием эпоксидными смолами объекты иногда помещают в окись пропилена, которая особенно хорошо смешивается со смолами. Обычно объекты постепенно "проводятся" через ряд водных растворов дегидратанта с возрастающей концентрацией (50, 70, 90, 100 %). Время выдержки в каждом из растворов дегидратанта может составлять от 5 до 15 мин (см. Приложение, 4.3). При малом времени дегидратации требуется интенсивное перемешивание жидкости (см. Приложение, 4.4).
Если невозможно провести фиксацию, обезвоживание и заливку материала за один день, то фиксированный материал можно довести до 70%-ного этанола и оставить на ночь в холодильнике, однако слишком долгое хранение объектов в этих условиях вызывает экстракцию липидов. Сливать дегидратант следует так, чтобы не допустить подсыхания объектов. Для того чтобы объекты в процессе обезвоживания не прилипали ко дну, пользуются молекулярными ситами [72, 333].

3.2.1. Дегидратанты

Наиболее часто в качестве дегидратантов применяют этанол, ацетон и метанол. Вместо этанола для обезвоживания иногда используют ацетонитрил [137]. Объем обезвоживающей смеси должен в 10 раз превосходить объем обрабатываемой ткани. Абсолютный этанол повышает хрупкость образцов. Кроме того, абсолютный этанол, приготовленный с помощью прокаленного медного купороса, может содержать незначительное количество солей меди, которые являются ингибитором полимеризации.
Большинство авторов в последние годы используют 100%-ный ацетон. Материал, который обезвоживался в ацетоне, обладает более равномерными механическими свойствами по сравнению с таковым, обработанным этанолом. Однако ацетон при дегидратации в большей степени экстрагирует нуклеиновые кислоты. Ацетон чувствителен к свету и должен храниться в темной посуде. Ацетон быстро поглощает влагу и становится непригодным для использования. При смешивании равных частей годного к использованию ацетона и петролейного эфира в жидкости не должно образовываться слоев.
Обезвоживание должно быть полным - для этого необходимо, чтобы 100%-ные дегидратанты были абсолютными. Следует отметить, что абсолютные этанол и ацетон мгновенно поглощают воду из воздуха. Очень гигроскопичной является и окись пропилена. Сжатие тканей во время обезвоживания можно уменьшить при их дегидратации с помощью 2,2-диметоксипропана (ДМП) [333, 367], который быстро реагирует с водой в присутствии ионов водорода, распадаясь на метанол и ацетон. При использовании ДМП объекты надо тщательно отмыть от солей фосфорной кислоты, которые с ДМП образуют осадок. Время дегидратации кусочков объемом

1 мм в подкисленном ДМП составляет 5 мин. После обезвоживания объекты для лучшего пропитывания смолой рекомендуется обработать в окиси пропилена.

3.3. ЗАЛИВОЧНЫЕ СРЕДЫ (ЗС)

Для получения УС существует большой набор ЗС с различными свойствами: эфиры акриловых кислот (метилметакрилат, бутилметакрилат, окиси гидрооксипропилметакрилата, гликольметакрилат, их смеси), полиэфирные смолы (Вестопал W, Риголак, Селектрон-5003 и 5214), эпоксидные смолы (Эпон 812, 826, 871, Эпилокс, Эпикон, Аралдит 502 и Аралдит М, Мараглас, Аквон, Дуркупан). Создано и уже применяется новое семейство заливочных смол на основе меламина. Кроме того, используют альдегид-мочевину, желатину, агар-агар, смесь ГА-карбогидразид, которые, однако, в силу ряда причин (в основном из-за плохой воспроизводимости и низкого качества УС) не нашли широкого применения [72, 105, 333, 367].

3.3.1. Сравнительная характеристика ЗС

ЗС должна обладать следующими качествами: 1) иметь низкую вязкость; 2) хорошо проникать в ткани; 3) хорошо смешиваться с дегидратантами; 4) полимеризоваться с малой усадкой; 5) хорошо резаться; 6) минимально рассеивать электроны после полимеризации; 7) быть стабильной под электронным пучком; 8) обеспечивать хорошее и воспроизводимое контрастирование срезов и доступность реагентов для иммунных и гистохимических реакций. В наибольшей степени этим требованиям удовлетворяют эпоксидные и полиэфирные смолы, новое поколение смешивающихся с водой акрилатов [72, 105, 333, 367].
В настоящее время идеальной среды для заключения в ЭМ нет. Все они обладают теми или иными недостатками. Мономеры аралдита, эпона и метакрилатов растворяют жиры. В водорастворимых ЗС могут экстрагировать гликоген и другие водорастворимые компоненты. Полиэфирные смолы трудно проникают в ткань, а некоторые компоненты смеси нестабильны при хранении. Метакрилаты неравномерно полимеризуются и менее стабильны под электронным пучком. Основной недостаток эпоксидных смол - большая вязкость, которая затрудняет пропитку тканей. Смешивающиеся с водой эпоксидные смолы реагируют с белками и нуклеиновыми кислотами. Акрилаты растворяют нейтральные липиды и фосфолипиды даже при низких температурах [105, 333, 367].

3.3.2. Эпоксидные смолы

Из эпоксидных смол наиболее широко используются Эпон 812, Аралдит М, их смеси и смола Сперра (см. Приложение, 4.1- 4.7, 4.10 и 4.11). Последняя особенно хороша для тканей, плохо Пропитывающихся вязкими смолами. К сожалению, фирменные наименования веществ, составляющих аралдитовые и эпоновые смолы, не унифицированы, поэтому желательно использовать в работе компоненты одной марки, если это невозможно, то допустимо приготавливать смеси из реактивов разных фирм [70]. Внедряемая в последние годы мараглас-кардолитовая ЗС превосходит Эпон 812 скоростью пропитки и обладает более благоприятными механическими свойствами, обеспечивающими лучшее качество УС [105, 333, 367].
Вязкость эпоксидных смол существенно варьирует. Естественно, что большая вязкость требует более продолжительного пропитывания. Эпоксидные смолы довольно гигроскопичны, а попадание в них влаги плохо сказывается на полимеризации. При полимеризации степень сжатия эпоксидных ЗС не превышает 2 %. Эпоксидные УС под действием электронного пучка теряют не более 20 % массы. УС тканей, заключенных в эпоксидную смолу, достаточно прочны, и их можно монтировать на сеточках без опор-ной пленки [70, 72].
Эпоксидная ЗС состоит из мономера (Эпон, Аралдит), отвердителя и ускорителя. Разные партии смол различаются по своим свойствам, поэтому лучше всего пользоваться наборами одной фирмы и одной партии. Можно добавлять также пластификатор, чаще всего дибутилфталат, который уменьшает вязкость смолы, улучшает качество резания. В качестве "отвердителей" (уплотнителей) - веществ, реагирующих с мономерами эпоксидных смол с образованием полимеров, используются ангидриды. Наиболее употребим додеценилсукциниловый ангидрид (ДДСА). Он имеет длинную молекулу и обеспечивает пластичность смолы после полимеризации. Для смол аралдитового ряда ДДСА является оптимальным отвердителем. Однако с Эпоном 812 ДДСА дает слишком мягкие блоки. Поэтому в данном случае используется другой отвердитель - метилэндометилентетрагидроофталевый ангидрид, который чаще называется метилнадикангидридом (methyl Nadic anhydride), или МНА (от торговой марки Надик). В США это вещество часто называется НМА. Реже используется ноненилсукцинангидрид (НСА).
Реакция полимеризации между эпоксидной смолой и ангидридами требует очень высокой температуры. Для того чтобы реакция проходила в доступном температурном режиме, в смеси добавляют, инициаторы. Данная реакция не вызывает значительного уменьшения объема, не зависит от типа инициатора, на нее не влияют тканевые компоненты (в отличие от метакрилатов, которые могут полимеризоваться под действием компонентов, содержащихся в объектах) [156].
В качестве инициаторов полимеризации эпоксидных смол чаще всего используются третичные амины. Ранее в качестве инициатора широко использовался 2,4,6-трис(диметиламинометил)фенол (ДМП-30, или DY064). Однако он имеет слишком высокую вязкость, инактивируется водой и быстро портится. Из-за своей нестабильности он должен храниться сухим в эксикаторе и заменяться каждые 3-4 мес. Поэтому в настоящее время применять его не рекомендуют. Лучше заменить его бензилдиметиламином (БДМА, или DY 062), увеличив концентрацию последнего до 3 % [156], а количество дибутилфталата можно слегка уменьшить (до 0.25 %) [154]. БДМА более стабилен и может использоваться вместе с большинством эпоксидных смол. Применяются также диметиламиноэтанол (ДМАЭ), который часто обозначают как Сl (или S1), и паратолуенсульфоновая кислота. Для удобства работы полезно знать, что в каждом миллилитре БДМА содержится около 80 капель (при раскапывании из пастеровской пипетки в вертикальном положении). Из того же количества ДМАЭ и при тех же условиях можно получить 90 капель.
В последние годы очень большое внимание стало уделяться так называемому коэффициенту "ангидрид/эпоксид" (А : Е), данное соотношение даже получило название "индекс качества резания". Эпоксидный эквивалент, или коэффициент ВПЕ (WPE), представляет собой массу (М) эпоксидной смолы, приходящуюся на чистый эпоксид (число граммов смолы, содержащих 1 г эквивалента эпоксида). Коэффициент ВПЕ по размерности приравнивается к молекулярной массе (Mm) ангидрида, чтобы можно было использовать следующую формулу:

К примеру, в оригинальной прописи Аралдита М был указан коэффициент 1 : 1, что предполагало использование приблизительно равных объемов Аралдита М и ДДСА. Однако было установлено, что при таком соотношении возникает высокая степень трения между ножом и блоком - появляются четтер и вибрация (см. гл. 5). Для уменьшения числа поперечных сшивок предложено уменьшить соотношение до 7 : 10 [156]. Если количество смолы и отвердителя измеряется по массе, то желательна точность до 0.1 г. Мнение о важности точного соотношения эпоксидной смолы и ангидрида привело к тому, что производители смол начали на каждой банке писать ВПЕ и рекомендации по изменению соотношений в прописи, для того чтобы получить требуемое отношение ангидрида к эпоксиду. Однако наблюдения показали, что это соотношение не имеет существенного значения, поскольку образование поперечных сшивок в смоле при t=60®С идет не до конца, хотя в общем число поперечных сшивок увеличивается при увеличении отношения ангидрида к эпоксиду [156].

3.3.2.1. Аралдит

Диглициловый эфир бифенола А (4,4-изопропилиденедифе-нол) - ароматическая эпоксидная смола, известная под торговыми - марками Аралдит или Эпикот. Для ЭМ используют Аралдит М (или ЩСУ 212, реже он носит название Дуркупан ACM - Durcupan ACM), кооторый производится в основном в Европе и содержит 19 % дибутилфталата (ДБФ) Аралдит 502 и Аралдит MY 753, которые производятся главным образом в США, содержат только по 17 % дибутилфталата (ДБФ). Аралдит в большей степени, чем Эпон, устойчив к электронной бомбардировке, обеспечивает более гомогенную полимеризацию и минимальное сжатие. При использовании Аралдитов 502 и MY 753 нужно к смеси добавить ДБФ. Для того чтобы сделать более мягкими, лучше ввести специальные смягчители (flexibuizer), например 1,4-бутанеодилдиглицидиловый эфир (DY 026) или диглицидиловый эфир полипропиленгликоля (DER 736), которые имеют преимущество перед пластификаторами, поскольку реагируют с другими компонентами заливочной смолы, становятся частью поперечно сшитой структуры и в меньшей степени теряются при электронной бомбардировке.
Большинство современных микроскопистов предпочитают , более твердые блоки и обычно к смеси Аралдита добавляют только 0.5 мл пластификатора - ДБФ. Если объекты твердые, то пластификатор или не добавляют, или вместе с ДДСА используют МНА. Предложена стандартная пропись заливочной смеси Аралдита (см. р Приложение, 4.2), в которой отношение ангидрида к эпоксиду варьирует от 0.79 до 0.87 в зависимости от ВПЕ Аралдита. Если - требуется получить более твердые блоки, то рекомендуется заменить часть ДДСА на МНА (чтобы получить то же самое отношение ангидрида к эпоксиду, каждый миллилитр ДДСА заменяется на 0,5 мл МНА, однако концентрация БДМА в полной смеси не должна превысить 3 %).

3.3.2.2. Эпон

Эпоксидные смолы с более низкой устойчивостью к электронному пучку, чем аралдиты, имеют торговую марку Эпон 812. Эта смола или ее аналоги часто продаются под другими названиями: Агар 100 (Agar 100), ЭМбед 812 (EMbed 812), Медкэст (Medcast), LX-112, Эпонет 12 (Eponate 12), Поларбед 812 (Polarbed 812), Полибед (Poly/Bed), Теэйб 812 (Taab 812). Эпон 812 - это триглицидиловый эфир глицерола.
Для заливки в эпон рекомендовано несколько прописей. Наиболее широко используется пропись Люфта (см: [72, 156]), согласно которой рекомендуется вначале приготавливать две отдельные базовые смеси (А и Б), а уже при их смешивании в различных пропорциях получать блоки нужной твердости. Отношение ангидрида к эпоксиду варьирует от 0.69 до 0.81 для первой смеси и от 0.70 до 0.82 для второй. Однако опыт показывает, что блоки удовлетворительного качества можно получить из любой марки коммерческого эпона. При соотношении смесей А и Б 7 : 3 получаются мягкие блоки, а при соотношении - 3:7 блоки будут твердыми. Рекомендуется добавлять 3 % БДМА. Однако гораздо удобнее готовить заливочную смесь в один этап (см. Приложение, 4.2).

3.3.2.3. Смеси Эпона и Аралдита

В ряде случаев исследователи предпочитают использовать смесь эпона с аралдитом (см. Приложение, 4.2). Существует мнение, что. подобная смесь сочетает низкую вязкость эпона с большей устойчивостью к электронному пучку аралдита. Однако данное мнение не имеет экспериментального обоснования. Не ясно, имеет ли значение использование эпона и аралдита одной фирмы (как это рекомендуется во многих лабораториях), или это не существенно.

3.3.2.4. Смола Сперра

Смола Сперра - это диоксивинилциклогексан. Данная эпоксидная смола с низкой вязкостью была предложена Сперром [336]. Однако она довольно канцерогенна и более токсична. Смола Сперра имеет преимущество при работе с плохо пропитывающимися объектами. Все этапы препарирования (в том числе и полимеризацию) с данной смолой следует проводить в вытяжном шкафу. ЗС с инициатором должна быть хорошо перемешана и использована в день приготовления. Можно непродолжительное время хранить ее при t=-20®С, но при этом тщательно защищать от попадания влаги. Смола Сперра смешивается с ацетоном и этанолом, поэтому окись пропилена использовать необязательно. Компонент, имеющий фирменное название DER 736, снижает твердость блоков (см. Приложение, 4.6). Обычно ЗС затвердевает за 9 ч при t=70®С. Блоки можно резать через 3-4 сут. Для повышения скорости полимеризации (до 3 ч) количество компонента S1 надо увеличить до 1.0 части.
В процессе приготовления ЗС компоненты добавляют строго по очереди, перемешивают аккуратно, избегая попадания пузырьков воздуха. Активатор можно добавлять только к последней смене ЗС. Капсулы должны быть хорошо просушены, поскольку смола очень гигроскопична, а в случае обводнения получаются очень хрупкие блоки. Обезвоживание и заливка стандартные. При попадании смолы Сперра на кожу ее смывать лучше водой с мылом. При изготовлении УС рекомендуется следующее: в ванночку наливать воду, использовать ножи с углом 50®, выставлять угол наклона ножа 8®, применять скорость резания 1 мм/с и подачу 30 нм [105, 333].

3.3.3. Полиэфирные смолы

Полиэфирные заливочные смолы полимеризуются при температуре от 45 до 60®С или под воздействием ультрафиолетового облучения при комнатной температуре. При заливке не рекомендуется использовать полиэтиленовые капсулы. Наиболее широко применяется Вестопал W. Эти смолы не смешиваются с этанолом, поэтому обезвоживание обычно проводят в ацетоне. Затем объекты инкубируют в растворах при возрастающей концентрации вес-топала в ацетоне. Вестопаловые блоки относительно твердые [11, 333] (см. Приложение, 4.8).

3.3.4. Водорастворимые заливочные среды

Водорастворимые заливочные среды (аквон, дуркупан, гликольметакрилат, оксипропилметакрилат и другие новые акрилаты; см. гл. 4) предназначены в основном для проведения иммуноци-тохимических и гистохимических реакций. Обезвоживание при их использовании может быть неполным или вообще не проводиться. Пропитывание может осуществляться водными растворами этих смол.
Аквон - это водорастворимый экстракт эпона, который имеет низкую вязкость и смешивается с водой при t < 15®С. Он используется с теми же отвердителями и ускорителями, что и эпон. Точный химический состав аквона неизвестен. Это водорастворимая фракция, содержащаяся в коммерческом Эпоне 812. Аквон - бесцветная, гигроскопичная жидкость с низкой вязкостью. Фиксированные и промытые объекты проводят через ряд водных растворов аквона с повышающейся концентрацией постепенно достигая абсолютного аквона, который при добавлении уплотнителя и ускорителя полимеризуется и дает такие же блоки, как Эпон 812 [105, 333].
Смешивающаяся с водой эпоксидная ЗС Дуркупан дает худшие результаты, чем акрилаты. Водорастворимый Дуркупан не следует путать с Дуркупаном АСМ. Дуркупан ACM (Fluka) - это то же самое, что и Аралдит CY 212. Дуркупан смешивается с водой. Поэтому заливка образцов может быть проведена без применения этанола [105].

3.3.5. Другие заливочные среды

Заливочные смолы семейства Меламина смешиваются с водой, нетоксичны, при полимеризации выделяют пары ФА. Коммерчески доступными являются FB-101 (Nanoplast - температура инфильтрации 40®С, температура полимеризации 60®С), АМЕ-01 (-82®С и 60®С соответственно). Эти смолы часто используют для замещения в замороженном состоянии. По свойствам они сходны с поперечно сшитыми акриловыми смолами. Нанопласт FB-101 имеет вязкость 48 сП и усадку при полимеризации 2 % (см. Приложение, 4.9). Он позволяет получать достаточно тонкие УС [301].
ГА можно использовать не только в качестве фиксатора, но и как ЗС. Для сополимеризации применяют карбогидразид, гликольметакрилат, мочевину [165]).

3.3.5.1. Полиэтиленгликоль (ПЭГ)

ПЭГ является хорошей заливочной средой для криостатных срезов при иммуноцитохимических исследованиях. Заливка в ПЭГ относительно проста и не требует специального оборудования. В процессе пропитки блоки можно оставлять открытыми на ночь в 50%-ном растворе ПЭГ, приготовленном на 100%-ном этаноле, для того чтобы этанол улетучивался. Затем, осушив образцы от избытка ПЭГ, их переносят в капсулы для заливки. Кроме ПЭГ для этих же целей можно применять диэтиленгликоль дистеарат [301, 333] (см. Приложение, 4.12).

3.4. ПРОПИТЫВАНИЕ И ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ

Цель этого этапа препарирования - равномерно пропитать образец заливочной средой и после отвердения получить блок, обладающий оптимальным для ультратомии сочетанием твердости и эластичности. Поскольку отдельные дегидратанты не смешиваются с заливочными средами, то применяют промежуточные дегидратанты, например окись пропилена, которая существенно улучшает инфильтрацию образцов. Для замещения этанола следует сменить окись пропилена 2-3 раза. Однако этот прием не является обязательным. Так, Эпон 812 смешивается с этанолом, поэтому обработку окисью пропилена можно опустить. В повседневной практике используют более сложные и ускоренные методы заливки (см. Приложение, 4.4). Отметим, что ускоренная заливка может быть рекомендована только в том случае, если применяются свежие смолы.
Пропитывание объектов смолой можно производить прямо из абсолютного этанола, поскольку и эпон, и аралдит смешиваются с ним. Однако полностью удалить этанол из объектов очень трудно, что ухудшает качество блоков. Эту проблему прекрасно решает использование в качестве промежуточной жидкости окиси пропилена, которая быстро диффундирует в ткани и реагирует с ангидридом отвердителя, поэтому ее остатки в тканях не приносят вреда. Надо, однако, избегать высыхания объектов, поскольку окись пропилена очень летуча.
Опытные электронные микроскописты рекомендуют использовать какую-нибудь одну стандартную пропись заливочной смеси и применять ее постоянно [156]. Добавление активаторов, как правило, быстро повышает вязкость заливочных сред, что усложняет пропитку. Поэтому некоторые исследователи вначале пропитывают объекты в заливочной смеси без активатора. В процессе пропитывания для лучшей инфильтрации объектов можно поднять температуру до 37-50®С [72, 105, 333, 367].

3.4.1. Перемешивание ЗС

Для работы со смолами лучше использовать посуду и шприцы из пластика, к которому она не прилипает. Чтобы получить равномерную полимеризацию, нужно тщательно перемешать все компоненты заливочной среды на магнитной мешалке или с помощью специальных винтовых вращающихся приспособлений. Плохое смешивание - одна из причин плохой резки. Чтобы улучшить смешивание, эпоксидную смолу обрабатывают ультразвуком в течение 10-15 мин. Во многих отечественных лабораториях перемешивание ЗС осуществляется вращением стеклянной палочки. При этом образуется множество пузырьков воздуха. Применение магнитной мешалки вместе с нагреванием смеси до t=50®С существенно уменьшает образование воздушных пузырьков [333]. Образовавшиеся после перемешивания в заливочной смеси пузырьки воздуха надо обязательно удалить: дать смеси отстояться, подогреть в термостате, поместить в ультразвуковую ванну (на 10-15 мин). Перед полимеризацией капсулы с объектами иногда выдерживают под низким вакуумом для удаления дегидратанта, воды и воздуха. Все этапы обезвоживания и инфильтрации образцов желательно проводить на медленно вращающемся держателе, наклоненном под некоторым углом к оси вращения. Для заливки объектов в последние годы используют автоматические процессоры [307]. Процедура заливки должна быть стандартной, влажность и температуру окружающей среды необходимо сохранять постоянными. Заливку желательно осуществлять в специализированном термостате [72, 105, 333, 367].
Рекомендуемые в большинстве руководств механические способы смешивания компонентов эпоксидных смол не обладают достаточной эффективностью. Даже если смесь кажется полностью перемешанной, она, по существу, таковой не является. Отмерять нужные количества компонентов смолы лучше по объему после их разогрева. Если отмерять по массе, то разогретая смола быстро остывает. Поэтому Глоуэрт и Холл [156] настоятельно рекомендуют следующий прием. Поместить банки с компонентами смолы в термостат при t=60®С на 10 мин (можно чуть больше): нагревание до этой температуры резко уменьшает вязкость эпоксидных смол. Отлить нужный объем смолы и отвердителя в нагретый градуированный цилиндр, сразу же слить их в предварительно нагретую коническую колбу и быстро смешать с помощью вращения и покачивания колбы до полного перемешивания (обычно в течение 3-5 мин). Палочку для перемешивания лучше не применять. Смесь должна быть прозрачной и неструктурированной. К ней добавляют точно отмеренное количество ускорителя, и смесь вновь вращают в течение 1-2 мин. После этого смесь готова для использования. Желательно каждый раз готовить свежую порцию полной заливочной смеси (обычно во время последних этапов дегидратации). Однако данный способ не годится, если применяется взвешивание компонентов. Практика показала, что количество смолы и отвердителя не требует точных измерений, а вот инициатор должен быть отмерен предельно точно и его количество не должно превышать 3 %.

3.4.2. Хранение заливочных сред

Все компоненты эпоксидных смол при комнатной температуре стабильны. Эпоксидные смолы могут храниться в закрытых сосудах при комнатной температуре продолжительное время. Ускорители менее стабильны и инактивируются при обводнении быстрее. Их хранят при комнатной температуре в эксикаторе. Эпоксидные смолы не рекомендуется хранить при низких температурах, поскольку возникает риск конденсации воды при открывании посуды. Это особенно опасно для БДМА, поскольку вода инактивирует его. Початые банки следует хранить при комнатной температуре в эксикаторе. Посуду с БДМА лучше открывать только на самое короткое время и менять банку на свежую каждые 6 мес. Если смола хранилась в холодильнике, то вначале она должна быть подогрета, и лишь потом ее можно открывать.
Смесь смолы и уплотнителя стабильна при комнатной температуре в течение нескольких недель. Однако ее лучше не хранить даже в холодильнике, поскольку у такой смеси постепенно увеличивается вязкость, что затрудняет дальнейшую работу с ней, кроме того, имеется опасность попадания в смолу воды. Если есть необходимость оставить приготовленную смесь, то хранить ее надо в плотно закрытом сосуде, чтобы смола не обводнялась, или в эксикаторе при t=-20®С. ЗС с активатором может храниться несколько дней при t=4®С и несколько недель при температуре от -20 до -30®С в плотно закупоренной банке, но в этом случае ее перед использованием нагревают до комнатной температуры. Большинство исследователей предпочитают смешивать отдельные компоненты непосредственно перед их применением [105, 301, 333].

3.5. РЕГУЛЯЦИЯ ТВЕРДОСТИ БЛОКОВ

Твердость конечного блока из эпоксидных смол регулируется добавлением пластификатора, а также изменением соотношения или заменой ангидридных отвердителей. ДДСА обычно дает более мягкие блоки, а МНА - более твердые. Поэтому, если резание затруднено, надо изменить соотношение компонентов. Полная полимеризация эпоксидных смол - процесс довольно длительный (месяцы). Вследствие этого качество старых блоков иногда оказывается лучше, чем свежеполимеризованных.
Как правило, чем выше температура, при которой происходит полимеризация, или чем выше концентрация активирующих веществ, тем быстрее протекает полимеризация и быстрее завершается образование коротких мономерных цепей. Короткие цепи мономера не придают блоку достаточной эластичности, поэтому ультратомирование таких твердых и хрупких блоков значительно затруднено. Низкая степень активации мономера приводит к тому, что основным тормозом роста полимерных цепей становятся тканевые структуры. В этой ситуации возникают значительные деформации и разрывы ультраструктурных компонентов клеток и тканей [301, 333].
Твердость и эластичность блока существенно влияют на качество получаемых УС и сродство тканей к контрастирующим агентам. Чтобы снизить твердость, можно добавить пластификатор. Увеличение количества ускорителя повышает твердость объекта, но делает его более хрупким. Природа самого отвердителя также влияет на твердость блока, поэтому можно использовать два разных отвердителя, варьируя их концентрации, например смесь Эпона 812 с ДДСА и Эпона 812 с МНА в разных пропорциях. Мягкие блоки лучше режутся на холоде, твердые - в тепле. Если при резке обнаружится, что образцы мягче, чем ЗС, то это значит, что ткань плохо пропиталась ЗС. Для предупреждения такого явления нужно, во-первых, увеличить время обработки в 100%-ном де-гидратанте, во-вторых, дольше выдерживать объекты в смесях, причем концентрация смолы должна повышаться более плавно, а смеси надо менять 2-3 раза в течение рабочего дня, в-третьих, увеличить время пропитывания самой смолой [367]. Для улучшения ультратомирования в состав заливочной смеси вводят 1 % низковязкой силиконовой добавки (аддитива) [333].

3.6. ЕМКОСТИ ДЛЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ

Для заливки обычно используют полиэтиленовые, реже - желатиновые капсулы. Имеется множество конструкций полиэтиленовых и латексных капсул, форм из тефлона и силиконовой резины. Если капсулы не пронумерованы, то следует в капсулу или в форму поместить бумажку с карандашным обозначением [139]. Существуют особые методы заключения мазков и изолированных клеток (рис. 3).

3.7. ОРИЕНТАЦИЯ ОБЪЕКТОВ

Ориентация образцов относительно плоскости резания достигается плоскопараллельной заливкой в специальные формочки, а также переклеиванием готовых для ультратомирования объектов (см., например: [1, 16, 51, 79]). Весьма удобными являются формочки из тефлона. Заполимеризованный блок из них легко вынимается (подробнее см. гл. 17).
0x01 graphic

Рис. 3. Способ подготовки для ТЭМ мазков изолированных клеток. А - накалывание взвеси клеток (/) на стекло (2); Б - фиксация стекол с объектами в контейнере (3) с раствором ГА: В - накалывание на мазки (4) раствора ЧО; Г -инкубация во влажной камере (5), обезвоживание и пропитывание объекта смолой; Д - заполнение смолой капсул (б), в которые помещен бумажный маркер (7); Е -переворачивание заполненных капсул, накрывание ими мазков и полимеризация; Ж и З- локальный подогрев позволяет легко отделить капсулу с объектами от стекла.

3.8. РЕЖИМЫ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ

После пропитывания контейнеры с объектами помещают в термостат при t=60®С на 24-48 ч. Время не является критическим фактором, поскольку свойства блоков меняются довольно медленно. Поэтому можно держать объекты в термостате в течение недели. Однако превышать температуру 60®С не рекомендуется. Используемые схемы быстрой проводки при t > 60®С обычно дают блоки плохого качества [156]. Поэтому мы их использовать для ТЭМ не рекомендуем, хотя для изготовления ПС их применять можно.
Наиболее часто для полимеризации используется t=60®С. При этой температуре образуется ограниченное число поперечных сшивок и получаемые блоки хорошо режутся. Для оптимального ультратомирования гораздо важнее не твердость блока как таковая, а число образовавшихся поперечных сшивок. Если в блоке сформировать все возможные поперечные сшивки, то с такого блока будет очень трудно получить УС. При более низкой температуре возникают линейные t полимеры. Поэтому Люфт (см: [156]) предложил ступенчатое повышение температуры в процессе полимеризации: сначала 35®С, затем; 45®С и, наконец, 60®С. Однако опыт показал, что существенного i выигрыша в качестве получаемых блоков это не дает, поэтому большинство электронных микроскопистов сейчас используют одноступенчатую полимеризацию при 60®С. Если температуру поднять выше 60®С, то резко увеличивается число поперечных сшивок, что делает блок хрупким и значительно ухудшает качество получаемых УС и их тинкториальные свойства. При температуре 80®С и выше начинается процесс саморазогревания смолы [156].

3.8. ЗАМЕЩЕНИЕ В ЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ

При иммуно-ЭМ исследованиях часто используют метод замораживания-замещения. Замещение воды на органические растворители осуществляется при низких температурах (как правило, при t < -45®С) с последующей инфильтрацией смолой [304].

3.8.1. Принцип метода

После замораживания объектов из них удаляют воду, погружая в дегидратант при температуре от -60 до -100®С. Во время замещения вода объекта переходит в дегидратант. Иногда в него вводятся поглотители воды (молекулярные сита).
В процессе замещения возможна рекристаллизация воды. Вообще говоря, в каждом конкретном случае трудно установить температуру рекристаллизации. Общепринято, что температура рекристаллизации воды в биологических объектах выше, чем у чистой воды. Процесс рекристаллизации протекает довольно медленно. Продолжительность его сопоставима со временем, необходимым для замещения верифицированной юлы льда органическими растворителями.
На практике при использовании метода замещения в замороженном состоянии объекты помещаются в пластиковые или металлические флаконы, заполненные жидким азотом, и переносятся в низкотемпературную камеру. Процесс обезвоживания занимает несколько суток. После этого в образцах сохраняется не более 30 % воды. Если не используется низкотемпературная заливка, то объекты можно медленно нагреть до комнатной температуры. Далее следует обычная заливка. Диффузия молекул воды в дегидратант - процесс относительно медленный. При этом не исключена возможность экстракции ряда компонентов ткани и перемещения ионов в пределах клетки и между клетками и внеклеточной средой. Сохранность структур во многом зависит от предшествующей процедуры быстрого замораживания [254, 259] (см. Приложение, 4.13).

3.8.1.1. Замещающие жидкости

В качестве замещающих жидкостей используют чаще всего этанол, ацетон, метанол, а также акролеин, пропиленоксид, диэтиловый эфир, диметоксипропан и др. Самое широкое применение нашел ацетон (иногда с добавками). Наиболее быстро замещение происходит в метаноле, а наиболее медленно - в диэтиловом эфире. Применение спиртов вызывает некоторое сжатие объектов и ряд структурных изменений, обусловленных частичной экстракцией цитоплазматического матрикса. Компоненты мембран в большей степени экстрагируются в более полярных растворителях [213, 259]. Сжатие проявляется в меньшей степени при использовании ацетона или тетрагидрофурана в смеси с некоторыми фиксаторами. Если замещение продолжается более 64 ч, то наблюдается экстракция компонентов клеточных мембран. Тот же эффект дает повышение температуры до -40®С в отсутствие 40. Способность ацетона поглощать воду не очень велика (2 % при t=-90®С и 3,5 % при t=-70®С), и составляет 1/10 от таковой у метанола. Однако более мягкое удаление воды из клеточных структур в ряде случаев уменьшает повреждения. Для лучшего выявления мембран после замещения с помощью ацетона объекты в последующем инкубируют в парах ЧО.
Добавление глицерина или этиленгликоля в дегидратант снижает скорость замещения и предупреждает сжатие, но не оказывает влияния на сохранность мембран и экстракцию цитоплазматических компонентов. Лучшая сохранность ультраструктуры и минимальная экстракция химических компонентов достигаются при использовании в последующем низкотемпературной заливки [72,259].

3.8.1.2. Применяемые фиксаторы и рекомендуемые схемы

Для стабилизации клеточных ультраструктур к замещающей жидкости добавляют фиксирующие агенты. Различные фиксирующие вещества стабилизируют структуру при разных температурах. Так, образование поперечных сшивок (например, в ГА) происходит при t > -10®С, а ЧО начинает реагировать с двойными связями ненасыщенных жирных кислот только при t=-73®С.
Акролеин при субнулевых температурах является наиболее эффективным фиксатором. Он обеспечивает удовлетворительную сохранность цитоплазмы уже при t=-80®С, но плохо фиксирует мембраны. ЧО даже при концентрации 5 % не оказывает заметно-то эффекта в условиях фиксации при t=-80®С. Признаки существенного фиксирующего действия ЧО - сохранение тонкой Структуры и окрашивание мембран - появляются лишь при повышении температуры до -40 или -50®С. В рутинной практике используется концентрация ЧО 0.2-0.4 % и t=-20®С. Время замещения при этом варьирует от 6 до 14 ч. Таким образом, ЧО может применяться как стабилизирующий агент, если температура замещения не ниже -30®С. При этом тканевые блоки остаются светло-коричневыми, что позволяет обеспечить полимеризацию акриловых ЗС в них с помощью УФО. При нагревании объекты обычно чернеют, так как осмиевая фиксация резко ускоряется. При использовании ацетона в него обычно добавляют ЧО (чаще всего 4 %). Отсутствие ЧО в дегидратанте ухудшает результаты [304].
ГА при t < 0®С является малоэффективным фиксатором. ГА В метаноле начинает фиксировать белки при t=-50®С. В температурном интервале от -20 до 14®С воздействие ГА предупреждает сжатие объекта только в случае предварительного использования акролеина и ЧО при более низкой температуре. О слабом влиянии альдегидов на сохранность ультраструктур говорит тот факт, что как при добавлении альдегидов, так и без них не выявлено разницы в сохранности ДНК бактерий [304].
Добавление уранилацетата (УА) в дегидратанты увеличивает контрастность мембран и микрофиламентов при их фиксации альдегидами и ЧО. Окрашивающие свойства УА зависят не только от концентрации и температуры, но и от используемого растворителя. Например, 05%-ный раствор УА в ацетоне дает более интенсивную контрастность, чем УА в метаноле. Кроме того, УА стабилизирует мембраны после фиксации альдегидами [259, 304].
Окрашивание цитоскелетных компонентов может быть усилено хлоридом гафния. Раствор хлорида гафния в метаноле в комбинации с УА увеличивает контрастность микротрубочек. Как и УА, он дает более интенсивное общее прокрашивание образца, если растворен в слабополярных растворителях (например, ацетоне). Таниновая кислота (ТК) при замораживании-замещении не только контрастирует, но и стабилизирует структуры. Добавление 0.2 % ТК к замещающей жидкости усиливает окрашивание мембран, матрикса и филаментов с помощью ЧО. В мембранах также обнаруживается меньше разрывов. В высоких концентрациях ТК является эффективным контрастером для многих клеточных компонентов. Она используется вместе с ЧО [304]. В то же время смесь ЧО с ацетоном оказалась малопригодной для препарирования в СЭМ из-за резкого сжатия клеток. Сморщивание образцов можно существенно уменьшить, если увеличить концентрацию ЧО до 3-5 % и повысить температуру объектов до -20®С. При замораживании-замещении используют обычно минимальные концентрации фиксаторов. Оказалось, что в замещающий раствор достаточно ввести всего 0.1 % ЧО. При замораживании-замещении наилучшие результаты получаются при использовании определенной комбинации фиксаторов. Активность различных фиксаторов оказывает значительное влияние на процесс контрастирования. Наиболее распространенная схема фиксации включает комплекс фиксирующих агентов, растворенных в метаноле: 3 % ГА, 1 % ЧО, 0.5 % УА. Для их лучшего растворения иногда добавляют 3 % воды [284, 304].

3.9. АРТЕФАКТЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

3.9.1. Артефакты, возникающие при обезвоживании

Неправильно проводимое обезвоживание способно повлиять на целостность клеточных мембран и вызвать их деформацию. Типичными артефактами обезвоживания являются расслоение миелиновых ламелл и сморщивание клеток, что может быть следствием слишком резкого увеличения концентрации обезвоживающих растворов. Избыточное пребывание материала в спирте или ацетоне способствует вымыванию липидов и гликогена из ткани. Недостаточное обезвоживание может стать причиной плохой пропитки и возникновения артефактов заливки. В частности, при плохой дегидратации в срезах появляются дырки. Эта проблема в ряде случаев решается путем использования гидрофильных смол более низкой вязкости (ЛР Вайт, ЛР Голд). В процессе препарирования для СЭМ тканей эмбриона сжатие может достигать 50 % [11, 121].

3.9.2. Артефакты, возникающие при заливке

Эти дефекты выражаются в грубых нарушениях топографии тканевых элементов и в разрывах клеточных мембран. Их причинами являются неоднородное или недостаточное пропитывание объектов с помощью ЗС, неоднородная, неполная или слишком быстрая полимеризация, высокая степень усадки блока при полимеризации. Неравномерность пропитки и полимеризации, а также другие недостатки заливки обычно выявляются при заточке блока, в ходе резания. Блок, который хорошо режется, редко дает артефакты заливки, и наоборот. Возможна экстракция веществ из тканей во время пропитывания заливочным материалом. В частности, мономеры эпона и аралдита способны растворять липиды [11, 121].
Глава 4 НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ ЗАЛИВКА

Нарушения конформации белков оказываются минимальными, если обезвоживание, инфильтрацию и полимеризацию проводить при низкой (-35®С и ниже) температуре. Подобная техника обеспечивает сохранность антигенных детерминант, ультраструктуры, а также значительно уменьшает неспецифическое связывание метки при иммуноцитохимических исследованиях.
С другой стороны, эпоксидные и полиэфирные смолы очень трудно отделить от поверхности биологических структур и тем самым обнажить антигенные детерминанты. При использовании для иммунных методов УС из гидрофильных акриловых смол антигены оказываются более доступными, чем в случае эпоксидных смол. Многие ферменты и антитела свободно реагируют с субстратами и антигенными детерминантами, заключенными в гидрофильный акрилат, например в Ловикрил К4М [333].
В отличие от эпоксидных смол акрилаты, в частности Ловикрил, не образуют ковалентных химических связей с тканевыми компонентами. Поэтому в процессе резания идет раскалывание образца по линии наименьшего сопротивления - по поверхности соприкосновения смолы и тканевых компонентов. Это приводит к возникновению поверхностного рельефа глубиной 3-6 нм [82, 218].
Подсчитано, что при одностороннем мечении антигенов на акриловых срезах толщиной 40 нм для антител доступна 1/8 часть всех антигенных детерминант, имеющихся в срезе. Преэмбеддинг (проведение иммунной реакции до заливки) обеспечивает увеличение уровня мечения только в 2 раза. Теоретически число доступных антигенных детерминант в крио-УС в 20-60 раз больше, чем в акриловых (Ловикрил К4М) УС, однако на практике это соотношение не превышает 10 [105].
В процессе препарирования биологических объектов очень важно сохранить некоторое количество воды в образце, чтобы обеспечить структурную интегрированность. Вместе с тем следует удалить достаточно воды, чтобы получить хорошо режущиеся блоки. Эта цель также достигается при использовании низкотемпературных гидрофильных акриловых смол [133].

4.1. СМОЛЫ ДЛЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАЛИВКИ

В настоящее время имеется целый набор акриловых заливочных смол: ЛР Голд (LR Gold) для низкотемпературных заливок (-35®С), ЛР Вайт (LR White) для заливки при комнатной температуре и Ловикрилы (Lowicryls) для низкотемпературной заливки (до -85®С) фиксированных объектов (см. Приложение, 5.1).
Ловикрилы и ЛР-смолы являются поперечно сшитыми акриловыми пластмассами. Они гидрофильны и в основном предназначены для иммуно-ЭМ и цитохимии. Ароматические полигидроксидиметакрилатные ЛР-смолы имеют повышенную по сравнению с ловикриловыми смолами устойчивость к электронному пучку [333].
Применение новых акрилатов имеет ряд преимуществ: 1) возможность выявления как внутриклеточных, так и внеклеточных антигенных детерминант на УС без их травления; 2) относительно высокое разрешение антигенов; 3) возможность количественной оценки реакции; 4) возможность двойного и тройного мечения путем одновременного использования частиц коллоидного золота (КЗ) различного диаметра; 4) относительно низкие вязкость и токсичность новых акриловых смол; 5) способность полимеризоваться при наличии в объектах воды (до 10 %); 6) хорошая окрашиваемость УС из новых акрилатов [105, 333, 367].

4.2. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ С РАЗЛИЧНЫМИ АКРИЛОВЫМИ СМОЛАМИ

При работе с акрилатами нельзя пользоваться ацетоном, поскольку он блокирует полимеризацию. По этой же причине не может использоваться диметоксипропан. Акрилаты менее стабильны под электронным пучком, чем эпоксидные ЗС, но более прочны, чем метакрилаты. УС лучше монтировать на подложку, так как при просмотре в ЭМ они теряют часть своей массы. УС из акрилатов рекомендуется держать под вакуумом, поскольку они быстро обводняются.

4.2.1. Сравнительный анализ

Сравнительный анализ преимуществ и недостатков различных марок акрилатов еще не закончен и во многом базируется на личных пристрастиях. Разные белки (антигены и ферменты) по-разному сохраняются в полярных и неполярных ловикрилах. Поэтому в каждом случае приходится действовать методом проб и ошибок. Например, при исследовании нервной системы с помощью акриловых смол выявляются нарушения структуры клеточных элементов из-за большого содержания в них липидов. Лучше всего сохраняет морфологию (и антигенность) нервной ткани смола ЛР Голд, а наиболее оптимальным режимом ее использования является контрастирование en blok с помощью УА с последующей дегидратацией в ацетоне и полимеризацией при низкой (-20®С) температуре [356].

4.2.1.1. Ловикрилы

Состав и свойства различных смол ловикрилового ряда приведены в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Состав смол ловикрилового ряда.

Компонент	К4М	КИМ	НМ20	НМ23
п -Бутилметакрилат	-	12.2		33.9
1,3-Бутанедиолдиметакрилат	-	4.8	-	5.4
2-Этоксиэтилметакрилат	-	11.2	-	-
Этилметакрилат	-	-	68.5	60.7
n-Гексилметакрилат	9.0	-	16.6	-
2-Гидроксиэтилакрилат	23.7	20.6	-	-
2-Гидроксипропилметакрилат	48.0	41.0	-	-
2-Метоксиэтилметакрилат	-	10.2	-	-
Триэтиленгликольдиметакрилат	13.9	-	14.9	-

Таблица 2. Свойства ловикрилов

Марка	Свойства	Температура инфильтрации,®С
Марка	Свойства			рекомендуемая	минимальная
К4М	Полярная	-35	-43
НМ20	Неполярная	-40	-53
КИМ	Полярная	-60	-63
НМ23	Неполярная	-80	-83

Свойства смол в пределах групп также имеют отличия. Так, КИМ при t=-35®С имеет меньшую вязкость, чем К4М, и соответственно лучше пропитывает объекты. НМ20 при низких температурах менее вязкий, чем КИМ, но не смешивается с этиленгликолем и диметилформамидом. Недостатком ловикриловых смол является отсутствие возможности применения ЧО. Однако при хорошо подобранных условиях контрастирования-можно при этом выявлять нормальную структуру клеточных мембран. Позитивное окрашивание мембран можно получить также с помощью добавления пикриновой кислоты в раствор ГА и заливки в ЛР Вайт [105, 333, 367].

4.2.1.1.1. Состав смол

Ловикрил состоит из компонентов А, Б и В. Для низкотемпературной полимеризации в качестве компонента В (инициатора) используется метиловый эфир бензоина (см. Приложение, 5.1). Компонент В является фотоинициатором УФ-полимеризации. Компонент А осуществляет поперечное "сшивание" основных мономерных цепей компонента Б. Для К4М рекомендуется использовать 1.35 весовых частей компонента А (этот параметр может варьировать от 0.4 до 1.8); 8.6 - Б и 0.05 - В. Для НМ20 эти показатели составляют 1.5 (от 0.5 до 1.7), 85 и 0.05 соответственно. Соотношение компонентов А и Б определяет твердость блока. При добавлении большего количества отвердителя (А) твердость блоков возрастает. При использовании К4М концентрацию отвердителя в некоторых случаях можно поднять до 20 %. Твердость смол КИМ и НМ23 также можно модифицировать [105, 333, 367] (см. Приложение, 5.2-5.4).

4.2.1.2. ЛР-смолы

Семейство заливочных смол ЛР отличается, во-первых, значительной стабильностью под пучком электронов, во-вторых, высокой гидрофильностью, в-третьих, возможностью полимеризации в присутствии воды (до 12 %).

4.2.1.2.1. ЛРВайт

Смола ЛР Вайт выпускается трех видов: твердая, средняя и мягкая. Она полимеризуется под воздействием тепла, УФО, химических инициаторов. В первом случае смола полимеризуется при t=50®С за 24 ч (см. Приложение, 5.5). При этом режиме не происходит полного поперечного сшивания смолы, что важно для иммуномечения.
При использовании химической полимеризации к свежей порции отвердителя и мономера (не старше 3 мес) добавляется по 1.5 мкл ускорителя на 1 мл смеси и тщательно перемешивается в отсутствие кислорода, который ингибирует полимеризацию. Если добавить слишком много ускорителя, то происходит значительное нагревание объекта, что повреждает ультраструктуры и антигены.
По этой же причине не рекомендуется использовать большие капсулы и крупные блоки.
Уже через 7 мин после добавления ускорителя в смоле начинается гелеобразование. Поэтому переносить образцы в капсулы надо очень быстро. Полимеризация заканчивается через 45 мин. Температура во время полимеризации может повышаться до 50-60®С. После полимеризации сверху должно остаться небольшое количество незаполимеризованной смолы. Если этого нет, то скорее всего мономер был частично заполимеризован. Если же большая часть смолы в капсуле или вся смола не заполимеризовалась и стала розовой, то это значит, что в смолу попал кислород.
Если антигены повреждаются при обработке в этаноле, то его можно заменить на ацетон, но дегидратацию следует вести до 100%-ного ацетона, а затем пропитывать объекты по крайней мере в четырех сменах ЛР Вайт, чтобы удалить следы ацетона, поскольку он ингибирует полимеризацию.
В случае заливки объектов быстрым методом при комнатной температуре возможны полимеризационные артефакты, поскольку в ткани остаются реактивные группировки (например, амины), которые независимо от добавленного ускорителя оказывают каталитическое воздействие на полимеризацию смолы. Во время пропитки под влиянием тепла смола вокруг образца частично полимеризуется. Ускоритель в этом случае проникает только в наружную часть блока. Пропитывание осуществляется смесью этанола и г ЗС (1:2) при тщательном перемешивании в течение 30 мин. Для предупреждения ткань-индуцированной полимеризации пропитывание проводят при t < 22®С (4 смены по 30 мин) на вращающемся столике.
Заливку в ЛР Вайт рекомендуют проводить следующим образом. Вначале готовится навеска смолы, которая хранится при t=0®С. Затем точное количество ускорителя (15 мкл на 1 мл) добавляется к смеси, смола быстро перемешивается и разливается в капсулы. Для отвода тепла капсулы со смолой лучше поместить в алюминиевый блок с ячейками, плотно прилегающими к капсулам. Полимеризация продолжается 4 ч при t=0®С в холодильнике. Хранить же капсулы следует в морозильнике (t=-40®С).
Однако при таком способе полимеризации образуется мало поперечных сшивок и УС не будут стабильными под электронным пучком. Требуется дополнительная полимеризация. ПС, полученные от только что заполимеризованных блоков, хорошо метятся с помощью антител и дают хорошее серебряное усиление.
Полимеризация ЛР Вайт с помощью ускорителя легче контролируется, чем под действием УФО. При хранении блоков в течение 6-12 мес качество иммуномечения ухудшается. Блоки, извлеченные из капсул, лучше хранить при комнатной температуре, а блоки в капсулах - в холодильнике. Набухание УС, сопровождающееся образованием складок, усиливается в присутствии детергентов (Твин, Тритон Х-100), которые обычно добавляются к инкубационным растворам [105, 333, 367].

4.2.1.2.2. ЛРГолд

В эту смолу можно успешно заключать образцы больших размеров, чем в ЛР Вайт. Однако толщину кусочков не следует брать большой, если полимеризуются темноокрашенные ткани, такие как печень или селезенка, поскольку полная полимеризация зависит от голубого света, способного проникать только на определенную глубину. Заливать в ЛР Голд можно и нефиксированные ткани [252].
Пропитывание лучше всего проводить в 10-миллилитровых пузырьках с плотно закрывающимися крышками на вращающейся мешалке при t < О®С. Конечная ЗС чувствительна к световому воздействию и должна постоянно находиться в темноте.
Если заливается нефиксированная ткань, то для предупреждения осмотических повреждений в дегидратант добавляют поливинилпирролидон (молекулярная масса 44000). Он растворим в метаноле, воде и в мономере смолы.
Добавление светочувствительного инициатора необходимо для полимеризации заливочной смолы. Рекомендуется применять бензил (альфа-дикетон) в концентрации 0.1 %. Для полимеризации применяют узкие желатиновые или специальные пластмассовые капсулы. В качестве источника света используют кварцевые галогеновые лампы (например, A l/209 FDX, 12 В, 100 Вт). Облучение при напряжении в сети 7-9 В (недонакал лампы) вызывает затвердение смолы в течение 24 ч. Кислород ингибирует полимеризацию, поэтому капсулы надо заполнять (лучше в атмосфере азота) полностью и плотно закрывать.
Если верхняя поверхность после 24-часовой полимеризации остается мягкой, то надо ее срезать или, перед тем как будет удалена желатина облучить капсулы дневным светом в течение нескольких часов. Хранить заполимеризованные блоки на холоде нет необходимости.
Данная заливочная смола может быть заполимеризована и при комнатной температуре. Для этого надо добавить к мономеру 1 % перекиси бензоила (ПБ) или 1.5 % Люперко (60%-ный раствор ПЕ в дибутилфталате). Для ускорения процесса отвердения рекомендуется ввести 1 каплю ускорителя из набора ЛР Вайт на 20 мл смеси ЛР Голд и ПБ. Для отвердения с помощью УФО надо добавлять метиловый эфир бензоина. Точная его концентрация зависит от спектра и мощности УФ-лампы, однако обычная концентрация составляет 0.5 %. Очень важна плотность поперечных сшивок в полимере. Если используемый краситель плохо проникает в смолу, то необходимо уменьшить либо концентрацию ПБ, либо время экспозиции, либо интенсивность потока света (см. Приложение, 5.6) [105, 333, 367].

4.2.1.2.3. Гликольметакрилат (ГМА)

Смешивающаяся с водой заливочная смола ГМА термопластична: полимеризуется линейно без поперечных сшивок между цепочками, а затем расплавляется, если ее нагреть. С целью уменьшения сжатия и, других полимеризационных артефактов кусочки заливают в предполимер ГМА. Для улучшения ультратомирования к нему добавляется n-бутилметакрилат или стирён. Последний может использоваться в качестве дегидратанта [333] (см. Приложение, 5.7).

4.2.2. Активаторы

ПБ является наиболее широко применяемым ускорителем для акриловых смол. Однако процесс полимеризации в этом случае идет медленно и требует повышения температуры. Кроме ПБ в качестве активаторов могут использоваться и другие вещества: некоторые барбитураты, азопроизводные (например, азо-бис-бутиронитрилы).
Для полимеризации ловикрилов при температурах от -35 до -10®С применяется метиловый эфир бензоина, а от -10 до 30®С - этиловый эфир бензоина. Вместо инициатора В используется ПБ (0.5 % НМ20 и 0.3 % К4М) [333].

4.3. МЕТОДЫ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАЛИВКИ

Низкотемпературная заливка используется при трех режимах препарирования объектов: 1) замораживание-замещение; 2) замораживание-высушивание; 3) обезвоживание фиксированных объектов при низкой температуре. Каждая из этих процедур имеет преимущества и недостатки. В первом случае возможна рекристаллизация льда. Во втором может возникать агрегация макромолекул, которые в вакууме осаждаются на ближайшую твердую поверхность: цитоскелет, рибосомы, мембраны. При этом особенно опасен момент проникновения жидкой смолы в сухой образец - капиллярные силы поверхностного натяжения могут повреждать ультраструктуру. Третий вариант предполагает химическую фиксацию при комнатной температуре.
При использовании метода замораживания-замещения пропитывание смолой осуществляется при температуре от -70 до 20®С, а полимеризация - от -70 до -25®С. После замораживания-замещения дегидратант постепенно замещается предварительно охлажденной смолой, которая полимеризуется при низкой температуре под действием УФО.
В случае второго режима препарирования замороженные объекты переносятся в камеру установки для замораживания-высушивания. Этот процесс обычно начинается при t=-90®С и продолжается при t - -70®С в течение 10-12 ч. В последующие 48 ч температура медленно повышается до -40®С. Вакуум в камере поддерживается на уровне 10^-3 Торр. После полного высушивания без нарушения вакуума и изменения температуры объекты пропитываются смолой в течение ночи и полимеризуются при низкой температуре с помощью УФО.
Метод замораживания-высушивания с последующей инфильтрацией в ряде случаев лучше сохраняет структуру тканей. Поддержание низкой температуры и вакуума во время большинства этапов препарирования обеспечивает свободную от кислорода атмосферу и гомогенную инфильтрацию и полимеризацию смолы.
Наиболее широкое применение в настоящее время нашел метод, при котором понижение температуры объекта начинается во время обезвоживания и сохраняется вплоть до отвердения смолы - "низкотемпературная (крио)заливка". Он достаточно прост и обеспечивает сохранность многих антигенов [105, 333].

4.4. АППАРАТУРА ДЛЯ КРИОЗАЛИВКИ

Имеются коммерческие аппараты для низкотемпературной заливки фирмы Бальцерс Юнион (Balzers Union) (Лихтенштейн) и фирмы Неслаб (Neslab) (рис. 4 и 5) Разработаны также упрощенные устройства для этих целей, например на базе ультракриостата МК-70. Крышка ультракриостата изготовлена в виде теплоизолирующего окна из двух слоев оргстекла толщиной 1 мм, разделенных воздушным пространством в 25 мм. Над окном, вне криостата, находится блок из четырех эритемных ламп ЛЭ-15, расположенных в два ряда. Общая мощность источника УФ-излучения составляет 60 Вт при максимуме излучения с длиной волны 310 нм. Расстояние от поверхности стола до середины источника излучения составляет 200 мм. При этих параметрах установки полимеризация блоков происходит в течение 2-3 сут [33, 105].

0x01 graphic

Рис. 4. Приспособление для низкотемпературной полимеризации с помощью УФО. 1 - УФ-лампа; 2 - отражатель УФО; 3 - проволочный держатель для капсул; 4 - желатиновая капсула

0x01 graphic

Рис. 5. Устройство для низкотемпературной полимеризации с помощью галогеновой лампы (для смолы ЛР Голд). 1 - галогеновая лампа; 2 - желатиновая капсула с объектами; 3 - объект; 4 - стекло; 5 - подставка для капсул; 6 - штатив для закрепления элементов системы (по: [105]).

4.5. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ

Процесс обезвоживания сопровождается градуированным снижением температуры. Объекты переносятся из одного раствора дегидратанта в другой с большей концентрацией. Обычно в каждом растворе объекты выдерживаются в течение 15-60 мин. Поскольку акриловые смолы толерантны к небольшим количествам воды, концентрация последнего раствора дегидратанта может быть ниже 100 %. Скорость проводки можно увеличить [105, 367].

4.6. ДЕГИДРАТАНТЫ

Этанол, ацетон и метанол легко смешиваются с ловикрилами, а этиленгликоль и диметилформамид - только с полярными ловикрилами. При использовании ацетона для низкотемпературной заливки следует знать, что при 70 % его точка замерзания соответствует t=-27®С. Кроме того, ацетон поглощает свободные радикалы и тем самым блокирует полимеризацию. Этиленгликоль может применяться в концентрациях менее 90 %, так как температура замерзания его растворов ниже -27®С, 100%-ный этиленгликоль замерзает при t=-12®С. Поэтому чаще всего используются этанол и метанол [105].

4.7. ПРОПИТЫВАНИЕ

После обезвоживания объекты пропитываются растворами с последовательно возрастающими концентрациями заливочных смол в дегидратанте. Поскольку кислород блокирует реакцию полимеризации акрилатов, то перед инфильтрацией рекомендуется пропустить через жидкую смолу азот для удаления растворенного кислорода. При использовании химической полимеризации перемешивание рекомендуется осуществлять только с помощью пропускания сухого азота [85, 333].

4.8. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ С ПОМОЩЬЮ УФО

Ловикриловые смолы полимеризуются под действием УФО с длиной волны 360 нм. Инициация фотополимеризации не зависит от температуры. Внутреннюю поверхность холодильника для полимеризации необходимо покрыть материалом, который отражает УФО, например алюминиевой фольгой. Облучение должно быть непрямым - между лампами и капсулами помещают отражатели, покрытые фольгой. Для лучшего отвода тепла от ламп их рекомендуется размещать снаружи, а в крышке вверху делать отверстия для проникновения УФО. Обычно используются две лампы УФО по 15 Вт, например TDL15W/05 или им подобные. Они должны быть расположены на расстоянии 300-400 мм от капсул. Если источник УФО слабее, то расстояние должно быть уменьшено [85, 105, 333].
Для лучшего проникновения света рекомендуется брать как можно более мелкие объекты. Если применяли ЧО, то смола будет плохо полимеризоваться, поскольку содержащаяся в образце осмиевая чернь поглощает УФО, проникающее в образец. Тот же эффект дают некоторые пигменты. В подобных случаях нужно использовать химическую или тепловую полимеризацию.
Полимеризацию объектов желательно осуществлять в желатиновых капсулах. Можно использовать также полиэтиленовые капсулы (ВЕЕМ-капсулы), прозрачные для УФО. Во время полимеризации капсулы рекомендуется укреплять в проволочном держателе, обеспечивающем равномерное их облучение со всех сторон. Для УФО-полимеризации к смоле добавляется 0.5 % метилового эфира бензоина.
Время полимеризации обычно не превышает 24 ч. Полимеризация К4М и ЛР Голд продолжается 24-36 ч при t=-20®С. ЛР Вайт полимеризуется при t=20®С (с добавлением ароматического третичного ускорителя) или при t=50®С. Обычно после начального периода полимеризации при низкой температуре капсулы переносят для окончательного отвердения под действием УФО в комнатную температуру [85, 105, 155].

4.9. ХИМИЧЕСКАЯ ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ

В случае химической полимеризации избыток ускорителя может нарушить антигенность и вызвать увеличение уровня образования поперечных сшивок. Акриловые смолы могут подвергаться химической и тепловой полимеризации при t=60®С. Для химической полимеризации в качестве инициатора используется ПБ, а активатора - NN-диметиланилин (ДМА). Их количество зависит от температуры. Для К4М при t=-35®С берут 0.4 % ПБ и 0.25 % ДМА, при t=20®С - 0.05 % ПБ и 0.03 % ДМА. Для Н20М при t=-35®С берут 1 % ПБ и 0.6 % ДМА, при t=20®С - 0.08 % ПБ и 0.5 % ДМА. Для тепловой полимеризации (при температуре от 50 до 60®С) к смеси добавляется ПБ: 0.2 % для Ловикрила К4М и 0.5 % для Ловикрила Н20М.
На практике после смешивания отвердителя и мономера смолу делят на две части: к первой из них добавляют ПБ, ко второй - ДМА. Перед самым использованием обе части смешивают - химическая реакция начинается немедленно [105, 333].

4.10. КРИОЗАЛИВКА И ФИКСАЦИЯ

При использовании ФА или смеси ФА и ГА при низких концентрациях (0.05-0.2 %) сохранность ультраструктур вполне удовлетворительна. Требования к условиям фиксации определяются в основном влиянием фиксатора на сохранность антигенов (см. гл. 2). После фиксации объект обезвоживается при низкой температуре в этаноле при возрастающих его концентрациях.

4.11. КРИОЗАЛИВКА, ГИСТОХИМИЧЕСКИЙ И ИММУНО-ЭМ АНАЛИЗ

В настоящее время широко используется низкотемпературная заливка (в Ловикрил К4М или НМ20, ЛР Голд) с последующей обработкой срезов протеазами или нуклеазами. Обработка УС ферментами (проназа, РНКаза, ДНКаза) при рН 6.8-7.0 и концентрации 0.1-1 % при t=37®С в течение 4-24 ч обнаруживается эффективная, специфичная и градуированная экстракция. При этом желательно применять фиксацию ФА или смесью ФА-ГА [300, 333].
После изготовления ПС толщиной 3 мкм и их светооптического анализа их можно перезалить для получения УС. Ловикриловые ПС монтируют на стекла, покрытые поли-Ь-лиэином (1 %-ный раствор полилизина с молекулярной массой 300000). Затем стекла промывают водой, высушивают и хранят до использования. ПС обрабатываются растворами антител, концентрация которых в 10 раз больше таковой для парафиновых срезов. Выбранные участки ПС маркируют. Капсулы заполняют смолой, накладывают на отмеченные участки ПС и полимеризуют. После полимеризации капсулы можно легко отделить от стекла путем быстрого их погружения в жидкий азот.
ПС окрашивают 1%-ным метиленовым синим при комнатной температуре в течение 30-60 с и просматривают в световом микроскопе для определения степени расправления ПС. Если ПС плоский и окрашен однородно, то из него готовят УС. Обычно с каждого ПС можно получить 20-30 УС, которые помещают на никелевые сетки с формваровыми подложками и обрабатывают иммунореагентами [105, 249, 333]. Резание следует лучше проводить с помощью стеклянного ножа.

4.12. АРТЕФАКТЫ, ВОЗМОЖНЫЕ НЕУДАЧИ И ИХ ПРИЧИНЫ

Для низкотемпературной заливки нужно иметь специальное оборудование или низкотемпературную комнату. Осмирование и большие размеры образцов также мешают адекватной полимеризации. Акриловые заливочные смолы в процессе полимеризации образуют двухмерные полимеры и дают большую усадку (часто до 20 %), а УС под влиянием электронного пучка в ТЭМ могут терять до 50 % своей массы. Сморщивание капсул после полимеризации обычно связано с большим количеством остаточной воды в смоле. Присутствие кислорода ухудшает полимеризацию. Использование ЧО при проводке часто повреждает антигены. Поэтому ЧО для фиксации лучше не использовать. Сильно пигментированные образцы абсорбируют ультрафиолет, что приводит к плохой полимеризации блоков. При полной дегидратации образцов антигены могут повреждаться. Поэтому их не следует проводить через 100%-ный этанол, надо прямо инкубировать в 100%-ной мономерной смоле. Вместе с тем повышенное содержание воды нарушает процесс полимеризации акрилата. Если антигены чувствительны к этанолу, то последний можно заменить на ацетон, но дегидратацию следует вести до 100 %-ного ацетона, а затем пропитывать по крайней мере в четырех сменах смолы, чтобы удалить следы этого дегидратанта [300, 333, 367].
Глава 5 УЛЬТРАТОМИЯ
Пучок электронов может проникать только сквозь объекты ограниченной толщины - не более 100-150 нм. При прочих равных условиях чем тоньше срез, тем выше достигаемое разрешение, которое по грубым подсчетам составляет 1/10 толщины среза. Современные методы ультратомии в принципе позволяют получать срезы толщиной 5 нм и, следовательно, позволяют реализовать разрешение порядка OS нм [139, 329, 333, 359].
В литературе имеется довольно много разноречивых терминов для срезов различной толщины. Мы используем следующую классификацию: ультратонкие срезы (ультрасрезы) - УС (толщиной до 100 нм), толстые УС (до 500 нм), полутонкие срезы - ПС (до 2 мкм) и микросрезы (от 25 мкм и более).
Необходимо, чтобы УС соответствовали следующим критериям: 1) содержали исследуемые структуры; 2) их толщина должна быть минимальной и однородной; 3) в УС не должно быть дефектов.

5.1. ЗАТАЧИВАНИЕ БЛОКОВ

Перед началом резания блоки должны быть соответствующим образом заточены. Цель заточки - придать блоку такую форму, при которой кусочек ткани будет резаться наилучшим образом, что позволит получать УС оптимального качества. Наиболее часто блоки затачиваются в форме пирамиды. Оптимальной формой сечения пирамиды является равнобедренная трапеция, реже - прямоугольник или квадрат. Асимметрия приводит к искривлению ленты УС. Необходимо, чтобы основание трапеции было в 15 раза длиннее ее верхнего края, угол между основанием и боковой стороной составлял 85, площадь пирамидки была минимальной, грани - ровными и гладкими, а верхняя и нижняя грани - строго параллельными.
Получение УС большой площади - довольно трудная задача. Лимитирующими факторами в этом случае являются опыт оператора, качество заливочных смол, природа заливаемого материала,

качество ножей. В отдельных случаях можно получить хорошие УС площадью до 4 мм² [105, 139, 333, 359].
Затачивание блока может осуществляться вручную, на специальном приборе - пирамитоме или в самом ультратоме, если в данной модели есть соответствующие приспособления. Опытные ультратомисты предпочитают затачивать блоки вручную (см. Приложение, 6.1).

5.1.1. Ручное затачивание

Для точного ручного затачивания пирамидки на выбранную структуру надо следовать следующим правилам: 1) просмотреть ПС под световым микроскопом (СМ) и зарисовать его с обозначением следов от ножа; 2) блок с препаратом вынуть из ультратома и поместить под стереомикроскоп срезанной поверхностью вверх; 3) поворачивать осветитель и срез до тех пор, пока на срезанной поверхности блока не будут наиболее отчетливо видны детали объекта и следы ножа; 4) обрезать лезвием бритвы те участки препарата, которые не будут исследоваться.
При затачивании вручную пользуются обычными или специальными бритвами и безопасными лезвиями. Перед заточкой со свежего лезвия бритвы желательно с помощью ксилола или ацетона удалить смазку. Держа половинку безопасной бритвы под углом 60® к вертикальной оси, обтачивают одну из сторон блока, затем его поворачивают на 180® и повторяют операцию. В результате получаются две грани усеченной пирамидки. После этого блок поворачивают на 90® и затачивают третью сторону. Бритву держат под углом 60® к вертикальной и 60-70® к нижней грани пирамидки. Так же поступают и с четвертой стороной. Чтобы все грани были гладкими, окончательные срезы нужно делать новым острым лезвием.
Наиболее употребительный способ заточки пирамидок показан на рис. 6. Затачивание на призму производится тогда, когда нужно получить большие по площади срезы. Можно также использовать усеченные пирамидки или усеченные призмы. Для получения УС со многих участков объекта применяют заточку блока способом мезы (рис. 7) [70, 139, 333, 359, 367].

0x01 graphic

Рис. 6. Способ заточки пирамидки при ультратомии, последовательность этапов. А - вид сверху, Б - вид сбоку. 1 - лезвие бритвы (по: [9]).

0x01 graphic

Рис. 7. Заточка пирамидки способом мезы. А-Д этапы заточки; Е - общий вид заточенной пирамидки; Ж - последовательное (а-в) затачивание пирамидок (1) в разных участках объекта.

5.1.2. Механическое затачивание

Механическое затачивание осуществляется на ультратомах или пирамитомах, для этого чаще всего пользуются выбракованными стеклянными ножами. В пирамитомах изображение ПС проецируется на срезанную поверхность блока и заточка ведется с помощью ориентируемого под нужными углами ножа, что дает возможность очень точно располагать блок и затачивать для резания нужный участок плато пирамиды (рис. 8). Полученные на таких аппаратах пирамидки позволяют получать срезы лучшего качества, чем при ручной заточке [70].
После изготовления ПС платформу ножедержателя поворачивают по часовой стрелке на 30® и обтачивают одну из граней, затем платформу поворачивают против часовой стрелки на 30® и повторяют процедуру. Получают две параллельные грани - верхнюю и нижнюю. Нож возвращают в исходное положение, а головку блокодержателя поворачивают на 90® влево и производят обточку. Центральную грань затачивают, повернув головку на 90® вправо относительно центрального положения.
Если нежелательно срезать весь материал образца, то применяют так называемую меза-пирамидку (рис. 7). Для получения серийных срезов через определенные интервалы также используют заточку пирамидки методом мезы. При получении лицевой грани, нож не поворачивают, а только отодвигают в сторону и при затачивании углубляются на 20-30 мкм. Потом поворачивают головку блокодержателя на 90® и повторяют процедуру, предварительно подвинув нож так, чтобы он коснулся будущей боковой грани. Последнюю грань обтачивают аналогичным образом [139, 333, 359].

0x01 graphic

Рис. 8. Схема заточки пирамидки на пирамитоме с помощью проецирования ПС на плато пирамидки. Внизу представлена схема прохождения светового пучка в приборе. 1 - ПС; 2 - пирамидка; 3 - окуляр.

5.2. НОЖИ ДЛЯ УЛЬТРАТОМИИ

Для изготовления УС используются алмазные, сапфировые и стеклянные ножи. Радиус режущего края равен 2 нм как у стеклянных, так и у алмазных ножей. Сапфир и алмаз - очень твердые вещества, однако ножи из них могут повреждаться при изготовлении толстых УС [70, 367].

5.2.1. Алмазные ножи

Лучшие алмазные ножи получаются из ювелирных алмазов. Индустриальные алмазы также используются при изготовлении ножей для ультратомии, однако качество их ниже, так как на режущей кромке могут быть трещины. Алмазные ножи для ПС изготавливают из промышленных алмазов. Стоимость их соответственно в три раза ниже. Алмазное лезвие обычно вклеено в алюминиевую ванночку с помощью эпоксидной пластмассы.

0x01 graphic

Рис. 9. Общий вид алмазного ножа. 1 - режущий край алмаза; 2 - эпоксидное ложе для алмазного кристалла; 3 - ванночка для жидкости.

Качество алмазных ножей, имеющихся в продаже, разное. Цена алмазного ножа составляет несколько тысяч долларов. При небольшой интенсивности работы алмазного ножа хватает на 5-6 лет, затем его нужно перетачивать. Лезвие алмазного ножа обычно можно затачивать не более трех раз. При повторном затачивании угол ножа немного увеличивается, а длина режущего края слегка возрастает. Алмазные ножи являются достаточно тонкими инструментами, поэтому пользоваться ими могут только опытные ультратомисты. При наличии алмазного ножа ультра-том должен быть оснащен хорошей осветительной системой и прецизионной системой подведения ножа [250].
Угол режущего края алмазного ножа может колебаться от 40 до 60®. Обычно ножи с меньшим углом режущего края применяют для резания более мягких блоков. Такие ножи дают возможность получать более тонкие срезы. Ножи с большим углом употребляют для резания более твердых блоков. Оптимальные параметры алмазного ножа указаны в инструкции к нему (рис. 9).
С помощью алмазных ножей можно получать УС из образцов, содержащих твердые включения (кристаллы или волокна асбеста). Алмазные ножи незаменимы при изготовлении серийных УС. Для предупреждения повреждений режущего края лучше использовать малую скорость резания. Край алмазного ножа надо периодически картировать и учитывать каждую новую зазубрину [70, 139, 333, 359].

5.2.1.1. Очистка алмазных ножей

Прилипающие к лезвию алмазного ножа фрагменты тканей ухудшают качество ультратомирования, поэтому нож рекомендуется регулярно чистить. Если край ножа не смачивается водой, то нож выдерживают в течение ночи в 1%-ном растворе Твина-20 или мягкого детергента. Если это не помогает, то следует провести по режущему краю ресницей. Если не удается очистить лезвие с помощью ресницы, то надо применять специальные палочки из пенопласта или мягкого (апельсинового) дерева. Направление чистящих движений должно быть строго параллельным режущему краю (рис. 10). Деревянную или пенопластовую палочку перед этим желательно обмакнуть в 50%-ный этанол или раствор детергента. Поскольку из дерева могут выделяться масла, деревянные палочки, используемые для чистки алмазных ножей, рекомендуется как следует прокипятить или выдержать длительное время в органических растворителях, таких как этанол, ацетон, трихлорэтан и т.п. Перед чисткой лезвие алмазного ножа можно поместить в раствор детергента. Нельзя применять жесткие детергенты, кислоты, щелочи или сильные органические растворители. Надо строго следовать инструкции по чистке ножей. Нож после чистки помещают в специальный контейнер, не дожидаясь его высыхания [70, 139, 333, 359, 367].

0x01 graphic

Рис. 10. Способ очистки режущего края алмазного ножа 1 - алмазное лезвие; 2 - палочка из мягкого дерева или пенопласта, стрелкой показано направление ее движения.

5.2.2. Сапфировые ножи

Сапфировые ножи много тверже стеклянных и значительно дешевле алмазных. Обычно они изготавливаются из синтетических сапфиров длиной 4-6 мм и имеют угол лезвия 45®. Монтируется нож в алюминиевую ванночку, сходную с таковой у алмазного ножа. Сапфировые ножи обычно вновь не перетачиваются.

5.2.3. Стеклянные ножи

Наиболее употребительны стеклянные ножи, которые чаще всего изготавливают с помощью особых устройств, называемых но-жеделателями (knifemaker). При пользовании стеклянными ножами трудно получать УС большой площади. Зато применение стеклянных ножей позволяет подбирать нужный угол режущего края в зависимости от объекта. Минимальный угол ножа, который может быть получен при раскалывании стекла, составляет 45® (рис. 11) [70, 333, 367].

0x01 graphic

Рис. 11. Общий вид стеклянного ножа а - угол режущей кромки ножа, 45®-55®; 1 - свиль; 2 - передняя грань; 3 - режущий край, 4 - лучшая часть ножа.

5.2.3.1. Выбор стекла для ножей

Стекло должно отвечать следующим требованиям: 1) толщина 4.5-6.0 мм (оптимум 5.0 мм); 2) отсутствие пузырьков и других включений; 3) содержание SiО₂ не менее 72-75 % при минимальном содержании железа, полочка стекла шириной 7-10 см должна иметь светло-зеленый или желтоватый оттенок при рассмотрении его с ребра. Лучше использовать "сырое" стекло с равномерным отжигом без значительных поверхностных натяжений.
Для отжига "сухого стекла" его помещают в муфельную печь с терморегулятором. Стекло выдерживают при температуре, близкой к температуре плавления (от 800 до 1000®С) в течение 60 мин. Затем охлаждают со скоростью 1®С в 1 мин до t=250®С. Печь выключают, и стекло остывает вместе с печью до комнатной температуры [70, 139].

5.2.3.2. Изготовление стеклянных ножей

Полоску стекла тщательно моют в детергенте, а затем промывают в проточной воде и высушивают на воздухе. Протирать его лучше батистовой тряпочкой. Чистую и сухую полоску стекла помещают на платформу ножеделателя так, чтобы фабричные зазубрины оказались сверху (при изготовлении ножей с углом 50®) или внизу (для ножей с углом 45®). Одно ребро укладывают вдоль углообразующей пластины, а конец уравнивают по точке-отметке на столе ножеделателя. Опускают струбцину, не придерживая рукой стекло. Прочерчивают риску на стекле. Давление на резец нужно подобрать такое, чтобы риска была достаточно глубокой и в то же время не давала осколков. От правильного выбора давления зависит успех изготовления ножей. Риска должна начинаться от задней грани стекла и не доходить до передней на 1-15 мм. Ручку механизма разлома медленно поворачивают, и стекло раскалывается, отделяя квадрат или ромб. Манипуляции с квадратами удобно осуществлять специальной вилкой, имеющейся в приборе. Квадрат помещают на нижние штырьки прибора и зажимают между двумя скользящими направляющими. В результате раскалывания стекла на квадраты на одном ребре его образуются выщербленки. Для ножей с углом 50® выщербленки должны находиться сверху и слева, для изготовления ножей с углом 45® - снизу и слева. В первом случае поворот стеклянного квадрата осуществляют на 90® против часовой стрелки, во втором - на 180®, но во фронтальной плоскости: верхняя грань становится нижней (рис. 12).
На ручке резака есть приспособление, которое позволяет выбирать длину наносимой риски. Надо опустить струбцину и нанести риску соответствующей длины в зависимости от ширины стекла. Риска должна проходить как можно ближе к диагонали (максимально допустимое отклонение от нее 0.7 мм) и не доходить до одного угла на 1-1,5 мм.

0x01 graphic

Рис. 12. Изготовление стеклянных ножей. А - нож с углом 45®; Б - нож с углом более 45®. 1 - стеклянный квадрат; 2 - риска, нанесенная стеклорезом (2а - для получения квадрата, 26 - для изготовления ножа); 3 - держатели стеклянного квадрата; 4 - стеклянная полоска. Пояснения см. в тексте, с. 77.

Теперь нужно привести в соприкосновение с ближайшим углом стекла специальную демпферную подушечку. Она нужна, чтобы погасить вибрацию двух половинок стекла во время разлома. Слишком прижимать ее не следует, так как она может повредить режущую поверхность ножа, которая располагается как раз в этом месте. В то же время, если давление демпфера было недостаточным, ширина лезвия ножа, пригодного для резки, может оказаться очень короткой (рис. 13).
Ручку разлома следует поворачивать медленно, наблюдая за квадратом стекла. Как только появится трещина вдоль насечки, поворот ручки прекращают. Этот прием обеспечивает нужную скорость разлома стекла. Качество режущих поверхностей ножа зависит во многом от степени прижатия подушечки (рис. 13, А-В) и от скорости разлома стекла, а о последней можно судить по звуку: если звук тихий и нерезкий, то скорость была маленькой, при этом, как правило, качество ножей хорошее, большая скорость разлома сопровождается резким треском. В последнем случае нужно увеличить давление при нанесении риски. В результате разлома квадрата получаются два ножа [70, 139, 333]. Угол стеклянного ножа будет немного больше, чем угол, который имела первоначальная риска. Нельзя получить стеклянные ножи с углом меньше 45®. Более того, в большинстве случаев угол режущего края ножа несколько больше, чем 45®.
Для получения хороших стеклянных ножей необходимо соблюдать следующие правила: нарезать точные квадраты из полосок и разламывать эти квадраты как можно ближе к диагонали.

0x01 graphic

Рис. 13. Зависимость качества режущего края стеклянного ножа от величины прижатия (А-В; лучшее качество достигается в случае Б) стеклянного квадрата. 1 - стеклянный квадрат, 2 - демпферный валик; 3 - держатель.

Чем ближе к углу квадрата проведен раскол, тем более острым и гладким будет край ножа. Чем меньше ширина тыльной (задней) поверхности каждого ножа (лучше менее 0.1-0.2 мм), тем лучше комплементарный нож. Кроме того, такой нож реже дает свили. Напыление вольфрама значительно улучшает качество стеклянного ножа и увеличивает срок его службы до 2-3 недель [162]. Напыляются передняя и верхняя грани Ножа. Данный прием увеличивает теплопроводность в процессе резания, позволяет получать более тонкие УС и в большем количестве, существенно увеличивает длительность пользования ножом, особенно при криоультратомии. Рекомендуемая толщина слоя вольфрама 2 Нм. Направление напыления должно соответствовать биссектрисе угла ножа [70, 139, 333, 359, 367].

5.2.3.3. Оценка качества стеклянного ножа

После того как ножи приготовлены, нужно проверить их качество и выбрать те из них, которые пригодны для получения УС или для затачивания пирамидок. Для оценки ножа его надо поместить в ультратом, большинство которых оснащено специальными приспособлениями для оценки качества ножей. Нож вставляют в держатель ультратома. Включают фокусирующий свет, который, манипулируя световодом или патроном, наводят на режущую поверхность ножа. Обычно имеется специальный узкий перемещаемый источник света. Двигая им, необходимо получить очень узкую полоску отраженного света вдоль режущего края ножа. Сфокусировав микроскоп на режущем крае ножа, начинают медленно вращать нож вперед и назад до тех пор, пока свет не отразится от его режущего края и не станут видны его дефекты. Край "идеального ножа" должен быть очень тонким, прямым и не иметь зазубрин или неровностей.
При правильном изготовлении ножа от левого верхнего угла идет так называемая линия напряжения. Здесь располагается пригодный для резки участок, протяженность которого может быть различной. Дальше следует участок с зазубринами, что делает эту часть ножа непригодной для получения УС. Однако эту часть можно использовать для начального процесса резания. Обычно хорошая режущая часть лезвия начинается почти у самого левого конца и имеет длину от 1/3 до 1/2 от всего режущего края. Самую большую рабочую поверхность имеют ножи с углом 45®. Замечено, что образцы, залитые в Эпон 812, лучше резать ножом с углом 50®. Для криоультратомии используют ножи с углом 45®. Качество ножа определяется оптимальным углом ножа, правильным расположением риски при изготовлении ножа, оптимальной силой нанесения царапины, небольшим и медленным разломом [9, 70, 72, 139, 333].

5.2.3.4. Хранение стеклянных ножей

С готовыми отобранными стеклянными ножами следует обращаться очень бережно и хранить острием вверх в специальном закрытом контейнере, защищающем их от пыли и механических повреждений. Лучше использовать стеклянные ножи вскоре после их изготовления. На сохранность остроты ножа влияет влажность воздуха [160].

5.2.3.5. Ножи Ральфа

Стеклянные ножи применяются и для изготовления больших по площади ПС и микросрезов. С этой целью используются так называемые стеклянные ножи Ральфа с широким лезвием (в честь Пауля Ральфа, который впервые описал новый метод изготовления ножей, но не опубликовал его). Ножи Ральфа очень удобны, поскольку они острее, чем стальные, и проще в изготовлении. Для их получения насечка на верхней поверхности наносится не прямо над линией упора, а смещена от нее на несколько миллиметров. В этом случае поверхность разлома не перпендикулярна к плоскости стекла, а образует изгиб, направленный к линии упора. Лезвие ножа формируется на линии пересечения изогнутой поверхности разлома и поверхности стекла, противоположной насечке. Длина лезвия ограничена в этом случае шириной стеклянной полоски (рис. 14) [70, 160].

0x01 graphic

Рис. 14. Схематическое изображение метода изготовления гистологических ножей
Ральфа.
А - получение ножа с относительно тупым режущим краем; Б - с более острым режущим краем; В - обычный способ раскалывания стеклянной полоски. 1 - упор; 2 - положение риски.

5.3. ИЗГОТОВЛЕНИЕ ВАННОЧЕК

УС собирают на поверхность жидкости, находящейся в специальной ванночке, прикрепленной к стеклянному ножу. Чтобы прикрепить стандартную ванночку, ее одевают на нож, а образовавшуюся щель между ножом и ванночкой заливают расплавленным зубоврачебным воском или парафином. Для этой цели могут быть использованы следующие приемы: 1) кусочек помещенного на дно парафина или воска расплавляют путем нагрева верхней задней стенки ванночки в пламени спиртовки, парафин хорошо заполняет щели между металлом и стеклом; 2) ванночку опускают в расплавленный воск и быстро одевают на нож; 3) кусочек воска или парафина наносят на металлический шпатель, расплавляют его над пламенем горелки и заливают щель с внешней стороны. Парафин и воск нельзя перегревать, поскольку их пары могут попасть на режущую грань ножа. Очень удобно приклеивать ванночки лаком для ногтей. Однако сохнет он дольше.
При повторном использовании готовых ванночек необходимо тщательно очистить их от воска или лака путем погружения в теплую воду или ацетон. Внутреннюю поверхность ванночки следует отмыть особенно тщательно.
Если в распоряжении оператора нет готовых ванночек, то можно изготовить их из липкой ленты. К ленте предъявляются следующие требования: 1) она не должна быть шире 10 мм; 2) ее липкий слой не должен растворяться в воде. Край ленты обрезают под углом 90® и прикрепляют к левой боковой грани ножа. Нож держат в левой руке так, чтобы его режущее ребро было сверху, а режущая грань повернута к оператору. Острый кончик ленты нужно совместить с верхним левым углом ножа. Обернуть нож лентой так, чтобы ее положение было перпендикулярно к передней грани ножа. Делать это нужно осторожно, не прикасаясь к грани (рис. 15) [70, 160].
Плоскость верхнего контура ванночки должна составлять угол 90 0 с передней гранью ножа. Надо соблюдать особую осторожность при обрезании лишнего участка ленты. Необходимо, чтобы верхний угол ленты точно совпадал с уровнем лезвия ножа или был выше его на 05 мм. Ванночка нигде не должна выступать за плоскость ножа, но не может быть и ниже режущей грани. Боковые стенки ванночки должны быть параллельны друг другу, иначе будет трудно получить "зеркальце" на поверхности жидкости. Нижняя кромка ленты на всем протяжении заливается парафином или воском с помощью разогретого скальпеля или шпателя, либо лаком для ногтей и хорошо подсушивается. Для того чтобы сделать очень маленькую ванночку (для 1-2 срезов), на верхнюю поверхность ножа, на 4-5 мм ниже режущего края, наносят 1-2 капли расплавленного воска или парафина [70].
Приготовленный нож в случае его загрязнения при изготовлении ванночки промывают 1-2 раза рабочей жидкостью. Ванночку заполняют до выпуклого мениска, а избыток жидкости осторожным страхиванием удаляют. Для работы с серийными УС разработана специальная приставка к алмазному ножу, которая значительно увеличивает площадь поверхности жидкости в ванночке и содержит специальные пазы-"заводи" для накопления в них лент УС [361].

0x01 graphic

Рис. 15. Способ изготовления ванночки из липкой ленты. А - наклеивание кусочка ленты (1) на нож (2); Б - подрезание выступающих концов ленты лезвием бритвы (3) и нанесение расплавленного воска (4) с целью герметизации ванночки; В - общий вид готового ножа с ванночкой.

Для заполнения ванночки чаще всего используется бидистиллированная вода. Если жидкость не смачивает нож, то можно добавить 0.05 % Твина-20 или детергента Фото Фло (Photo Flo). Чтобы срезы не загрязнялись микроорганизмами или их остатками, желательно использовать только стерильную или свежепрокипяченую воду. Ванночку нельзя заполнять водой из системы ионообменников. В ряде случаев для улучшения смачиваемости используют 1-10%-ные растворы этанола или ацетона. Превышение указанной концентрации может повредить эпоксидный клей, используемый для приклеивания алмазного ножа к держателю. Кроме того, эти растворы способны вымывать некоторые компоненты среза [70, 160].

5.4. УЛЬТРАТОМИЯ

При ультратомии начинающему оператору следует обратить внимание на следующие детали: 1) правильное приготовление пирамидки; 2) надежное крепление ножа и пирамидки в держателях; 3) поддержание правильных взаимоотношений пирамидки и режущей кромки ножа (параллельность нижней грани пирамидки и режущей кромки ножа и т.д.); 4) соблюдение формы мениска жидкости. При изготовлении УС необходимо самое пристальное внимание уделять чистоте. Ножи легко повредить, поэтому манипулировать ими нужно очень осторожно. Загрязнить режущую хорошую часть можно даже дыханием.
При ультратомировании могут иметь место три процесса (см. ниже, разд. 5.4.7, рис.18): 1) резание лезвием (если нож достаточно острый), 2) раскалывание (если угол ножа увеличивается), 3) соскабливание (если угол ножа очень велик) [70, 328].

5.4.1. Ультратомы

Основные черты всех современных ультратомов следующие: 1) сверхтонкая механическая, пьезоэлектрическая или тепловая подача; 2) прецизионная ориентация образца; 3) наличие грубой подачи для подведения образца и получения ПС или микросрезов; 4) возможность контроля за скоростью резания; 5) удаление ножа при обратном ходе объекта; 6) возможность прецизионного освещения и наблюдения за процессом резания. Ряд ультратомов имеют приспособление для автоматического приближения и удаления образца от ножа [56].

5.4.2. Общие правила работы на ультратомах

Работа ультратомов требует механической и термической стабильности. Воздух должен быть чистым и иметь постоянную влажность. Ультратомы лучше ставить далеко от входа в лабораторию в огороженном пространстве. Перед началом резания рабочее место надо протереть влажной тряпкой. Все типы ультратомов очень чувствительны к механическим сотрясениям и колебаниям температуры окружающей среды. Каждая модель ультратома имеет свои особенности управления, с которыми можно ознакомиться
в инструкции к прибору.
Чтобы получить очень тонкие УС, надо соблюдать ряд правил: 1) режущий край ножа необходимо поддерживать высокого качества (проверяется при большом увеличении и хорошем освещении); 2) угол наклона - не более 3-4; 3) скорость резания - оптимальная; 4) пропитывание и полимеризация также должны быть оптимальными; 5) ультратом необходимо тщательно отладить и все возможные источники вибраций устранить; 6) площадь пирамидки свести к минимуму - не более 0.1 мм ; 7) лезвие ножа и поверхность пирамидки должны быть параллельны; 8) твердые блоки лучше резать алмазным ножом, мягкие - стеклянным; 9) верхняя и нижняя грань пирамидки выдерживаются строго параллельными.
Подробная инструкция для работы на ультратоме прилагается фирмой-изготовителем, а представители фирмы демонстрируют приемы работы на этом приборе при его установке. Весь процесс изготовления УС может быть разбит на следующие этапы: установка образца, установка ножа, подведение ножа, получение первого УС, резание, собирание УС [70, 160, 328].

5.4.3. Установка объекта

После полимеризации надо дать блокам 2-3 сут полежать при комнатной температуре. Закреплять блок в держатель нужно глубоко, чтобы из него выступало не более 2-3 мм. Метакрилатные блоки (да и остальные тоже) лучше закреплять в держателях за 2-3 сут до резания из-за возможной деформации.

5.4.4. Ориентация блоков

Созданы различного типа держатели для точной ориентировки образцов во время заливки и ультратомии. Для проведения вторичной ориентации образца кусочек пластика с заключенным в нем объектом вырезается и, если расположение структур в объекте известно, кусочку придается нужное расположение, затем он приклеивается к тому же блоку. Если расположение структур неизвестно, то вначале с помощью ПС выясняют ориентацию объекта.

5.4.5. Установка и подведение ножа

Нож устанавливается таким образом, чтобы его лезвие было параллельно плоскости пирамидки. Для того чтобы исключить трение блока по передней поверхности ножа, последний должен быть слегка наклонен, обычно под углом 4, при использовании алмазного ножа необходимый угол наклона указан в фирменной инструкции. Затем нужно подвести нож как можно ближе (менее 1 мм) к пирамидке, избегая, однако, контакта. Для этого используют как тонкую, так и среднюю подачу. Надо следить за тонкой
щелью между пирамидкой и ножом. Нож следует передвинуть
вбок так, чтобы блок был против хорошей части режущей кромки
ножа. Нижняя грань пирамидки должна быть параллельной режущему краю. Далее необходимо установить нож перпендикулярно к оси пирамидки и добиться (поворачивая блокодержатель вокруг своей оси и в головке ультратома, а если надо - и головку ультратома), чтобы нижняя грань пирамидки стала параллельна режущему краю ножа. Контроль следует осуществлять под стереомикроскопом. После этого надо закрепить блокодержатель и головку блока. На некоторых ультратомах при правильном положении источника света тень от ножа проецируется на поверхность блока,
что видно с помощью стереомикроскопа. При движении ножа вперед тень уменьшается [70, 139, 160, 328].
Кроме того, пирамидку надо установить так, чтобы она была параллельна плоскости резания. Для этого необходимо проследить за щелью между поверхностью блока и ножом при движении пирамидки вниз - если ширина щели не изменяется, то нож установлен правильно, в противном случае следует переориентировать пирамидку по отношению к ножу в вертикальной плоскости. Во время процедуры переориентации объекта нож должен быть отведен от блока [70, 160].
При помощи микроподачи надо приблизить нож к объекту как можно ближе. Осуществлять подачу следует под контролем светового микроскопа и с хорошим освещением, до тех пор пока это расстояние не будет составлять около 1 мм или меньше. Необходимо зафиксировать кронштейн ультратома, затем следует поднять (или опустить) всю головку с объектом таким образом, чтобы уровень ножа соответствовал примерно середине блока, и освободить стержень. После этого надо поднять стереомикроскоп до удобного для оператора положения и, направляя луч света на нож и покачивая блок от руки с помощью механизма ручного резания, увидеть световой блик, отражающийся от блока (рис. 16). При постепенном приближении ножа к блоку блик сужается и превращается в неширокую линию. Затем производится совмещение по вертикали кончика пирамидки объекта и лезвия ножа (при совмещении они фокусируются в одной плоскости) [70, 160].
Теперь надо налить рабочую жидкость (воду) в ванночку (мениск в это время должен быть вогнутый). Заполнение ванночки осуществляют с помощью специального устройства или шприца до образования выпуклого мениска. При этом жидкость смачивает лезвие ножа. Затем часть жидкости удаляется до появления на ее поверхности в районе лезвия ножа блика отраженного света от осветителя, расположенного впереди ножа под углом приблизительно 45® к вертикали. Край ножа обязательно должен быть смочен. Если этого нет, то надо воспользоваться ресницей и покрыть его водой.

0x01 graphic

Рис. 16. Установка светового блика по поверхности жидкости в ванночке (по: [9]). А - вид сбоку; Б - вид сверху. 1 - правильное положение осветителя;. 2 - неправильное его положение; 3 - правильная локализация блика для наблюдения УС; 4 - пирамидка; 5 - режущий край ножа; 6 - осветитель;

Наливать воду в ванночку лучше при опущенном кронштейне с блоком. Свет, падающий на поверхность жидкости вблизи лезвия ножа, отражается, образуя белую дорожку отраженного света "зеркальце". Высоту уровня жидкости можно изменять. Однако уровень жидкости не должен быть слишком низким, поскольку в этом случае быстро высохнет лезвие ножа. Если нож плохо смачивается, то вместо воды можно применить 10%-ный этанол или ацетон. Однако в этом случае надо более внимательно следить за уровнем жидкости [70, 160]. Выпуклый мениск часто ведет к тому, что жидкость начинает стекать по передней стороне ножа. Если это произойдет, то нужно остановить ультратом, немного отвести нож и кусочком фильтровальной бумаги с острым краем очень осторожно промокнуть каплю на передней поверхности ножа. Затем процесс получения первого среза повторяется. Слишком низкий (вогнутый) мениск может привести к ухудшению процесса резания [70, 160].

5.4.6. Начало резания

Механизм подачи объекта следует включать после того, как будет сделан первый толстый срез. Если необходимо использовать первые срезы, то микроподачу надо включить за несколько микрометров до контакта образца и ножа. После получения нескольких контрольных срезов толщиной 80-90 нм уменьшают подачу (обычно нагрев) до нужного (контролируя по цвету срезов), закрывают нож и ванночку специальной прозрачной коробочкой и производят ультратомирование. В ультратомах, где используется тепловая подача образцов, толщина УС соответствует шкале в первые 15 мин, затем надо либо увеличить нагрев, либо остановиться и, включив вентилятор, дать стержню остыть в течение 20-30 мин.

0x01 graphic

Рис. 17. Способ резания объектов (1) с анизотропной (ориентированной) внутренней структурой, длинная ось которых должна располагаться перпендикулярно к режущему краю (2).

Начинать резание надо средней третью ножа, а затем, когда пойдут хорошие УС, аккуратно передвинуть нож таким образом, чтобы продолжать резание самой лучшей частью его режущего края. Передвигать нож следует очень осторожно, чтобы не срезать толстого куска ткани. При резании волокнистых ориентированных структур их Длинная ось должна располагаться перпендикулярно к режущему краю ножа (рис. 17). При затачивании пирамидки для лучшей ориентации рядом с интересующей структурой можно нанести тонкой иголкой точку на срезанной поверхности и в дальнейшем использовать эту метку в качестве ориентира [70, 160]. При изготовлении УС с монослоя клеток часто требуется уже первый срез изготовить нужной толщины, для этой цели существуют специальные методы. Вначале надо добиться, чтобы плоскость пирамидки была строго вертикальна и параллельна режущему краю. При этом дугообразный держатель головки с образцом устанавливают в вертикальном положении, и головку с образцом закрепляют в нем таким образом, чтобы длинная ось пирамидки была горизонтальной. Поворачивая держатель ножа, режущий край располагают строго параллельно плоскости пирамидки, угол наклона ножа должен быть равен 0. Осветитель закрепляют почти под прямым углом к верхней грани ножа с тем расчетом, чтобы в стереомикроскоп был виден яркий блик от передней грани ножа. Пирамидку опускают несколько ниже режущего края, и нож медленно и очень осторожно подводят к ней до касания передней гранью. Если плоскость пирамидки расположена в вертикальном положении, то на блике появляется трапециевидной формы темное пятно, соответствующее полному контакту плоскости пирамидки с передней гранью ножа. Напротив, если плоскость пирамидки не вертикальна, то на блике образуется тонкая полоска касания ее ребра с передней плоскостью ножа. В этом случае надо изменить угол закрепления головки с образцом в дугообразном держателе и повторить процедуру, последовательно добиваясь того, чтобы плоскость пирамидки и передняя грань ножа были параллельны друг другу.
Более простой является оценка параллельности пирамидки и передней грани ножа по изменению толщины тени, отбрасываемой ножом на плоскость пирамидки. Для этого объект устанавливают таким образом, чтобы режущий край находился на уровне середины пирамидки. Затем нож подводят к пирамидке почти до касания. При определенном положении стереомикроскопа и осветителя видно, что режущий край отбрасывает тень на плоскость пирамидки. В этом положении очень осторожно и медленно опускают пирамидку, следя за толщиной тени. Если она уменьшается, то верхняя грань пирамидки расположена ближе к вертикальной плоскости, проходящей через режущий край, чем нижняя, а если увеличивается, то наоборот. Теперь точно так же надо соответствующим образом изменить угол закрепления головки с образцом в дугообразном держателе и всю процедуру повторить вновь [125].
Наконец, можно дугообразный держатель вместе с блокодержателем и пирамидкой повернуть точно на 90®. Режущий край ножа установить строго перпендикулярно оси кронштейна (положение "0" на вращающемся столике). Перемещая дугообразный держатель в своем креплении, добиваются, чтобы край ножа и плоскость пирамидки были параллельны. После чего дугообразный держатель поворачивают на 90® в исходное положение и вновь, на этот раз путем поворота ножа, добиваются параллельности режущего края и плоскости пирамидки, а затем начинают резание.
Для получения первого УС нужной толщины после ориентации пирамидки вначале нож подводят максимально близко к объекту, но касаться пирамидки ни в коем случае нельзя. Далее включается движение объекта и с помощью ручной ультраподачи начинается подведение ножа к объекту. При этом поворачивать ручку надо на величину, которая соответствует нужной толщине УС.
При работе на ультратоме надо помнить: 1) закрепление и ориентировка объекта производятся только при закрытом положении объектного стержня; 2) вертикальное совмещение объекта и ножа осуществляется после установки последнего на уровне планки ножевого столика (лезвие ножа должно совпадать с верхней горизонтальной плоскостью планки); 3) в случае несимметричного перемещения объектного стержня относительно лезвия ножа может происходить захват жидкости и срезов из ванночки ножа при обратном ходе объекта [70, 160].

5.4.7. Скорость резания

Скорость резания имеет чрезвычайно важное значение для получения хороших УС. Обычно при использовании алмазных ножей применяют скорость 1 мм/с, для стеклянных ножей более подходит скорость 2 мм/с. При этом надо учитывать твердость и ориентацию структур в блоке, угол и остроту ножа, его наклон, толщину срезов (рис. 17 и 18). Хотя обычно считается, что более твердые образцы лучше режутся при более низкой скорости (1 мм/с или ниже), однако некоторые образцы, такие как кость или зубы, лучше режутся при более высокой скорости (5-10 мм/с). В случае, если объект режется плохо, рекомендуют последовательно изменять параметры резания и постепенно подобрать наиболее оптимальные, что позволит получить УС удовлетворительного качества [70, 160].

0x01 graphic

Рис. 18. Процессы, происходящие с объектом при резании ножами с различными углами лезвия ( а ) и резания (е ). А - ? < 45®, ? от 2 до 4®: происходит резание; Б - 45® < ? <50®, ? от 4 до 7®: скалывание; В - ? > 50®, ? > 10®: соскабливание. 1 - пирамидка, 2 - нож.

5.4.8. Способы расправления УС

В процессе резания происходит сжатие УС. При высокой скорости этот эффект увеличивается. Даже в самых оптимальных условиях сжатие УС достигает 5-10 %. Его можно устранить, если над УС в течение 4-8 с подержать стеклянную палочку или кусочек фильтровальной бумаги, смоченные хлороформом или ксилолом, пары которых размягчают и расправляют срезы. Для расправления срезов удобно пользоваться также петлей для вылавливания ПС. Петлю опускают в ксилол и быстро вынимают. Затем петлю подносят к срезам. Через прозрачную каплю ксилола прекрасно видно, как расправляются УС. Пары хлороформа могут повреждать УС. Нельзя допускать попадания растворителя в ванночку. Пользоваться этими приемами следует лишь в крайних случаях. Вместо органических растворителей можно воспользоваться нагретой стеклянной палочкой или раскаленной электрическим током петлей, которые подносят сверху к срезам. Процесс расправления можно контролировать под стереомикроскопом. Однако нельзя допускать слишком сильного нагрева срезов. При расправлении срезы меняют окраску и увеличивают свою площадь. УС могут растянуться больше, чем необходимо, при этом повреждается структура тканей [70, 160].

5.4.9. Определение толщины УС

После расправления УС определяют их толщину, так как показания шкалы ультратома "толщина срезов" достаточно грубые и, как правило, недостоверные. Более точная оценка толщины УС (в нанометрах) может быть сделана по цвету интерференции.
Грубая шкала: серые - ниже 60, серебристые - 60-90, золотые - 90-150, пурпурные - 150-190, синие - 190-240 нм.
Точная шкала: серые - 31-32, белые - 39-40, серебристые - 54, желтые - 70, золотые - 90-91, коричневые - 108-109, красно-коричневые - 128-129, фиолетовые - 148-149, голубые - 180-181, желто-зеленые - 215-216 нм.
Чрезвычайно тонкие УС толщиной менее 30 нм часто рассмотреть не удается - они названы "невидимыми". Существует много других способов более точного определения толщины УС [129, 359].

5.5. СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА БЛОКОВ

Если УС получаются с трудом, то необходимо заточить пирамидку до очень маленького плато треугольной формы, что существенно облегчает получение УС. С маленькой трапециевидной пирамидки УС также получить легче, чем с большой. Для удлиненных структур лучше использовать пирамидки, вытянутые по направлению резания. Если образцы имеют зоны разной твердости, то рекомендуется ориентироваться на более твердые участки. Во время затачивания пирамидки можно оценить качество самого блока. Даже мягкий блок следует попробовать резать, но если УС получаются плохие, то рекомендуется заточенный блок подержать при t=60®С ночь или дольше. Ловикриловые блоки можно подвергнуть УФО, иногда это помогает. В некоторых случаях блок можно перезалить в другую порцию смолы.

5.6. СОБИРАНИЕ УС

После получения достаточного количества срезов их собирают в группы, чтобы при монтировании они попали в центр сеточки. Плохие срезы удаляют с помощью ресницы. Если лента срезов прикреплена к ножу, то ее лучше отделить ресницей, дотронувшись ею до поверхности среза. Сеточку осторожно захватывают пинцетом за край. Пинцет зажимают резинкой. Существует ряд методов взятия УС с поверхности жидкости в ванночке (рис. 19 и 20).

0x01 graphic

Рис. 19. Способы взятия УС на сеточку. А - прикосновение сеточкой к УС сверху (А1 - неправильное положение сеточки, А2 - правильное положение); Б - подведение сеточки снизу. В - боковое прикосновение к ленте УС вертикально погруженной в жидкость сеточкой (В1 и В2 -этапы взятия УС). 1 .- УС, 2 - сеточка, 3 - пинцет. Стрелка - направление движения сеточки.

1. Сеточка, установленная строго горизонтально точно над срезами, движется вниз до прикосновения к УС и затем поднимается вверх (рис. 19, А). Технически это осуществляют следующим образом. Мениск жидкости в ванночке делают горизонтальным или слегка выпуклым. Выбирают группы хорошо расправленных УС, которые с помощью ресницы собирают в центре отраженного блика. Сеточку подложкой вниз закрепляют в пинцете и подносят к выбранной группе срезов параллельно последней. Затем быстро касаются сеточкой срезов (погружать сеточку в жидкость нельзя) и отрывают ее от поверхности воды. В результате УС оказываются покрытыми каплей жидкости, которую аккуратно удаляют фильтровальной бумагой путем прикосновения к краю сеточки. Этот способ не очень эффективен. Возможно наложение срезов, образование нахлестов и складок.
2. Сеточка погружается в жидкость, подводится под ленту УС в горизонтальном положении, и поднимается вверх (рис. 19, Б). В этом случае УС оказываются плавающими на капле жидкости, оставшейся на сеточке. Жидкость аккуратно отсасывается фильтровальной бумагой.
3. Сеточка погружается в жидкость в вертикальном положении. Ее край находится рядом с краем ленты УС, который приводится в контакт с сеточкой, чему можно помочь, двигая УС с помощью ресницы (рис. 19, В). Вначале опускают сеточку на 2/3 в жидкость вертикально немного в стороне от ленты срезов. Придерживая ресницей край ленты сверху (если сбоку, то срезы прилипнут к реснице), подводят сеточку под срезы до тех пор, пока ближайший к пинцету слегка выступающий из воды край сеточки не коснется крайнего среза. Осторожно поднимают сеточку вертикально - за ней вытягиваются и срезы. При поднимании сеточки УС прикрепляются к ней [70, 160, 333].

0x01 graphic

Рис. 20. Способ взятия УС (1) с помощью проволочной петли (2), и монтирование УС на бленду (3) под стереомикроскопом (4).

Можно УС, не образующие ленту, поместить на сеточку при помощи платиновой петли, которой вначале и захватывают срезы (рис. 20, 1 и 2). Для этой цели используются петли диаметром немного больше сеточки. Петлю ориентируют сверху над срезами, затем опускают на них и срезы оказываются заключенными внутри петли, после этого ее поднимают и капля воды со срезами отрывается от жидкости. Петлю ориентируют над лежащей на фильтровальной бумаге сеточкой и опускают до тех пор, пока срезы не покроют поверхность сеточки с подложкой.
Наконец, для точного помещения УС на сеточку готовят металлическую петлю диаметром чуть больше сеточки, которую покрывают формваровой подложкой (см. гл. 7). Ленту срезов вылавливают на петлю, подводя ее под срезы. Затем под микроскопом сеточку подводят под петлю и ориентируют так, чтобы срезы оказались над нужным участком сеточки, которая располагается на столбике. Петлю опускают, и сеточка как бы продавливается сквозь петлю. Срезы оказываются на сеточке. При работе с серийными УС вместо сеточки лучше использовать бленду - лента срезов точно помещается над ее отверстием (рис. 20, 3).
В качестве рабочей жидкости для заполнения ванночки можно использовать слабый (0.2%-ный) раствор желатины. При его охлаждении срезы становятся неподвижными. На срезы помещают сеточку, к которой они прилипают, а затем раствор желатины подогревают до t=60®С. Остатки желатины удаляют, помещая сеточки с УС в каплю 2%-ной уксусной кислоты на 30 мин. Потом срезы помещают на 30 мин в Трис-буфер (рН 7.1), далее промывают в воде. Все процедуры проводят при t=60®С.
Формваровую подложку лучше помещать на гладкую сторону сеточки (подложка не будет коробиться). Однако в этом случае манипулировать сеточкой сложнее, так как УС плохо видны в отраженном свете. Напротив, если подложка и УС расположены на матовой стороне сеточки, то они хорошо видны в отраженном свете [70Т 139, 160].

5.7. ПРОБЛЕМЫ УЛЬТРАТОМИИ, ИХ ПРИЧИНЫ И СПОСОБЫ УСТРАНЕНИЯ

УС не видны. Причины: 1) некорректный угол освещения; 2) неправильный уровень жидкости в ванночке; 3) несоответствующий угол наблюдения.
УС не образуются. Причины: 1) ультратом исчерпал всю подачу; 2) тупой нож; 3) блок слишком мягкий; 4) нож или блок плохо закреплены в держателе или в головке; 5) отрицательный угол наклона ножа; 6) смачивание поверхности блока; 7) вибрация; 8) температурные флюктуации; 9) инструментальные дефекты.
Нерегулярное резание - срезы образуются не при каждом ходе объекта или УС получаются регулярно, но толщина их варьирует. Причины: 1) слишком велик угол наклона ножа; 2) плохо закреплен нож или блок; 3) тупой нож; 4) блок плохо заполимеризован.
Рекомендации: 1) вначале нужно увеличить подачу объекта, тогда срезы будут толще; 2) если толщина УС не удовлетворяет, то можно попытаться вновь заточить пирамидку, уменьшив площадь левой грани блока; 3) если и это не помогает, оставить блок на ночь при t=60®С.
Искривленная полоска УС - в результате УС легко теряются во время монтирования и могут образовывать складки. Причины:
1) плохо заточенная пирамидка (грани, полученные при заточке
блока старым лезвием, шероховатые; верхняя и нижняя грани не
параллельны или имеют зазубрины); 2) одна часть режущего края
алмазного ножа использовалась чаще, чем другие; 3) плохое вы-
равнивание стеклянного ножа по отношению к пирамидке; 4) ре-
зание дефектным ножом; 5) неодинаковая твердость разных участ-
ков блока; 6) сжатие одной из сторон среза.
Рекомендации: 1) необходимо остановить резание; 2) если мениск жидкости слишком высокий и УС отрываются от ножа, не успев соединится со следующим, то надо убрать немножко жидкости из ванночки.
Разорванная лента УС - в результате некоторые УС могут быть потеряны, что нарушает последовательность серийных УС. Причины: 1) плохо заточенная пирамидка (верхняя и нижняя грани не параллельны); 2) нож не параллелен нижнему краю пирамидки; 3) пирамидка слишком высокая; 4) уровень жидкости в ванночке слишком высок.
УС не образуют ленту. Причины: 1) верхний и нижний края пирамидки не параллельны между собой и лезвием ножа; 2) неправильный уровень жидкости; 3) скорость резания слишком мала; 4) образование статического заряда на пирамидке; 5) шероховатые грани пирамидки, полученные при заточке блока поврежденным лезвием (если верхняя грань параллельна ножу, а нижняя нет, то ленточка УС может образоваться, но будет прикрепляться к какой-нибудь стороне ванночки и последующие УС будут сморщиваться); 6) мениск жидкости слишком высокий (срез отрывается от ножа, не успев соединится со следующим); 7) нож закреплен слишком низко; 8) угол наклона и угол ножа малы.
УС не отрываются от кромки ножа и не попадают в ванночку, а увлекаются вслед за блоком. Причина - мягкий блок (УС не полностью отрываются от блока).
Рекомендации: 1) увеличить угол наклона ножа и(или) угол режущего края; 2) увеличить скорость резания; 3) понизить мениск, удалив немного жидкости из ванночки.
УС захватываются пирамидкой при обратном движении ножа. Причины: 1) уровень жидкости в ванночке слишком высок;
2) угол резания мал; 3) недостаточная скорость резания; 4) мягкий образец; 5) поверхность блока грязная или влажная; 6) нож
грязный или ,его передняя поверхность влажная; 7) на поверхности блока образовался статический заряд.
Рекомендации: в последнем случае надо увеличить влажность в комнате; кроме того, статическое электричество, накапливающееся на срезах в результате трения ножа о блок ткани, может быть удалено ионизацией воздуха при помощи радиоактивного источника или созданием вблизи ножа поля высокого напряжения, можно применять ртутно-кварцевую лампу, которой локально освещается режущийся участок блока, или ионизировать воздух ионизаторами Микулича либо бытовыми ионизаторами.
Смачивание поверхности блока обусловлено тем, что поднимающийся во время резания блок, касаясь ножа, захватывает каплю жидкости из ванночки. При этом полученные срезы устремляются за каплей; в последующий цикл все повторяется. Иногда при этом вообще невозможно получить срез. Данный дефект возможен только при работе с ультратомами, у которых при обратном ходе блок пересекает кромку ножа (например, LKB). Подобное чаще наблюдается при резании больших пирамидок (более 2 мм ).
Причины: 1) смачивание поверхности пирамидки или передней поверхности ножа; 2) уровень жидкости в ванночке слишком высок; 3) скорость резания низка; 4) угол резания мал; 5) не работает устройство отведения ножа при обратном ходе; 6) загрязнение пирамидки, 7) неправильная установка ножа по высоте.
Рекомендации: из ванночки надо убрать лишнюю жидкость, фильтровальной бумагой осушить блок и переднюю грань ножа. Некоторые блоки никак не удается порезать при низких скоростях. Вода из ванночки все время попадает на лицевую поверхность блока. Тогда нужно осушить поверхность блока, увеличить скорость резки, а затем, когда началась резка, снизить скорость.
Очень толстые УС. Причины: 1) образец или нож плохо зажаты в держателе; 2) скорость ультратома слишком мала; 3) тупой нож; 4) неподходящий угол ножа (большой); 5) неправильно выбрана подача объекта; 6) сквозняк в комнате; 7) неудачная полимеризация.
Рекомендации: надо изменить параметры резания, поставить блок в термостат на ночь при t=80®С, а затем (или сразу) поместить блок в холодильник и сделать несколько первых УС.
Толщина УС варьирует. Причины: 1) тупой нож; 2) падение электрического напряжения в сети; 3) неисправность ультратома; 4) сквозняки и температурные флюктуации; 5) плохо закреплен нож и(или) объект; 6) блок слишком мягок или велик; 7) неподходящая скорость резания; 8) неправильный угол ножа.
УС идут через цикл, т.е. один ход блока вниз дает срез, а следующий не дает или один срез слишком толстый, а следующий слишком тонкий, затем опять толстый и т.д. Это явление одного порядка. Причины: 1) плохо подобран угол резания; 2) неподходящая скорость резания; 3) неправильное соотношение угла и скорости резания; 4) тупой нож; 5) излишне мягкая заливка; 6) слишком маленькая подача.
Рекомендации: иногда эту трудность можно ликвидировать, если увеличить микроподачу; в противном случае необходимо изменить угол ножа, скорость резания или и то и другое.
Варьирование толщины в пределах одного УС. Участки разной толщины на УС в световом микроскопе (СМ) выглядят полосами разного цвета. Причины: 1) большой ободок чистой смолы вокруг образца - перезаточить блок; 2) если полосы перпендикулярны ножу, то причина их появления в ноже; 3) если участки с разной толщиной не имеют определенной направленности, а располагаются хаотично, то в блоке остались участки плохо заполимеризовавшейся смолы - нужно перезаточить блок и уменьшить площадь срезаемой поверхности; 4) если утолщенные участки располагаются параллельно режущей кромке ножа, то они могут быть вызваны вибрацией.
Спонтанная подача. Толщина получаемых УС превышает величину, указанную на приборе, или происходит резание при выключенной подаче. Причины: 1) выталкивание блока из блокодержателя в результате неправильного закрепления блока или несоответствия толщины блока и блокодержателя.
Рекомендации: зажимать блок в блокодержателе за несколько часов до резания.
Складчатость УС - УС складываются или морщатся на краю ножа. Причины: 1) уровень жидкости в ванночке слишком мал; 2) образец очень мягкий; 3) загрязнен край ножа; 4) скорость резания велика; 5) поверхность пирамидки слишком большая; 6) тупой нож; 7) угол резания велик; 8) нож плохо закреплен; 9) неправильный угол ножа; 10) слишком большое скопление УС на поверхности жидкости.
Складки только в каком-то определенном участке среза. Причины: 1) плохая пропитка тканей; 2) неравномерная полимеризация.
Рекомендации: 1) заточить новую - меньшего размера пирамидку из хорошо залитой части материала.
"Раскалывание" УС ножом. Причина - слишком хрупкая и твердая заливка, резать такие блоки трудно. Рекомендации: 1) попытаться резать, изменив угол ножа или изготовив нож с углом 55®; 2) подобрать адекватную скорость резания.
Смещение частиц ножом. Какие-либо плотные частицы (например, ферритин) разносятся по срезу ножом и встречаются порой в самых неожиданных местах. Причина - сжатие плохо полимеризованного материала.
Загрязнение УС. Причины: 1) нож не закрыт; 2) грязная ванночка.
Рекомендации: при резании (особенно серий УС) нож и ванночку следует прикрывать специальной крышкой.
Сжатие УС. Причины: 1) образец слишком мягкий; 2) неадекватное расправление; 3) скорость резания велика.
Рекомендации: изменить скорость резания или расправить участки сжатия парами органического растворителя (хлороформ, ксилол).
Следы от дефектов ножа. Зазубрины направлены перпендикулярно к краю ножа и волнам так называемого четтера (chatter).
Алмазный нож. Причины: 1) используется область ножа с дефектом; 2) неосторожные манипуляции с ножом, например при чистке; 3) слишком толстый первый УС; 4) высокая скорость резания (более 1 мм/с); 5) очень большой образец (более 1 мм ); 6) велик угол режущего края ножа; 7) появляющиеся внезапно зазубрины могут быть следствием твердой частицы, выпавшей из среза и оставшейся на лезвии ножа.
Стеклянный нож. Причины: 1) плохое качество режущего края; 2) неправильное выравнивание ножа и пирамидки - одна часть ножа становится тупой и начинает оставлять след; 3) плохая подводка ножа, толстый первый срез; 4) образец слишком твердый, чтобы его резать стеклянным ножом; 5) режущий край поврежден лезвием бритвы при изготовлении ванночки.
Следует отметить, что совсем без царапин срезы получаются редко. Все дело в величине этих царапин. Царапины, идущие перпендикулярно к острию ножа и видимые на срезе при увеличении 5000, свидетельствуют о плохом качестве ножа. Однако даже хороший нож имеет некоторые неровности, но царапины, производимые им, видны лишь при больших увеличениях. Такие царапины в ЭМ представляют чередование светлых и более темных полос, идущих через весь срез и указывающих направление резания. Если таких полос немного, то они обычно не мешают исследованию.
Волнистость УС (четтер). Это дефект ультратомии, который выражается в том, что на срезе чередуются более толстые и более тонкие участки, при этом полосы идут параллельно режущей кромке ножа. Четтер является результатом высокочастотной вибрации края ножа, вызванной трением между образцом и ножом. Длина волны колебаний при этом составляет менее 1 мкм. Иногда звук слышен во время резки. Четтер распространяется на весь УС, либо на его отдельную область, отличающуюся по твердости от окружающих участков, и не связан с дефектами ультратома. Разработаны и продаются мониторы для детектирования четтера.
Причины: 1) мягкая заливка; 2) неправильная установка системы блок-нож; 3) плохо приготовленный или затупившийся нож; 4) слишком большая скорость резания; 5) слишком большой угол резания; 6) плохо закрепленный нож или объект; 7) неправильно заточенная пирамидка (например, слишком большая высота трапеции по сравнению с ее основанием); 8) вибрации ультратома или стола.
Рекомендации: 1) уменьшить скорость - при этом четтер может исчезнуть, его амплитуда (но не частота) уменьшится, либо он приобретет локальный характер; 2) если четтер не исчезает при изменении скорости резания, то надо уменьшить размер среза, особенно ширину, или изменить угол режущего края ножа; 3) если требуются большие УС, то можно рекомендовать "методическое" резание. Начинать "методическое" резание надо с помощью ножа с углом в 50®. Этот угол наиболее оптимален для смол, используемых в ЭМ. При этом длина хорошего участка лезвия больше, чем у ножей с углом 45®.
Вибрация. Напоминает четтер, но частота колебаний при этом меньше. Причина вибрации не связана с параметрами резания. Вибрация может быть отдифференцирована от четтера с помощью изменения скорости резания. При вибрации уменьшение скорости резания в 2 раза снижает число вибрационных линий также в 2 раза. Такая взаимосвязь между скоростью и частотой характеризует параметры вибрации. Этот дефект встречается при резании очень больших по площади пирамид и очень твердых блоков.
Причины: 1) плохо закрепленный нож или блок; 2) образец выступает из держателя на большую величину; 3) наружная вибрация (центрифуги, лифт, транспорт); 4) инструментальный дефект.
Рекомендации: отключить подачу и внимательно посмотреть на поверхность жидкости. Заметное дрожание свидетельствует о том, что источник вибрации внешний. Если его устранить нельзя, то прекратить резание. Вибрация может быть вызвана самим оператором, если он дотрагивается до прибора во время автоматической подачи. Нужно проверить, хорошо ли закреплены все винты. Иногда непрочная фиксация блока, ножа или блокодержателя может вызвать вибрацию. Она может возникнуть, если слишком твердый блок ударяется о нож на большой скорости или блок очень широкий и захватывает большую часть режущей поверхности ножа. Наконец, источником вибрации может быть сам ультра-том и тогда ее должен устранить инженер.
"Распыление" УС. После того как УС с кромки ножа сходит в ванночку, он распадается на мелкие фрагменты, расплывающиеся по поверхности воды. Причина - плохая заливка, нередко сочетающаяся с плохой фиксацией.
Рекомендации: 1) изменить скорость резания и(или) угол режущего края; 2) увеличить толщину срезов.
Загрязнение УС. Грязь, бактерии, пыль, осадки краски могут попадать на УС из воздуха, жидкости в ванночке, окрашивающих растворов. Жидкость в ванночке должна быть свежей. Окрашивающие растворы необходимо готовить и хранить правильно. Масляная и сальная пленки хорошо видны на поверхности рабочей жидкости в ванночке. Их источником может быть липкий слой ленты, используемой для приготовления ванночки. Это происходит при старении ленты и при ее хранении в теплом помещении.
Дырки на УС. Причины: 1) пузыри в смоле; 2) неполная инфильтрация из-за плохого обезвоживания; 3) твердый объект или незаполимеризовавшийся участок в образце.
Рекомендации: во время резания этот дефект устранить нельзя. При подготовке объекта нужно варьировать составом заливочных смол и временем пропитывания. Иногда плохо пропитанные частицы ткани выкрашиваются, прилипают к ножу и вызывают царапины на срезе.
Объект вываливается из УС. Причины: 1) плохая пропитка и полимеризация; 2) блок слишком мягкий.
Рекомендации: предложено [236] "грунтовать" наружную поверхность плохо адгезирующихся с ЗС объектов, например восковых или хитиновых структур, с помощью 1%-ного раствора гаммаглицидоксипропилтр-иметоксипропана (Z 6040), растворенного в 80%-ном этаноле.
УС прилипают к реснице. Причины: 1) грязная ресница; 2) слишком сильное нажатие ресницей на срезы.
УС плохо двигаются в ванночке. Причина - загрязнение рабочей жидкости; ее надо сменить и добавить следы детергента.
УС разбегаются от сеточки. Причина - грязная сеточка; необходимо очистить ее в кислом спирте или прокалить "голую" сеточку в пламени спиртовки. Может помочь заземление держателя микротома с блоком.
Проблемы при просмотре УС в ТЭМ. Нестабильность УС под пучком электронов обусловлена либо неполной полимеризацией, либо потерей летучих компонентов во время просмотра [70, 139, 160, 333, 359, 367]

5.8. ПОЛУЧЕНИЕ УС БЕЗ ЗАЛИВКИ

Криостатный срез (5-20 мкм) свежей или фиксированной в альдегиде ткани помещают на закругленный конец эпоксидного блока, дают ему оттаять и фиксируют в альдегиде или ЧО. После ополаскивания срезу дают подсохнуть на воздухе, затем с него можно получить УС, которые снимают в ванночку с водой; УС можно контрастировать или подвергнуть гистохимической обработке. При данной обработке, безусловно, вымывается ряд компонентов, в частности гликоген, однако активность некоторых ферментов сохраняется [160, 333].

5.9. ХРАНЕНИЕ УС

Хранить сеточки с УС лучше всего в специальных контейнерах, можно в чашках Петри на двойном слое фильтровальной бумаги в чистом помещении.

5.10. ОСОБЕННОСТИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ УС ИЗ АКРИЛОВЫХ ЗС

Изготавливают УС обычным способом. При работе с гидрофильными блоками (из Ловикрилов К4М и КИМ, ЛР Байт и ЛР Голд) мениск жидкости в ванночке должен быть вогнутым и значительно ниже, чем при использовании эпоксидных смол, а также НМ20 и НМ23. Это лучше достигается при использовании стеклянных ножей. Обычно ванночка заполняется водой. Если мениск высокий, то вода очень быстро смачивает гидрофильный блок.
Пирамидка обводняется немедленно после контакта с режущим краем. Поэтому рекомендуется применять большую скорость резания (2-5 мм/с) и больший угол наклона ножа (6). Чем крупнее пирамидка, тем больше должна быть скорость резания. При работе с К4М и КИМ лучше начинать резание при большей скорости, а после достижения хороших срезов скорость рекомендуется снизить. УС быстро поглощают воду во время плавания на поверхности жидкости в ванночке. Во избежание деформаций, связанных с поглощением воды, полученные УС необходимо сразу же монтировать на сеточки.
Лкрилаты имеют несколько меньший показатель преломления, чем эпоксидные смолы. Поэтому УС, имеющие одинаковый цвет интерференции с эпоксидными, будут несколько тоньше. Бледно-серые акриловые УС не очень стабильны под электронным лучом. Поэтому рекомендуется изготавливать темно-золотистые или золотистые УС, поскольку на поверхности воды через несколько секунд они расправляются до серебристо-золотых. УС монтируются обычно на сеточку с подложкой. Если эти срезы необходимо использовать без подложки, то лучше прикреплять их к полированной (блестящей) поверхности сеточки. Для иммуномечения можно использовать как свежеизготовленные УС, так и после длительного хранения в боксах [139, 333, 359, 367].
С ловикриловых блоков при помощи криоультратома можно получать сухие УС толщиной 100-200 нм для изучения их посредством рентгеновского микроанализа (РМА). УС собирают на сухой нож, ресницей переносят на покрытую формваром ЭМ-сеточку и прижимают к сеточке полированной серебряной палочкой. Для того чтобы уменьшить сжатие во время сухого резания, температура в криокамере поддерживается на уровне от -30 до -60®С (ниже точки "стеклования" смолы). УС, полученные при низкой температуре, переносят в колонну ЭМ с помощью криопереносной системы [333, 359, 367].
Блоки из гидрофильных акрилатов, содержащие более 5 % воды, режутся с большим трудом, из-за того что они очень мягкие и склонны к быстрому поглощению воды. Сильная гидрофильность блоков приводит к быстрому смачиванию поверхности пирамидки. Простое убирание воды со смоченной поверхности фильтровальной бумагой не помогает. Получаемые УС расползаются и покрываются трещинами. Для получения хороших УС необходимо срезать увлажненную смолу ножом (сделать один или два ПС), перед тем как продолжить ультратомию.
Если блоки хранились во влажной среде, то они также режутся плохо. И в этом случае перед получением УС вначале надо сделать несколько ПС. Рекомендуется хранить блоки в вакууме или в эксикаторе с водопоглотителем.
Акриловые УС, которые обычно используют для иммунной ЭМ, желательно монтировать на никелевые или золотые сеточки. В случае применения медных сеточек их рекомендуется покрыть целлоидином (или формваром): окунуть в 0.05%-ный раствор целлоидина в амилацетате и быстро промокнуть на фильтровальной бумаге. Обработанные таким образом сеточки покрывают колодиевой подложкой. Определенные сложности возникают при помещении УС, например из ЛР Байт, на углеродную гидрофобную подложку, последнюю в этом случае подложку подвергают катодному травлению.
При исследовании акриловых УС в ТЭМ рекомендуется просмотреть их при малой интенсивности пучка. Затем постепенно повысить яркость и увеличение. При этом происходит образование добавочных поперечных сшивок и УС делаются более прочными [139, 333, 359, 367].

5.11. УС ИЗ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ (ПЭГ)

При изготовлении УС их толщина может быть определена только по показаниям прибора, но при одном и том же положении ручки толщина УС из ПЭГ примерно в 2 раза больше, чем эпоксидных. УС из ПЭГ почти не уступают по качеству эпоксидным. Твердые блоки режутся лучше. Для резания блоков из ПЭГ нужны сухие ножи. УС удобно собирать с помощью платиновой петли, смоченной 25%-ным раствором сахарозы, и помещать на угольно-формваровую подложку, покрытую полилизином (0.1%-ный раствор, рН 8.0). После монтирования УС на сеточке с подложкой их переносят в 25%-ный этанол, затем в воду, контрастируют уранилацетатом (УА) и цитратом свинца (ЦС) (по 30 с). Нельзя допускать подсыхания УС. Контрастирование не является необходимым. Далее следуют промывание в воде, обезвоживание в этаноле и высушивание в критической точке (см. гл. 18). После высушивания срезы из ПЭГ нельзя подвергать действию атмосферного воздуха. Хранить высушенные УС лучше в вакууме или над силикагелем в эксикаторе. Удаление ПЭГ из срезов достигается постепенным его выплавлением при t=60®С [333, 359, 367].

5.12. ПОЛУТОНКИЕ СРЕЗЫ (ПС)

Перед исследованием образцов в ТЭМ, как правило, необходимо иметь четкое представление о ткани на уровне СМ. Для этой цели вначале из блока готовят ПС толщиной 0.5-2 мкм. Для изготовления ПС больших размеров применяются так называемые ножи Ральфа. Чаще всего они используются для получения парафиновых срезов, срезов из мягких акрилатов или эпоксидных смол. При резании более твердых эпоксидных смол такие ножи обычно тупятся после 20-50 срезов [11, 41, 73, 124].

5.12.1. Процедура получения ПС

Процедура изготовления ПС во многом сходна с таковой для УС (см. Приложение, 6.2). Для изготовления ПС, после того как блок укреплен в блокодержателе ультратома, ручным (не автоматическим) перемещением блока по вертикали получают срезы. ПС толщиной 2 мкм можно получить сухим способом - без использования ванночки с водой. Срезы при этом снимают с ножа тонкой кисточкой, смоченной водой, или тонким пинцетом, что сложнее. Срез помещают в каплю воды на чистое предметное стекло или на стекло, смазанное улучшающим адгезию ПС веществом (см. Приложение, 6.3).
При получении более тонких ПС применяют ванночку с водой. Плавающие на поверхности воды срезы вылавливают металлической петлей. Размер петли 5 мм в диаметре, она располагается под углом 100 к держателю. Хранить ее надо в пробирке и промывать время от времени спиртом и ацетоном. Если ПС скручиваются, то рекомендуется уменьшить скорость резания. Очень часто процесс резания улучшается, если подышать на блок [11, 70, 160].
ПС можно изготавливать на обычном ротационном микротоме типа МПС-2, состыкованном со стереомикроскопом, вместо стеклянных ножей используют лезвия бритвы, закрепленные в специальном держателе. Щели между держателем и лезвием надо промазать спиртовым раствором клея, например БФ-6, чтобы предупредить забивание туда ПС [11, 36, 70].

5.12.2. Вылавливание ПС из ванночки

ПС (лучше по одному) вылавливают следующими способами: 1) ПС накрывают сверху петлей, опускают ее в глубь ванночки и поднимают вверх - ПС будет плавать в капле воды, захваченной петлей; затем нужно коснуться предметного стекла всей плоскостью петли, и капля воды стечет на стекло, увлекая за собой срез (рис. 21, А); 2) ПС монтируют на погружаемое в ванночку чистое покровное стекло или переносят на предметное стекло, обычно на каплю воды (рис. 21, Б); 3) для удобства работы с ПС предложено устройство в виде незамкнутого кольца из пластмассы, укрепленного на браншах микропинцета; при сжатии кольца полученная петля используется для захвата капли воды с ПС; размыкание кольца при соприкосновении с каплей воды на предметном стекле приводит к тому, что ПС оказывается на капле (рис. 21, В) [105, 160, 179].

5.12.3. Расправление ПС

Перенос ПС прямо на каплю дистиллированной воды приводит к образованию множества складок, особенно если срез имеет большие размеры. Высушивание стекол с ПС лучше осуществлять при t=60®С. Для расправления складок на ПС их рекомендуется вначале перенести на каплю абсолютного этанола, а после насыщения сразу же поместить на каплю воды. Быстрое разведение этанола приводит к увеличению поверхностного натяжения, что обусловливает расправление срезов.
Если ПС имеют достаточную величину, то их можно сначала поместить в теплую воду, а затем с помощью ресницы выловить на предметное стекло, аккуратно расправляя. Для того чтобы между ПС и стеклом не образовывалось пузырьков воды, на стекло рекомендуется подышать [11, 36, 70].

0x01 graphic

Рис. 21. Способы снятия ПС на стекло. 1 - ПС; 2 - стекло; 3 - проволочная петля; 4 - капля жидкости; 5 - спиртовка; 6 - ресница; 7 - размыкающаяся петля.

5.12.4. Высушивание ПС

Предметное стекло с ПС необходимо положить на нагревательный столик (t=60®С) минут на 30 или подогреть над пламенем спиртовки, строго следя за тем, чтобы вода не закипела и не образовались пузырьки воздуха. Как только вода испарится, срез плотно прикрепится к стеклу и его можно будет окрасить и просмотреть в микроскопе.

5.12.5. Увеличение адгезии ПС к стеклу

Для более прочного прикрепления ПС на поверхность предметного стекла рекомендуется предварительно нанести фгоридные производные металлов, например напылить в вакууме фторид магния до создания прозрачной пленки. При соприкосновении с ПС пленка образует прочное сцепление с его поверхностью за счет взаимодействия фторида магния с кальцием, находящимся в ткани, и образования нерастворимого фторида кальция. С этой же целью перед нанесением среза стекло можно протереть фтористой смесью (см. Приложение, 6.3.1). Методика позволяет использовать новые стекла без дополнительной очистки. Перед помещением срезов можно смочить стекло ацетоном или обработать смесью глицерина и яичного белка. Лучше всего стекло покрыть полилизином [70, 139, 160]. Вместо полилизина для увеличения адгезивности стекла можно использовать раствор альцианового синего или прикрепить ПС на стекло, покрытое желатиной. ПС также надежно фиксируются на стекле с помощью разведенного спиртового раствора клея БФ-6 [27].

5.12.6. Окрашивание ПС

Критическими факторами, влияющими на окраску ПС, являются условия препарирования (в особенности режим полимеризации) температура окрашивающего раствора, длительность окрашивания, рН окрашивающего раствора. При изготовлении ПС перед их окрашиванием иногда проводят постполимеризацию для стабилизации полимера. ПС на капле воды нагревают до t=100®С. При плохом проникновении красителя рекомендуют предварительно обработать ПС подкисленной перекисью водорода (см. Приложение, 6.6).
Очень часто при фиксации в ЧО блокируются химические связи, способствующие полноценному окрашиванию. В этом случае срезы предварительно обрабатывают раствором йодной кислоты, вымывающей ЧО, удалив перед этим из ПС эпоксидную смолу путем обработки насыщенным этаноловым или Метаноловым раствором КОН или NaOH. Однако такая обработка может повредить структуру тканей. Поэтому вначале рекомендуется размягчить срезы в дибутилфталате или диоксилфталате. Это сокращает щелочную обработку. Ранее считалось, что раствор этоксида должен созревать в течение 3-4 суток, однако специальные исследования не обнаружили изменения экстрагирующей силы раствора в процессе созревания - он уже через 4 ч готов для использования [108]. Из ПС толщиной 2 мкм Эпон 812 удаляется раствором NaOH в этаноле в течение 15-20 мин, Аралдит М - 35-40 мин. Для удаления смолы можно ПС обработать этиленгликолем или диметилформамидом в течение 30-60 мин. После удаления смолы и промывания водой ПС можно окрашивать большинством гистологических красителей [11, 70, 72, 160] (см. Приложение 6.4 и 6.5). ПС можно не окрашивать, а обугливать. Для изучения ПС в фазовом контрасте проводят окисление ПС йодной кислотой [70, 160].
Сложные методы полихромного окрашивания ПС в большинстве случаев требуют удаления из срезов смолы [11, 70, 74, 267], однако в этом случае для предупреждения потери срезов следует пользоваться адгезивными смесями (см. Приложение, 6.3.1). ПС, полученные из залитых в эпоксидные смолы объектов, как правило, не дают такого яркого окрашивания, как парафиновые срезы. Некоторые гистологические методики, предполагающие полихроматические реакции, требуют фиксации без ЧО, так как она блокирует вещества, дающие реакции с кислыми красителями [36].

5.12.7. Заключение ПС

Окрашенные ПС довольно долго (в течение многих месяцев и даже лет) хранятся в защищенном от света месте. Их можно не заключать в бальзам. Срезы, заключенные в бальзам, быстро выцветают, кроме того, их трудно повторно окрашивать. Однако для кратковременного использования в качестве среды для заключения можно использовать канадский бальзам и другие подобные среды. Герметизацию объекта при этом удобно осуществлять маникюрным лаком (рис. 22). Применение эпоксидных смол в качестве среды для заключения препаратов замедляет их выцветание. Заключать ПС удобно в эпоксидную смолу, разбавленную до нужной консистенции ацетоном.

0x01 graphic

Рис. 22. Способ заключения ПС (1) путем нанесения на стекло (2) окантовки (3) из лака для ногтей и покрытия покровным стеклом (4).

Для заключения ПС рекомендуют использовать ту же ЗС, в которую заключен объект. Для этого во время препарирования от полной заливочной смолы в пластмассовую пробирку отливают небольшую ее часть (около 1 мл), которая может длительно храниться в морозильной камере. После изготовления и окрашивания ПС тщательно просушивают на термоплите при t=90®С. Прямо на плите на ПС наносят каплю смолы (предварительно нагретой до комнатной температуры), на которую аккуратно помещают покровное стекло. После того как капля растечется, предметное стекло с ПС убирают с плиты и выдерживают при комнатной температуре (можно при t=37®С), защищая от пыли, 4 сут - до затвердевания смолы (если смолу полимеризовать при слишком высокой температуре, то может происходить выцветание красителя на ПС). Описанная методика обеспечивает сохранность ПС в течение многих лет [346].

5.12.8. Исследование ПС в ТЭМ

Для изучения ПС в ТЭМ их контрастируют в 2%-ном УА (5 мин), а затем в 0.2%-ном ЦС (2 мин). Исследования проводят при напряжении 120 кВ и выше (объектная апертура 60 мкм, конденсорная апертура 300 мкм).

5.12.9. Изготовление УС из ПС

ПС можно перезалить и изготовить из него УС. Из ПС толщиной 2 мкм можно получить 50 УС по 40 нм. При перезаливке ПС монтируют на тефлоновую пластинку или стекло, напыленное тефлоном. После высушивания ПС покрывают капсулой, заполненной заливочной смесью, и полимеризуют (рис. 23). Если использована тефлоновая пластинка, то капсула вместе с ПС легко отделяется, а если обычное предметное стекло, то для отделения капсулы его необходимо погрузить сначала в горячую воду, а затем в сухой лед (или просто нагреть это место на спиртовке), тогда капсула с ПС отделится.
Для лучшего отделения образцов от предметных стекол перед монтированием ПС стекла иногда покрывают силиконовым маслом: На стекло наносят каплю масла, затем стекло вытирают и тщательно полируют сухой тканью. Можно погрузить очищенное предметное стекло в 0.05%-ный раствор силиконовой смазки в хлороформе, вынуть и высушить [70, 160, 333].
Если необходимо быстро получить УС с исследованного ПС, то последний помещают на каплю жидкости, расположенную на поверхности заточенной пирамидки, после оттягивания жидкости ПС прочно прикрепляется к пирамидке и готов к ультратомированию. Вместо воды можно использовать каплю заливочной смеси. При этом, для того чтобы поверхности пирамидки и ПС были параллельны, ПС прижимают к пирамидке с помощью покрытого алюминием предметного стекла [70, 160].

0x01 graphic

Рис. 23. Схема перезаливки ПС (1) со стекла (2) в блоки (3).

5.12.10. ПС из акрилатов

ПС из блоков, полученных из акрилатов, изготовить довольно легко. Однако для их расправления нельзя применять органические растворители. Расправлять их следует на капле воды, которую можно нагреть до t=60®С.
Прекрасной средой для изготовления ПС является гликольметакрилат (ГМА). При этом с целью уменьшения сжатия и других полимеризационных дефектов кусочки заливают в предполимер ГМА. Если при получении ПС из ГМА-блоков срезы увеличивают свои размеры, то к заливочной смеси желательно добавить метил-метакрилат или дивинилбензен для уменьшения гидрофильное?. Добавление пластификатора, ПЭГ-400, улучшает качество резания и дает возможность получать серийные ПС. Чем толще ПС, тем легче они отстают от стекла. Для предотвращения такого отставания рекомендуют при чистке стекол обрабатывать их хромпиком, а приклеенные ПС перед окрашиванием просушивать при t=76®С в течение ночи [70, 160, 333].
Глава 6 КРИОУЛЬТРАСРЕЗЫ

К настоящему времени процедура изготовления замороженных ультратонких срезов (крио-УС) достаточно хорошо отработана. При заливке осмированных и позитивно контрастированных крио-УС в тонкий слой акриловой смолы было продемонстрировано, что крио-УС, залитые таким образом, имеют сходный вид с обычными УС. Использование негативного контрастирования позволяет четко и с высоким разрешением визуализировать мембраны [163, 348]. Крио-УС широко применяются для иммуно-ЭМ и РМА. Гидратированные крио-УС в витрифицированном состоянии могут изучаться в специальных крио-ТЭМ в условиях низких температур. Недостатком метода крио-УС является его сложность и потребность в дорогостоящем оборудовании. Криоультратомия не пригодна для изучения легочной и жировой ткани - в этом случае используют метод замораживания-замещения с последующим иммуномечением в режиме постэмбеддинга (см. гл. 12) [40, 134].

6.1. АППАРАТУРА ДЛЯ КРИОУЛЬТРАТОМИИ

Можно выделить три основных подхода в конструировании устройств для криоультратомии: 1) весь ультратом находится в закрытой охлаждаемой камере; 2) в охлаждаемую камеру помещают только объект и нож ультратома; 3) пользуются открытой охлаждаемой камерой, окружающей объект и нож ультратома, что облегчает манипуляции с крио-УС. Обычно в камерах для получения крио-УС нужная температура поддерживается за счет постоянного потока сухого азота, образующегося за счет регулируемого кипения жидкого азота [162].
Возможно резание как на сухой нож, так в ванночку с жидкостью. В свою очередь перенос сухих крио-УС на опорную сеточку может быть осуществлен, во-первых, с помощью петли с каплей раствора сахарозы (УС переносят на сеточку с подложкой, где они оттаивают при комнатной температуре, раствор сахарозы удаляют, крио-УС промывают, затем производят иммуномечение); во-вторых, посредством ресницы (УС прижимают к сеточке с помощью двух охлажденных металлических блоков, подвергают сублимации или переносят охлажденными в крио-ТЭМ и исследуют в замороженном состоянии при t=-160®С с минимальной лучевой нагрузкой) [40, 162].

6.2. ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ КРИОУЛЬТРАТОМИИ

В иммуно-ЭМ наибольшее распространение получила следующая процедура изготовления крио-УС: альдегидная фиксация (реже без нее), обработка в 0.6-2.3 М сахарозе (криопротектор), замораживание, криоультратомия, перенос на сеточку с помощью петли с каплей 2.1-2.3 М сахарозы, иммуномечение, контрастирование с заливкой в метилцеллюлозу или метилцеллюлозу с ПЭГ, высушивание на воздухе.
При работе с клеточными суспензиями рекомендуется после фиксации предварительно залить их в желатину или другой скрепляющий агент (альбумин, агар и др.) и снова обработать тем же фиксатором. Это облегчает манипуляции с крио-УС и улучшает их адгезию к подложке [40, 117, 162].

6.2.1. Фиксация и обработка криопротекторами

Фиксация образцов при изготовлении крио-УС ставит следующие задачи: 1) сохранение ультраструктуры; 2) иммобилизация антигенов; 3) сохранение структурной интегрированное? препаратов после оттаивания. Образцы перед замораживанием обычно фиксируют в ФА при низких его концентрациях. Целые органы желательно фиксировать с помощью сосудистой перфузии. Оптимальная степень фиксации определяется толщиной крио-УС - чем толще должен быть крио-УС, тем меньшая степень фиксации может быть использована. При работе с высокогидратированными объектами, такими как эмбриональные ткани, после химической фиксации желательно залить кусочек в смолу, например в 3-15%-ный полиакриламид. В случае суспензий в качестве заливочного материала можно пользоваться растворами желатины или агарозы. Для криоультратомии объект чаще всего пропитывают в смесях 2.3 М сахарозы с ФБФР (1 : 2, 1 : 1, 2 : 1), а затем в 2.3 М сахарозе (по 30 мин в каждой). После фиксации и обработки криопротектором объекты замораживают (см. гл. 2) [40, 117, 162].

6.2.2. Механизмы криоультратомии

При изготовлении крио-УС может происходить либо скол, либо пластическая деформация. Если имеет место пластическая деформация, то срезы образуют непрерывную полоску, если скалывание, то прерывистую стружку. Последняя обычно формируется при t=-80®С, а непрерывная полоска - при t=-50®С.
Энергия резания в определенной степени превращается в тепло. Это вызвано главным образом силами сдвига непосредственно у острия ножа. Часть тепла образуется за счет трения образца о грань ножа. При этом происходит мгновенное повышение температуры вершины пирамидки и среза. Тепло по мере выделения распространяется вдоль среза со скоростью резания.
Качество криоультратомии зависит, во-первых, от температуры блока и ножа, во-вторых, от количества выделяющегося во время резания тепла. Толстые УС нагреваются в меньшей степени, чем тонкие. При изготовлении крио-УС таяние происходит только в поверхностном слое среза, контактирующем с ножом [221]. Выраженность повреждений ткани кристаллами льда больше в центральных участках образца и меньше по периферии. Во время криоультратомии объект часто раскалывается, что приводит к образованию поперечных трещин на крио-УС [162].
При изготовлении крио-УС сухим способом они часто слипаются друг с другом в цепочки. Такое слипание обусловлено тем, что часть среза мгновенно расправляется и тут же замерзает, образуя непрерывный слой. Возможно, что при мгновенном нагревании вершины пирамидки или среза достигается критическая температура, тут же снижающаяся без признаков очевидных механических дефектов. Это явление приводит к термическим дефектам, таким как денатурация, перераспределение водорастворимых компонентов и тд.
В процессе резания образец подвергается сильному сжатию в направлении движения ножа, кроме того, иногда возникают трещины. При расправлении крио-УС на жидкости некоторые дефекты можно исправить [40, 117, 162].

6.2.3. Параметры резания

Во время криоультратомии необходимо, во-первых, постоянно контролировать процесс резания и уметь вручную чистить нож от загрязнений, накапливающихся на режущей кромке ножа, и тем самым поддерживать непрерывность при изготовлении и сборе серийных срезов, во-вторых, иметь легкий доступ к объекту, ножу и срезу в ходе всего процесса, в-третьих, тщательно контролировать температуру криокамеры.
При изготовлении крио-УС для каждого рода материалов существует свой оптимальный температурный интервал. Этот интервал должен лежать в области достаточно низких температур. Многие считают, что оптимальная температура для получения крио-УС лежит в интервале от -70 до -80®С, а скорость резания составляет 2 мм/с. Увеличение скорости не влияет существенно на качество крио-УС [376]. В последнее время довольно часто используется температура от -90 до -120®С. Чем ниже температура, тем более твердым становится блок. При температуре от -60 до -70®С из образцов, обработанных 23 М сахарозой; легко изготавливаются ПС. Если крио-УС сильно сжимаются, то это значит, что температуру резания надо чуть уменьшить. Напротив, если крио-УС имеют вид маленьких ледяных стружек, то надо слегка повысить температуру.
Крио-УС имеют обыкновение скручиваться и соскакивать с ножа из-за накопления электростатического заряда. Они очень хрупкие, с ними весьма сложно манипулировать. Для расправления срезов используют охлажденный до t=-75®С полированный медный стержень. Чтобы предупредить скручивание, применяют ресницу, тонкую металлическую иглу и противоскручивающую пластинку. Последняя представляет собой кусочек покровного стекла, прикрепленного к верхней части ножа рядом с режущим краем. Для создания зазора, куда будет поступать крио-УС, между ножом и покровным стеклом прокладывают тонкую бумагу.
Для этих же целей можно использовать другой треугольный нож, закрепленный над первым с образованием очень тонкой щели. При оптимальной температуре возможно получение ленты из 3-4 крио-УС. Однако чаще приходится иметь дело с единственным крио-УС. После получения каждого крио-УС его надо убрать с лезвия ножа, чтобы на него не наслаивался следующий. При этом автоматическая подача обычно выключается [40, 117, 162].
Объект, содержащий много кристаллов льда, режется плохо. При высокой концентрации сахарозы в образце качество крио-УС выше. Блоки, замороженные в 2.3 М сахарозе, обычно более мягкие, чем залитые в смолу [221].

6.3. ПРОЦЕДУРА ПОЛУЧЕНИЯ КРИО-УС

Некоторые криоультратомы допускают регулирование температуры ножа и образца независимо друг от друга. Однако начинать резание надо при одной и той же температуре ножа и объекта. Стеклянные ножи для крио-УС следует напылить тонким вольфрамом, что улучшает криоультратомирование. Толщина слоя вольфрама подбирается эмпирически. Хорошие результаты получаются также при использовании алмазных ножей. Для уменьшения термических изменений рекомендуется применять быстрый обратный ход штанги с объектом.
При криоультратомии часто бывает довольно сложно подвести объект к ножу, поскольку в низкотемпературной камере трудно обеспечить достаточную подсветку. Поэтому вначале нож подводят с помощью грубой подачи, после чего включают медленное (1 мм/с) движение блока и нож приближается к образцу с помощью средней и тонкой подачи и лишь затем используют автоматическую подачу. Оценить толщину крио-УС с помощью интерференционного цвета невозможно, поскольку УС не плавают на поверхности жидкости. Хорошие крио-УС прозрачны и похожи на целлофановые полоски. Если препараты фиксированы и обработаны криопротекторами, то крио-УС имеют слегка голубоватый или золотой цвет. Крио-УС, имеющие другой цвет, слишком толстые [350].
Для резки надо поместить объект на медный блок, убрать избыток жидкости, для лучшего прикрепления его можно приклеить заливочной средой. Затем опустить блок в жидкий азот, если используется концентрированная (2.3 М) сахароза, или в охлажденную промежуточную жидкость. Замороженные блоки можно длительное время хранить под жидким азотом.
Рекомендуется установить подачу 50-100 нм и небольшую скорость резания. Затем подвести нож и начать резание. Крио УС собирают на поверхности ножа. С помощью ресницы можно предупредить обратное захватывание срезов и переместить их на лучшую позицию на ноже. Если ванночка ножа заполнена жидкостью, то следует начинать резание с довольно высоких скоростей (10-60 мм/с). После завершения первичной стадии применяются обычные для ультратомии скорости резания. Угол стеклянного ножа изменяется в зависимости от свойств тканей, из которых изготавливают срезы.
При влажной криоультратомии для заполнения ванночки можно пользоваться смесью воды с диметилсульфоксидом (ДМСО). Применение 40%-ного ДМСО для собирания крио-УС в ванночке ножа позволяет производить резку при температуре от -40 до -50®С. В качестве жидкости для собирания крио-УС используют также 60%-ный раствор ПЭГ-100.
Борьба со статическим электричеством может вестись разными путями: 1) уменьшением площади контакта объекта с ножом; 2) повышением электропроводности ножа, например путем напыления слоя вольфрама (см. Приложение, 7.1); 3) ионизацией окружающего пространства, например с помощью антистатической пушки.
Введение в криокамеру неохлажденных инструментов, так же как и теплого воздуха, вызывает повышение в ней температуры и соответственно запотевание поверхностей камеры и кристаллообразование в объекте и крио-УС [40, 117, 162].

6.3.1. "Сухой" способ сбора крио-УС

Крио-УС собирают обычно на сеточки с подложкой, которые перед применением выдерживают в течение 1 мин при низкой температуре. Затем охлажденная сеточка помещается рядом с ножом и крио-УС с помощью тонкой металлической иглы или ресницы переносят на сеточку. Крио-УС прижимают к подложке с помощью охлажденной медной палочки с полированным концом (рис. 24). К современным криоультратомам придаются готовые прессы для сеточек. Сеточку часто просто прижимают к расправленным срезам, находящимся на ноже, либо к кромке ножа прикрепляют сеточку, на которую поступают срезы. Предложен специальный вакуум-провод, поддерживающий горизонтальную полоску срезов с помощью электростатического поля. В ряде случаев применяют "раздавливание" крио-УС между двумя стеками с подложками [40, 117, 162] (см. Приложение, 7.2).

0x01 graphic

Рис. 24. Этапы изготовления и переноса крио-УС с лезвия ножа на сеточку "сухим способом".
А - помещение объекта на держатель; Б - замораживание объекта; В - изготовление крио-УС (1); Г - взятие крио-УС с лезвия ножа (2) с помощью ресницы (3); Д - перенос крио-УС на поверхность охлажденной сеточки (4); Е - придавливание крио-УС к сеточке с помощью охлажденного полированного металлического стержня (5) и холодного основания (б).

6.3.2. "Влажный" способ сбора крио-УС

Каплю 2.3 М сахарозы подцепляют на проволочную петлю диаметром 15-2 мм, быстро вводят в криокамеру и касаются срезов, которые прилипают к капле снизу, до того как она замерзнет (нельзя допускать замерзания капли в криокамере и контактирования ее с ножом, поскольку она мгновенно примерзнет к нему). Затем петлю выносят из криокамеры и дают возможность срезам расправиться на тающей капле сахарозы. Для расправления очень хрупких срезов можно использовать 2 М раствор сахарозы, содержащий 0.75 % желатины. Иногда добавляют к сахарозе 1-2 % ФА. Капля такой смеси остается в криокамере в жидком состоянии несколько дольше, чем капля 2.3 М сахарозы. Для увеличения времени, в течение которого капля сахарозы остается жидкой, петлю нагревают. Можно для этих целей применять петлю с большим диаметром - до 3 мм. Затем каплей с плавающими в нижней ее части крио-УС касаются сеточки. Крио-УС прилипают к подложке, а сахароза растекается по всей ее поверхности. Сеточку переворачивают и помещают на слой застывшего 2%-ного раствора желатины (или агарозы). Желатину нагревают (t=37®С) до жидкого состояния и разводят с помощью ФБФР (1 : 1). После этого под сеточку подводят проволочную петлю диаметром 3 мм, с помощью которой сеточку переносят на каплю ФБФР для удаления желатины. Затем крио-УС заключают в метил-целлюлозу, избыток которой удаляют фильтровальной бумагой (рис. 25). Никелевые или медные сеточки должны быть предварительно покрыты формваровой подложкой, стабилизированной углеродом. Лучше пользоваться сеточками с более мелкими ячейками. Крио-УС очень чувствительны к атмосферным влияниям и перед анализом в ТЭМ нуждаются в стабилизации, например парами 40 или путем напыления слоя углерода [40, 117, 162, 350].

0x01 graphic

Рис. 25. Этапы (А-Д) переноса крио-УС с лезвия ножа на сеточку "влажным способом". 1 - крио-УС; 2 - лезвие ножа; 3 - сеточка; 4 - капля концентрированного раствора сахарозы; 5 - проволочная петля; 6 - капля буферного раствора.

6.4. ИЗГОТОВЛЕНИЕ КРИО-ПС

В ряде случаев требуется выбрать для криоультратомии нужный участок образца. Для этого с помощью ручной подачи готовят несколько ПС толщиной 500 нм. Их собирают с помощью капли раствора сахарозы и помещают на предметное стекло. ПС промывают водой и в течение 1 мин окрашивают толуидиновым синим. Если при исследовании под СМ окажется, что избран нужный участок, то готовят следующий срез толщиной 200 нм - крио-УС. Его промывают водой, окрашивают 1%-ным молибдатом аммония (рН 6.8) и просматривают в ТЭМ. Только после этого начинают изготавливать серийные крио-УС. Если необходимо получить УС и ПС с одного образца, то лучше сначала изготовить УС, затем поднять температуру и сделать ПС, чтобы кристаллизация не испортила крио-УС.
Для повышения проницаемости нефиксированных ПС их обрабатывают с помощью глицерина или слабого детергента, такого как Тритон Х-100, и помещают в раствор сахарозы. Стекла для ПС надо обработать 0.01%-ным полилизином в течение 1 ч, а затем высушить. Петлю вынимают из криокамеры и через несколько секунд после оттаивания капли сахарозы со срезами ею надо коснуться стекла с полилизиновым покрытием - ПС прилипают к стеклу [40, 117, 162].
Глава 7 СЕТОЧКИ И ПОДЛОЖКИ

УС, а также суспензии бактерий, фагов, вирусов, изолированных клеточных фракций, другие аналогичные объекты для их просмотра в ТЭМ наносят на специальные сеточки или бленды, покрытые в ряде случаев очень тонкими пленками (подложками). Бленды применяются при необходимости просмотра больших полей зрения.

7.1. ОПОРНЫЕ СЕТОЧКИ

Стандартный диаметр поддерживающей сеточки (и бленды) для ЭМ составляет 3.05 мм. Кроме наиболее широко используемых медных сеточек применяют золотые, платиновые, родиевые, палладиевые и палладированные, никелевые, молибденовые, из нержавеющей стали.
Если УС при проведении цитохимических процедур подвергаются окислению, то обычные медные сеточки заменяют сеточками "из инертных металлов. Так, для иммуно-ЭМ используют обычно никелевые или золотые сеточки. В случае применения аналитических методов исследования применяют нейлоновые сеточки.
Сеточки изготавливают электролитическими методами. Их поверхность обычно ровная. Некоторые фирмы производят сеточки, у которых одна поверхность блестящая, а другая матовая. Последняя используется для прикрепления подложек и УС.
Номера, или размеры, сеточек (количество полос на один дюйм) варьируют от 50 до 1000. Более крупные ячейки дают возможность просматривать большие участки УС, более мелкие обеспечивают их лучшую стабильность и сохранность.
Взятие и перенос сеточек осуществляют с помощью специальных ювелирных пинцетов. Для удобства работы один из краешков сеточки рекомендуется немного отогнуть. Выпускают специальные сеточки с держателями, которые перед введением сеточек в ТЭМ отрезают. При перенесении сеточек из капли в каплю (или из одной посуды в другую) брать их следует очень осторожно. При манипуляциях с сеточками в растворах очень важно с помощью фильтровальной бумаги удалять жидкость, остающуюся между браншами пинцета. Для этой цели рекомендуется использовать специальные противокапиллярные пинцеты, у которых одна из бранш у самого конца изогнута почти под прямым углом у самого конца [11, 26, 70, 72, 105].

7.1.1. Очистка сеточек

Опорные сеточки перед нанесением подложек или УС следует прокатать с помощью полированного ролика или гладкой стеклянной палочки. Это не касается сеточек, специально выпускаемых для ЭМ. Чистят сеточки с помощью ультразвука или промывают в ацетоне и этаноле. Если используют детергент, то он не должен содержать фосфатов, которые могут впоследствии давать осадки на препаратах. Сильно загрязненные сеточки перед употреблением 1-3 мин моют в растворах концентрированной соляной кислоты или хромпика. Можно обрабатывать их кипячением в концентрированном растворе аммиака или просто встряхивать в растворе детергента.
После такой обработки сеточки тщательно споласкивают в воде, а затем в этаноле или ацетоне. Вслед за этим сеточки помещают на фильтровальную бумагу в термостат в защищенное от пыли место при t=60®С до высыхания. Хранят сеточки сухими в закрытом стеклянном бюксе либо в этаноле или ацетоне.
Пластиковая посуда для хранения сеточек непригодна, поскольку из-за электростатических взаимодействий сеточки могут "выпрыгивать" из нее [11, 70].

7.1.2. Повторное использование сеточек

Если сеточки применяют повторно, то надо удалить с них старую подложку и УС. Это можно сделать механическим способом - с помощью ультразвука, а затем выдержать их по 1-2 ч в двух порциях растворителя (амилацетат, ацетон, хлороформ, дихлорэтан - в зависимости от того, на каком растворителе были приготовлены подложки). Если сеточки не очень загрязнены, то они могут быть погружены на 1-2 мин в концентрированную соляную кислоту, после чего их последовательно промывают в воде, этаноле, ацетоне и хранят в дихлорэтане. Очистить сеточки можно и кипячением в концентрированном растворе аммиака (с последующим тщательным промыванием в воде) или путем нагревания в вакууме [78].
После очистки каждую сеточку желательно просмотреть под большим увеличением в СМ. Деформированные сеточки надо разложить на фильтровальную бумагу и прокатать с помощью стеклянной палочки или валика.

7.2. ПРИМЕНЕНИЕ СЕТОЧЕК БЕЗ ПОДЛОЖКИ

Сеточки могут использоваться без подложки, если УС достаточно устойчивы к электронному пучку. При обычной работе с материалом, залитым в эпоксидную смолу, употребление подложки не является обязательным, если сеточки достаточно мелкоячеистые. В этом случае применяют сеточки больших номеров (200 и более). Однако переплеты сеточек могут закрывать до 30 % площади УС. Обращаться с сеточками без подложек следует весьма осторожно, так как УС могут слететь с сеточки во время различных процедур. Для улучшения прикрепления УС и подложек к сеточкам последние рекомендуется обрабатывать 0.2%-ным раствором неопрена в толуоле. Очень тонкие УС, а также срезы из акриловых смол нестабильны под электронным пучком и повреждаются, если нет поддерживающей пленки [11, 26, 72, 105].

7.3. ПЛЕНКИ-ПОДЛОЖКИ

Для стабилизации УС применяют пленки-подложки. Они также необходимы при исследовании изолированных клеток, бактерий, вирусов и различных других объектов сверхмалого размера. Обычно используются пластиковые или углеродные подложки толщиной 20-40 нм. Подложка должна быть тонкой, прочной, прозрачной для электронов. Пластмассовые подложки подвержены термическому дрейфу и не могут использоваться на предельных разрешениях ЭМ [139].
Подложки приготавливают из нитроцеллюлозы, этиленцеллголозы, поливинилформальдегида, поливинилбутираля, углерода, бериллия, окиси алюминия, кварца, окиси кварца и др. Наиболее часто подложки готовят из коллодия (нитроцеллюлозы), формвара, пиелоформа и углерода. Свойства различных подложек приведены в табл. 3. В случае применения негативного контрастирования используют коллодиевые пленки, так как они в отличие от формваровых и углеродных лучше смачиваются. Толщина пластмассовых подложек зависит от концентрации исходного раствора пластмассы. Меняя его концентрацию можно добиться получения очень тонких пленок, как например при использовании 0.5%-ного раствора пиелоформа в дихлорэтане [11, 70, 105].

Таблица 3. Свойства подложек.

Тип подложки	Прозрачность	Прочность	Устойчивость
Тип подложки	Прозрачность	Прочность			к электронам	химическая
Коллодиевая	Большая	Низкая	Низкая	Низкая
Формваровая	"	"	"	"
Углеродная	Средняя	Высокая	Очень высокая	Очень высокая
Кварцевая	Малая	Средняя	Средняя	Высокая

7.3.1. Методы изготовления подложек 7.3.1.1. Коллодиевые подложки

Для изготовления подложек используют 0.5-2%-ные растворы чистого коллодия (нитроцеллюлоза, целлоидин) в амилацетате, чаще всего 1.5%-ном. Растворы относительно быстро стареют. Хранить их надо в темноте, так как на свету образуются нерастворимые продукты и пленка получается непрочной. Процесс приготовления подложек включает следующие процедуры. Вначале чистый кристаллизатор наполняют водой, берут небольшое количество раствора коллодия (целлоидина) пастеровской пипеткой и с высоты 1 см наносят одну каплю раствора на поверхность воды. После испарения растворителя образуется тонкая коллодиевая пленка. Образовавшуюся пленку лучше снять, чтобы вместе с ней удалить пыль с поверхности воды, снова капнуть раствор коллодия и подождать 1-2 мин. Обычно используют пленку из второй или третьей капли. С помощью флюоресцирующего источника света, расположенного над пленкой, надо ее исследовать на предмет целостности. Она должна иметь равномерный серебряный цвет. Лучше наносить кайлю на " поверхность выпуклого мениска воды, налитой до краев в чашку диаметром 20 см. Для получения более прочной и однородной пленки можно пользоваться водой, насыщенной парами амилацетата, для чего за 24 ч до изготовления пленок в воду добавляют несколько капель амилацетата. Раствор энергично встряхивают и отстаивают.
Для прикрепления подложки к сеточкам можно использовать сосуд типа делительной воронки, в дне которого имеется выпускной кран. В нижнюю часть сосуда помещают стекло или подставку с сеточками. Воду осторожно выпускают, и пленка покрывает сеточки. Затем сеточки с подложками надо высушить. Полученные таким путем подложки обычно требуют укрепления. Для этого на них наносят тонкий слой углерода. Если после напыления органическую пленку растворить, то на сеточке останется только углеродная пленка. Перед помещением УС желательно просмотреть сеточки с подложками в ЭМ. Если пленка в микроскопе разрушается, то надо изменить концентрацию коллодия [11, 26, 70, 72].

7.3.1.2. Формваровые подложки

Пленки из бутвара (лоливинилбутилата) и формвара (поливинилформаля) прочнее, чем коллодиевые. Поэтому они нашли широкое применение в ЭМ. Концентрация используемых растворов формвара колеблется от 0.1 до OS %. Коммерческие растворы обычно содержат 0.5 % формвара. Раствор формвара хранится в темной герметически закрытой посуде до 10 сут. При частом употреблении его концентрация быстро увеличивается вследствие испарения растворителя. Перед употреблением раствор формвара желательно профильтровать через стеклянный фильтр.
Необходимо подготовить хорошо очищенное стекло. Для этого вначале отшлифованное стекло тщательно промывают мыльным раствором, затем ватными тампонами, смоченными водой, ацетоном и снова водой, после чего протирают сухим ватнмм тампоном. Для удаления пылинок с поверхности стекла его можно продуть струей сухого воздуха. Иногда достаточно просто вымыть стекло водой и вытереть. Не все стекла подходят для этой цели. Следует выбрать наиболее подходящее.
Сухое стекло опекают в раствор формвара, находящийся в высоком стеклянном цилиндре, и быстро извлекают. Более однородные и тонкие (200 нм) пленки можно получить при выдерживаний (10 мин) их во время высушивания в парах растворителя. Поэтому рекомендуется поднять стекло и подержать около самой поверхности раствора в течение 30 с, а затем убрать лишний раствор, коснувшись стеклом фильтровальной бумаги. Это должно производиться в сухом помещении. После высушивания следует обрезать пленку лезвием бритвы (или иголкой) на расстоянии 3-4 мм от края и медленно опустить стекло под углом (приблизительно 30) в ванночку с водой. Пленка при этом отделяется от стекла и остается на поверхности.
Если пленка образовалась на обеих сторонах стекла, то она подрезается по всему периметру с обеих сторон, затем стекло вертикально опускают в воду. Делать это следует медленно и плавно. Пленка с двух сторон отслаивается от стекла. Тонкие пленки, плавающие на поверхности воды, видны только в отраженном свете и кажутся равномерно серебристо-серыми. Пленка, имеющая золотистый оттенок, слишком толста, а пленка с радужными цветными полосами имеет неравномерную толщину. Если в пленке видны отверстия, то это значит, что в исходный раствор попала вода - следует заменить раствор и приготовить новую пленку. Обычно в качестве подложки используют только верхний участок формваровой пленки (1/3 поверхности). Для снятия ее со стекла лучше применять кристаллизаторы или ванночки, обклеенные черной бумагой. Это делает плавающую на поверхности воды формваровую пленку более заметной.
Главный недостаток описанного метода - плохое отделение пленки от поверхности стекла. Иногда стекло обрабатывают перед нанесением пленки детергентом. Можно нанести на стекла слой увлажняющего вещества - Виктавета (Victawet).
На пленку удовлетворительного качества, плавающую в воде, осторожно помещают высушенные чистые сеточки и бленды. Затем пленку с прикрепленными к ней сеточками накрывают полоской фильтровальной бумаги (не допускать образования пузырей воздуха между бумагой и пленкой!). Как только бумага намокнет, нужно подхватить ее край пинцетом и плавным скользящим движением поднять вместе с прилипшей в ней пленкой. Бумагу с сеточками следует разместить на дне чашки Петри и высушить. Вместо бумаги можно пленку с сеточками накрыть чистым стеклом и погрузить в воду, а затем, повернув стекло сеточкой вверх, вынуть из жидкости и высушить [26, 70, 72, 367].
Обычно формваровую подложку помещают на матовую поверхность сеточки (для лучшей адгезии). Если ее поместить на гладкую сторону, то пленка будет меньше коробиться. Однако в этом случае манипулировать с сеточкой будет сложнее, так как УС не будут видны в отраженном свете. Для того чтобы формваровая пленка прилипла плотнее, все сеточки и бленды перед нанесением на них подложки рекомендуется погрузить в исходный раствор формвара, разбавленный растворителем в отношений 1:1. Затем их немедленно высушивают на фильтровальной бумаге. Переплеты сеточек при этом обволакиваются тонкой формваровой пленкой, что улучшает их адгезивные свойства. Иногда подложки помещают на опорные сеточки, предварительно покрытые раствором клеящего вещества от скотча - готовят 1%-ный раствор и погружают туда сеточки с последующим высушиванием. Для уменьшения теплового дрейфа УС, нанесенные на сеточки с пленками, покрывают тонким слоем углерода [11, 26, 105].

7.3.1.3. Дырчатые подложки

Для ЭМ высокого разрешения могут использоваться "микросеточки", т. е. подложки с отверстиями от 0.1 до 15 мкм в диаметре. Подобные сеточки могут быть получены при выборе соответствующих растворителя и режима высушивания. Например, 3%-ный раствор коллодия наносят на поверхность охлажденной льдом воды. При легком дыхании на еще не сформировавшуюся пленку на ее поверхности конденсируются капли влаги, образующие вмятины. Пленку затем наносят на сеточки. Тончайшие перетяжки удаляют в пламени горелки. Более однородные ячейки образуются, если через 5-7 с после нанесения раствора чашку с еще не вполне сформировавшейся пленкой накрыть стеклянным колпаком, разогретым над сосудом с кипящей водой. Когда пленка становится мутной, колпак удаляют для окончательного испарения амилацетата (1-2 мин). Пленка с красно-зеленым отливом имеет ячейки 4-7 мкм, синеватая - порядка 25-40 мкм.
Можно изготовить дырчатую подложку и из формвара. Для этого, после того как стекло вынуто из раствора, на него надо подышать. Более воспроизводимые результаты получаются, если добавить в раствор формвара глицерин. Для образования пор диаметров 25, 15, 7 или 5 мкм надо 1 мл глицерина добавить к 8, 16, 32 или 120 мл раствора формвара соответственно. Затем надо опустить покрытое виктаветом стекло в смесь формвара и глицерина, которую перед использованием следует интенсивно перемешать. После этого стекло вынуть и после 10-15-минутного высушивания при комнатной температуре подышать на него или подержать над кипящей водой. Полученную таким способом пленку покрывают обычно тонким слоем углерода [11, 26, 70].

7.3.1.4. Углеродные подложки

Углеродные пленки получают распылением угля в вакуумном посте (см. гл. 16). Отделить углеродную пленку от чистого стеклу очень трудно. Для облегчения снятия пленки предметное стекло предварительно опускают в глицерин, высушивают в вакууме, а затем напыляют углеродом. Надрезанная по краям пленка легко сходит с такого стекла на поверхность воды. Можно напылить углерод на стекло, обработанное виктаветом или покрытое пленкой поливинилового спирта. Поливиниловый спирт при этом быстро растворяется в горячей воде.
Очень хорошие углеродные пленки получаются при напылении углерода на свежерасщепленную слюду. От слюды пленка отделяется на поверхности чистой воды, к которой можно добавлять 10 % ацетона - он способствует более плавному снятию пленки и препятствует ее разрыву. Следует учитывать, что углеродные пленки хрупки и в обращении с ними надо соблюдать осторожность. Углеродная пленка не очень хорошо прикрепляется к сеточкам. Это следует учитывать при дальнейших манипуляциях со срезами (отмывание, контрастирование). Для лучшей адгезии углеродных подложек к сеточкам можно использовать те же приемы, которые были описаны для коллодиевых пленок [26, 72, 105].
Разработан метод получения углеродных пленок с помощью плазменного разложения паров нафталина в вакууме [373]. Получаемая подложка имеет небольшую толщину, аморфную текстуру, высокую прозрачность для электронов и более гидрофильна, чем обычная угольная подложка. Описаны также способы получения угольных пленок толщиной 1 нм [311].

7.3.2. Повышение адгезивности поверхности подложек

Углеродную подложку желательно сделать более гидрофильной. Адгезивность пленки повышается после ее нагревания, 2-3-часового облучения УФО, обработки 0.1%-ным раствором поли-L-лизина (рН 9.5) либо быстрого промывания 20%-ной уксусной кислотой или 90%-ным этанолом. Для этой же цели можно обработать сеточки с подложками в течение 20 с в установке для катодного распыления при напряжении 250 В и давлении 200 мкм рт.ст. в присутствии паров пентиламина. Добавление следов детергента в жидкость в ванночке также улучшает смачиваемость подложек [11, 26, 105, 139].
Глава 8 КОНТРАСТИРОВАНИЕ

Биологические структуры в большинстве своем электроннооптически прозрачны. Контрастность изображения в ТЭМ можно повысить путем снижения ускоряющего напряжения, уменьшения апертурной диафрагмы, увеличения фокусного расстояния объективной линзы. Наиболее эффективным подходом является химическое контрастирование - искусственное увеличение электронной плотности ультраструктур. За счет осаждения электронно-плотных веществ контрастирование может быть позитивным - усиление электронной плотности исследуемых структур по сравнению с фоном, окружающим объект, и негативным - увеличение электронной плотности фона. В первом случае электронно-плотные вещества осаждаются на клеточных структурах, во втором они вводятся в среду, окружающую исследуемые структуры.

8.1. ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ПОЗИТИВНОГО КОНТРАСТИРОВАНИЯ

ЧО, испольауемая для фиксации образцов, одновременно выполняет функцию красителя, поскольку содержит атом электронно-плотного элемента Os. Для неспецифического контрастирования наиболее часто применяются уранилацетат и цитрат свинца.

8.1.1. Уранилацетат (УА)

УА реагирует главным образом с фосфатными, карбоксильными и аминогруппами и имеет особенно сильное сродство к нуклеиновым кислотам. Последние, а также ряд белков интенсивно им окрашиваются [179]. УА хорошо проникает в ткань и может использоваться как в водных, так и в спиртовых растворах. Спиртовые растворы проникают в ткань быстрее и обеспечивают более высокую контрастность. Применяются 1-5%-ные водные растворы, 2%-ный или насыщенный раствор в 50, 70 или 100%-ном этаноле или метаноле. УА лучше растворяется в метаноле. Поэтому при использовании метаноловых растворов УА достигается наивысшая контрастность объектов (насыщенный раствор УА в абсолютном метаноле).
Водные растворы УА (чаще 2%-ные) хранятся не более одной недели в темных склянках с притертой крышкой. Приготовление УА на буферных растворах (например, Na-ацетатный буфер, рН 5.2) уменьшает скорость его преципитации. Аналогичный результат Получается, если применять бидистиллированную воду. Перед использованием раствор УА должен центрифугироваться или фильтроваться через миллипоровый фильтр. Фосфатные буферы нельзя использовать в смеси с солями урана.
Работа со спиртовыми растворами УА также сопряжена с рядом трудностей. Из-за большой летучести спиртов при длительном контрастировании на срезах часто выпадает осадок. Кроме того, спиртовые растворы УА довольно агрессивны: они разрушают некоторые пленки-подложки. Это особенно опасно при монтировании срезов на бленды. Спиртовые растворы УА также чувствительны к свету - в них с течением времени выпадает осадок. Для их стабилизации к 10 мл раствора добавляют 0.15 мл ледяной уксусной кислоты [11, 72, 105, 179, 367].

8.1.2. Ионы свинца

Чаще всего для контрастирования биологических образцов используется цитрат свинца (ЦС), реже - гидроокись свинца, ацетат, тартрат и другие соли. Применяется окрашивание образцов в блоке аспартатом свинца [235]. ЦС связывается с отрицательно заряженными компонентами, такими как гидроксильные группы и реагирующие с осмием области. В этот процесс вовлечены и фосфатные группы [341] (см. Приложение, 8.5.2).

8.1.3. Другие соли

Фосфорно-вольфрамовая кислота (ФВК) в зависимости от рН (больше или меньше 3) окрашивает полисахариды и гликопротеины (т.е. имитирует ШИК-реакцию), а также нуклеопротеиды и белки, особенно коллаген. ФВК и фосфорно-молибденовую кислоту (ФМК) лучше применять в виде 1%-ных растворов в 100%-ном этаноле в процессе обезвоживания образцов (1-3 ч).
Увеличение контрастности ядер при обработке ткани перед ее обезвоживанием раствором аммиачного серебра обусловлено окрашиванием гистонов. Хлорид гафния хорошо контрастирует микротрубочки, особенно в комбинации с УА и при использовании в качестве растворителя ацетона [11, 72, 105, 179, 367].
Таниновая кислота (ТК) при контрастировании связывается с карбогидратными группами. Чаще она используется в сочетании с солями тяжелых металлов. При рН 7.0-9.0 ТК окрашивает эластические волокна и лишь слегка - коллаген и ядра, при рН выше 9.0 обычно выпадает в осадок. ТК увеличивает также контрастность продуктов реакции на пероксидазу и защищает актин от разрушающего действия 40. Вместе с метиламином вольфрамата ТК используется для контрастирования мембран клеток в процессе проводки материала, при фиксации которого не использовалась 40, с последующим контрастированием УС с помощью УА и ЦС [235]. Если ТК использовать в качестве добавки к ГА, то контрастируются большинство белков (особенно в клеточных мембранах) и компоненты цитоскелета [83].

8.2. СПОСОБЫ КОНТРАСТИРОВАНИЯ

Контрастирование может быть осуществлено как до, так и после заливки.

8.2.1. Контрастирование в блоках

Окраску ткани в блоках с помощью УА можно проводить сразу после осмирования или во время обезвоживания. В первом случае используют 0.25-2%-ный (реже 5%-ный) раствор УА в воде либо в вероналацетатном, малеатном или Na-ацетатном буфере (рН 5). Конечный рН может варьировать от 4.2 до 5.2 в зависимости от концентрации УА. Применение раствора УА с рН 5.0-5.2 ведет к лучшей сохранности ДНК, клеточных контактов, митохондрий, миофибрилл, нуклеопротеидов и фосфолипидов. Вместо УА можно применять магнийуранилацетат (см. Приложение, 8.2 и 8.3).
При окраске УА нельзя использовать какодилатный и фосфатный буферы. Если эти буферы использовали ранее для приготовления фиксаторов, то кусочки тканей следует тщательно отмыть перед погружением их в раствор УА. После обработки УА отмывание объектов производят в 20%-ном этаноле, который меняют несколько раз. Образцы ткани можно инкубировать в растворе УА (0.5-2.0%-ном) на этаноле (обычно 70%-ном) во время обезвоживания. Для окрашивания образцов в блоках этим раствором наиболее удобно пользоваться 05%-ным раствором УА на смеси абсолютных этанола и ацетона, поскольку он может храниться как угодно долго. Можно окрашивать объект (по 15-20 мин) в 0.5-2.0%-ных растворах УА в этаноле при восходящей его концентрации с отмыванием в последней смене чистого абсолютного этанола. Можно во время обезвоживания использовать 2%-ный раствор УА на 30%-ном метаноле или 1%-ный раствор ФВК в 70-100%-ном ацетоне (в последнем случае уже без других контрастеров) [70, 72]. После контрастирования блоков с помощью УА обезвоживание должно быть ускорено, так как УА медленно, но все же удаляется с помощью дегидратантов.
Основным недостатком контрастирования в блоках является плохое проникновения красителя в ткани. Однако контрастирование в блоке обеспечивает лучшую сохранность мембранных структур. После контрастирования блоков полученные УС можно докрасить при помощи УА и ЦС.
Контрастирование в УА можно осуществить после заключения в смолу, но до изготовления УС (см. Приложение, 8.4). Глубина проникновения УА зависит от типа пластика и обычно составляет 10-15 мкм. Этот метод наиболее полезен для высоковольтной ЭМ толстых срезов. Особенно хорошие результаты при таком способе дает использование 5%-ного раствора УА на метаноле. Вместо УА можно применять ФВК [70, 72, 105].

8.2.2. Контрастирование УС

Более удобным и эффективным способом контрастирования является окрашивание УС, которые могут быть подвергнуты воздействию контрастера с одной или с обеих сторон. Считается, что если сеточку с УС не погружать в каплю красителя, а положить на нее срезами вниз, то окрашиваться будет только одна сторона УС. При контрастировании УС перед красителем нет барьеров, создаваемых плазматическими мембранами, и он может непосредственно воздействовать на открытые внутренние отделы клеток. Единственное препятствие на пути красителя - это сам заливочный материал. Как полагают, заливочная среда не окрашивается - контрастируются только срезанные поверхности ткани, если ее реактивные группы не были блокированы в ходе предшествующей обработки. Окраска УС с помощью УА увеличивает контрастность рибосом, областей расположения гетерохроматина в ядре и митохондриального матрикса.
Углерод, напыленный на УС препятствует проникновению контрастера. Эпоновые УС окрашиваются быстрее, чем аралдитовые (см. Приложение, 85).
Оптимальная продолжительность контрастирования определяется несколькими факторами: заливочной средой, типом контраста, концентрацией и рН контрастера. Обычно для ЦС время контрастирования составляет 2-5 мин, для водного раствора УА 2-3 мин [11, 72, 105, 179, 367].

8.2.2.1. Процедура контрастирования

В большинстве случаев используется 2%-ный водный раствор УА. На дно чашки Петри укладывают лист фильтровальной бумаги, смоченный водой, на него помещают пластинку зубного воска (или парафильма), поверх которого наносят капли водного раствора УА; чаще сеточка с УС плавает на капле. Чашку Петри закрывают. Влажная атмосфера в чашке позволяет предупредить высыхание контрастера, что дает возможность обрабатывать срезы от 15 мин до 18 ч в темноте при комнатной температуре. Путем повышения температуры до 40-60®С. можно ускорить процесс окрашивания, однако надо следить за тем, чтобы не расплавился воск. Краситель перед применением надо центрифугировать (5000 g, 20 мин) или фильтровать через миллипоровые фильтры. Мутный раствор использовать нельзя. Сеточки захватывают пинцетом и промывают путем многократного (до 25 раз) погружения в бидистиллированную воду; необходимо действовать аккуратно, чтобы не порвать срезы или подложку.
Для отмывания можно либо поместить сеточку срезами вниз на крупную каплю дистиллированной воды, либо на сеточку, которая удерживается пинцетом, капать воду из пластикового контейнера.
После контрастирования с помощью УА сеточку или сразу же контрастируют с помощью ЦС, или же высушивают и некоторое время перед контрастированием хранят в контейнере.
При переносе сеточек необходимо оттягивать воду между браншами пинцета, иначе сеточка оказывается в капле на одной из бранш или же происходит загрязнение следующего раствора. Бранши пинцета надо держать чистыми и без заусениц. Протирать бранши удобно с помощью фильтровальной бумаги, а удалять заусеницы пилочкой для ногтей. При использовании никелевых сеточек пинцет и сеточку надо размагничивать в специальном устройстве.
Можно контрастировать сеточки и погружением их в краситель. Для этого надо осторожно вдавить сеточки в пластинку размягченного с помощью тепла воска, поместить на них каплю воды, а затем контрастера. Преимущество данного метода в том, что при использовании сеточек без подложек срезы окрашиваются с двух сторон.
Некоторые смолы с множеством поперечных связей не позволяют водным растворам УА контрастировать ультраструктуру (смола Сперра, например). В этом случае рекомендуется использовать спиртовые растворы УА (чаще на этаноле или метаноле). Резервуары и контейнеры с этанолом и метанолом должны быть более герметичными. Чаще всего применяют 2-4%-ные или насыщенные растворы УА в 50%-ном этаноле. Насыщенный раствор готовится как минимум за день до окрашивания, поскольку УА растворяется очень медленно. Перед использованием его надо от-центрифугировать (5000 g, 15-20 мин). Время контрастирования 15-30 мин при комнатной температуре для большинства эпоксидных смол.
В случае применения смолы Сперра необходимо увеличить время контрастирования до 1-2 ч, а температуру - до 40-60®С. При увеличении времени контрастирования и температуры сеточки лучше помещать не на поверхность капли, а внутрь нее. После окрашивания сеточки с помощью пинцета очень быстро (!) переносят в несколько смен 50%-ного этанола, затем промывают и кладут на фильтровальную бумагу, а после высыхания контрастируют с помощью ЦС. Можно сразу после обработки спиртовым раствором УА перенести сеточку вначале в 25%-ный этанол, затем в бидистиллированную воду и в раствор ЦС.
Для растворения УА лучше использовать абсолютный метанол, в котором может быть получен 25%-ный раствор УА. В этом случае нельзя применять коллодиевые подложки, которые растворяются в метаноле. Метакрилаты также немного растворимы в метаноле. Сеточки погружают в раствор и окрашивают в течение 10-15 мин, после чего с помощью пинцета извлекают и промывают 10-25 раз в 3-4 сменах абсолютного метанола. Переносить сеточки надо очень быстро. Для контрастирования в УС можно также применять 2%-ный УА в абсолютном метаноле с добавлением 1 % диметилсульфоксида для улучшения проникновения красителя.
Переконтрастирование УА проявляется в виде характерного пылевидного осадка в цитоплазматическом матриксе клеток. Такой же осадок может наблюдаться на подложке, вне срезов. Иногда возникают картины ложного негативного контраста. Для устранения преципитации рекомендуется, во-первых, фильтровать раствор УА перед употреблением, во-вторых, использовать быстрое отмывание сеточек в спирте а затем в воде [11, 179] (см. Приложение, 8.5.3).

8.2.2.2. Контрастирование с помощью ЦС

Перед началом контрастирования в маленькую чашку Петри следует налить расплавленный воск. Можно для этих целей использовать пластинку тефлона или пленку парафильма. Когда воск застынет, чашку с воском надо поставить в чашку Петри большего диаметра, на дно которой необходимо положить гранулированный едкий калий (натрий) или фильтровальную бумагу, пропитанную раствором NaOH, который будет связывать двуокись углерода. На поверхность воска накапывается раствор ЦС. Капли лучше наносить с помощью глазной пипетки правой рукой, а левой придерживать крышку чашки Петри так, чтобы защитить краситель от дыхания. В капли положить сеточки со срезами, закрыть крышку. Время контрастирования - от 5 до 30 мин при комнатной температуре. Окрашенные срезы промыть и высушить.
Воск на чашках Петри и пипетки, которыми пользуются во время окрашивания, каждый раз тщательно отмывают. После свинца их моют щелочью и водой, а после УА - этанолом и водой. Полностью отмыть воск не всегда удается, и тогда при повторном использовании срезы загрязняются. Чтобы избежать этого, можно исключить процедуру промывания воска. В чистую чашку Петри в-таком случае каждый раз кладут предметные стекла, на которые нанесен слой парафина (воска). Использованный парафин не моют, а удаляют и наносят новый.
Раствор ЦС при правильном приготовлении и хранении может использоваться в течение 6 мес. (см. Приложение, 852). Даже если появилась небольшая мутность, краситель станет пригодным к применению после центрифугирования (5000 g, 10 мин) или фильтрования через миллипоровый фильтр. Можно разлить краситель по 1 мл в пластиковые закрывающиеся трубочки и отцентрифугировать. Если осуществляется миллифильтрация, то желательно вначале пропустить через фильтр несколько миллилитров 0.01 М NaOH для удаления смачивающих веществ, применяемых при изготовлении фильтра.
Раствор ЦС сохраняется более 5 месяцев, если сразу после приготовления его отфильтровать через миллипоровый фильтр, подсоединенный к одноразовому шприцу, в закрытый резиновой пробкой (прокалывается иглой) пузырек, из которого потом вытесняется воздух с помощью баллончика с инертным газом (фреоном). Краситель извлекается из пузырька с помощью шприца и иглы, которой прокалывается резиновая пробка. Вначале сеточки с УС рекомендуется поместить так, чтобы они плавали на поверхности большой капли свободной от углекислоты воды срезами вниз (см. Приложение, 8.1). Затем сеточки поднимают так, чтобы со стороны срезов осталась только небольшая капелька воды, и помещают плавать на свежую каплю раствор ЦС, которая не должна находиться в чашке более 15-30 мин. ЦС нельзя использовать повторно. Контрастирование длится от 30 с до 15 мин, затем сеточку поднимают с капли так, чтобы на срезах осталась большая капля контрастера, и немедленно 25 раз окунают в свежеприготовленный 0.01 М раствор NaOH, а потом в бидистиллированную воду, свободную от углекислоты. Избыток жидкости между браншами пинцета необходимо удалять. Затем сеточки высушивают. Свежеприготовленный или долго хранившийся контрастер рекомендуется вначале проверить на небольшой партии УС [11, 70, 367].

8.2.2.3. Многокомпонентное контрастирование

При совместном использовании УА и ЦС контрастность препарата увеличивается в значительно большей степени, чем при раздельном применении этих веществ. Поскольку обычно до этого ткань окрашивалась в ЧО, то данную процедуру правильнее назвать "тройным окрашиванием" [72]. Еще большей контрастности можно достичь последовательным контрастированием УС с помощью ЦС, УА и снова ЦС.
Объекты можно окрашивать в блоках с помощью УА, а затем в УА и ЦС контрастировать уже УС на сеточках. В большинстве лабораторий вначале УС окрашивают УА, а затем ЦС. После каждого красителя УС тщательно промывают. Используемые совместно УА и ЦС дают довольно стабильные результаты. Обычно двойное окрашивание УС производят по следующей схеме: 1) окрашивание с помощью УА (в термостате) - 15 мин; 2) промывание в воде; 3) высушивание на воздухе; 4) окрашивание с помощью ЦС при комнатной температуре - до 30 мин; 5) промывание в воде; 6) высушивание на воздухе.
Если срезы плохо контрастируются обычным способом, то хорошие результаты получаются в случае применения следующей схемы окрашивания: 1) окрашивание с помощью ЦС - 1-5 мин; 2) промывание; 3) высушивание; 4) окрашивание с помощью УА -40 мин; 5) промывание; 6) высушивание; 7) окрашивание повторно с помощью ЦС - 20 мин; 8) промывание; 9) высушивание.

8.3. УСЛОВИЯ КОНТРАСТИРОВАНИЯ

Для контрастирования надо использовать свежие и сверхвысокочистые реактивы, хранить растворы свинца в химически чистой, герметически закрытой темной посуде. Для уменьшения контакта контрастирующего раствора с углекислотой воздуха удобно хранить его в шприце, прикрывая после употребления канюлю шприца колпачком; контрастирование сеточек надо вести либо в атмосфере инертного газа, либо в присутствии поглотителя углекислого газа - сухой щелочи. Перед ополаскиванием следует удалить остатки контрастирующего раствора с сеточки и пинцета чистой фильтровальной бумагой. Если проводится двойное контрастирование, то необходимо строго следить за тем, чтобы в раствор, содержащий свинец, помещались УС, тщательно отмытые и высушенные после контрастирования в УА.
Часто используют окрашивание сразу нескольких сеточек, помещенных в специальный изолированный от атмосферы контейнер (такие контейнеры выпускает ряд фирм), с помощью коммерческих реагентов [71, 105, 139].
Надо помнить, что ионизация объекта под действием электронного луча может изменять его свойства и загрязнять поверхность, изолируя компоненты клеток от молекул красителя. УС лучше контрастировать непосредственно перед просмотром в ЭМ [11, 179]. Возникающие нередко после контрастирования загрязнения срезов можно существенно уменьшить, если УС держать после резания влажными, а высушивать уже после окрашивания, защитив от пыли. Предложен простой метод удаления осадков после двойного контрастирования: промывание сначала в 10%-ной свежеприготовленной уксусной кислоте (1 мин), затем в воде [224].

8.4. ПРИМЕНЕНИЕ МОРДАНТОВ

Мордант - это химическое вещество, которое так меняет структуру тканей, что они становятся более восприимчивыми к последующим красителям. Термин "мордант" происходит от французского слова mordre - кусать. В качестве мордантов может выступать таниновая кислота (ТК), эффект которой обеспечивается в основном галловой кислотой, реагирующей с карбоксильными группами. Обработка галлоилглюкозой фиксированной ткани существенно увеличивает контрастность препаратов (см. Приложение, 8-5.4). Использование галлоилглюкозы и ТК позволяет улучшить сохранность ультраструктур, увеличить контрастность и выход реакционного продукта при гистохимических реакциях, уменьшить экстрагирование осмиевой черни во время дегидратации. С той же целью после постфиксации и отмывания в буфере объекты можно обработать в 4%-ном растворе галаскорбина (вместо ТК) и снова промыть [3].
Обработка УС с помощью ТК и водного раствора УА увеличивает контрастирование частиц гликогена и коллагеновых фибрилл, но блокирует окрашивание других клеточных компонентов, обычно контрастируемых УА [354]. Специфичность мордантного эффекта зависит от морданта, а не от используемой соли тяжелого металла. Комбинация ТК + УА + ЦС создает интенсивную контрастность и особенно высокую электронную плотность частиц гликогена [83].

8.5. НЕГАТИВНОЕ КОНТРАСТИРОВАНИЕ

Негативное контрастирование (см. Приложение, 8.6) обеспечивает получение высокого разрешения при исследовании биологических макромолекул и изолированных ультраструктур. При этом вокруг объекта создается гомогенный фон вещества большой электронной плотности. Негативный контрастер увеличивает контрастность биологических частиц путем инфильтрации пор и неровностей на поверхности образца и окружения электронно-прозрачного объекта электронно-плотным материалом: биологический объект
выглядит как электронно-прозрачная область на фоне электронно-плотного окружения. Иногда можно обходиться без фиксации. Методика проста и непродолжительна. Для изучения тканей метод малопригоден (рис. 26).

0x01 graphic

Рис. 26. Схема формирования изображения объекта при негативном контрастировании. А - вид сбоку; Б - вид сверху. 1 - объекты; 2 - раствор соли тяжелого металла; 3 - стекло.
Разрешение при негативном контрастировании выше, чем в случае УС. Предел разрешения определяется размером частиц высушенного красителя. При использовании ФВК предел разрешения составляет приблизительно 1.2 нм. Если применяется урановая соль муравьиной кислоты, то разрешение несколько выше [172, 173].

8.5.1. Красители для негативного контрастирования

Вещества, применяемые для негативного контрастирования, должны, во-первых, не вступать в реакцию с объектом, во-вторых, быть хорошо растворимыми и иметь высокую электронную плотность, в-третьих, иметь высокую точку плавления и быть термически стабильными для предупреждения сублимации и плавления под электронным лучом (табл. 4).

Таблица 4. Вещества, используемые для негативного контрастирования

Соль	Концентрация, %	Для контрастирования следующих структур
Молибденацетат	1-3	Мембраны, субъединицы ферментов, клеточные фракции
ФВК	0.5-2	Вирусы, бактерии, клеточные фракции, замороженные срезы, макромолекулы (ДНК, актин, ферменты)
УА	0.5-2	То же
Уранилмагнезиумацетат	1	То же
Уранилоксалат	0.012 М	Небольшие макромолекулы
Уранилформат	0.5-2	То же

Для разных объектов используют различные контрастирующие вещества. Очень часто для улучшения окраски необходимо подобрать рН. Буферный раствор, в котором суспензированы объекты, может не подходить для смешивания с негативным контрастером. В этом случае следует применить диализ.
Для негативного контрастирования используют молибдат аммония (2-4%-ный), ФВК в виде натриевой или калиевой соли (1%-ный), кремневольфрамовокислый натрий, (2%-ный, рН 7.0), УА (0.5-2%-ные растворы, рН 2.0-5.0), уранилоксалат (см. Приложение, 8.6.2), уранилформиат, который особенно хорошо контрастирует микрорельеф (1%-ный, рН 5.0). Время окрашивания - несколько минут. Наиболее популярны УА и ФВК.
Урановые соли быстро кристаллизуются под электронным пучком. Кроме того, УА при негативном контрастировании может "положительно" окрашивать исследуемую структуру. Его микрокристаллы под действием пучка электронов могут перемещаться по подложке. Наконец, он способен вызывать агрегацию изучаемых частиц. Преимуществом УА и уранилформиата является их самая высокая электронная плотность.
Молибденацетат удобен для негативного контрастирования осмотически чувствительных органелл по той причине, что его 2%-ный раствор является изотоничным. Однако он менее электронно-плотен, чем другие красители.
Фосфорно-вольфрамовокислые натрий и калий широко используют для негативного контрастирования вирусных частиц, белковых молекул и липосом, однако эти красители оказывают разрушительное воздействие на многие мембранные системы. Фосфорно-вольфраматы взаимодействуют с липопротеинами с образованием "миелиновых фигур". Кремневольфрамовокислый натрий дает мелкогранулярный осадок [172, 173].

8.5.2. Приготовление негативных контрастеров

УА растворяется с использованием интенсивного перемешивания в бидистиллированной воде в концентрации 1-2 %. Раствор готовится за сутки до использования, так как УА плохо растворяется в воде. Раствор должен быть прозрачным и храниться в защищенном от света месте. Нельзя применять ФБ при контактировании с УА, так как в этом случае УА выпадает в осадок.
ФВК готовится в виде 1-2%-ного раствора. рН устанавливается в пределах от 5.0 до 7.0 с помощью 1 М КОН. Если рН ниже 6.0, то краситель стабильно хранится в холодильнике в течение многих недель. Для улучшения растекаемости красителя к нему добавляют несколько капель бычьей фетальной сыворотки, 3-4 капли 10%-ного крахмала или бычьего сывороточного альбумина (БСА) до конечной концентрации 0.01 %. Для достижения изоосмотичности к раствору можно добавить 0.4 % сахарозы, однако она разлагается под пучком электронов и загрязняет колонну микроскопа. ФБ совместим с ФВК.
Молибденацетат (1-2%-ный раствор на бидистиллированной воде) используется для негативного контрастирования субъединиц ферментов, мембран, различных клеточных фракций. Получаемая контрастность меньше, чем в случае УА, но фон более мелкозернистый что и обеспечивает лучшее по сравнению с УА разрешение. Молибденацетат не так стабилен, как ФВК, но аналогичен по этому параметру УА [9,172, 173].

8.5.3. Общая схема негативного контрастирования

Успех негативного контрастирования зависит от того, будут ли агрегировать частицы и насколько случайно они распределены по подложке. Краситель может смешиваться с взвесью объекта до нанесения его на подложку, либо наносится на подложку после адгезии к ней объекта. Суспензирование образцов в растворе контрастера позволяет получать различную ориентацию изучаемых частиц на подложке.
При обычной процедуре негативного контрастирования концентрация частиц должна быть порядка 10^-6 - 10^-7 на 1 мл. Раствор исследуемого белка должен иметь концентрацию 0.1-0.2 мг/мл, суспензия липидов - 0.1-0.5 мг/мл, взвесь клеток и клеточных мембран - 0.5-1.0 мг/мл. При подборе оптимальной концентрации важно добиться, чтобы не было наложения частиц друг на друга. Контрастируемый материал обычно суспензируют в гипотонических растворах. При негативном контрастировании осмотически чувствительных структур (митохондрий, хлоропластов и других окруженных мембранами органелл) часто приходится в течение 12-24 ч проводить диализ фракций против изотонических растворов веществ, таких как ацетат аммония и карбонат аммония. Наиболее простыми методами негативного контрастирования являются метод нанесения капли на сеточки и метод касания капли.
При проведении негативного контрастирования углеродную подложку рекомендуется выдержать в тлеющем разряде в присутствии паров аммиака. Можно использовать УФО и погружение подложки в раствор вещества, богатого катионными группировками, например альцианового синего или полилизина. Такая обработка существенно увеличивает адсорбцию отрицательно заряженных биологических объектов. Однако краситель может заполнить микронеровности подложки, что увеличивает уровень "шума".
Существуют различные способы нанесения образцов на подложку.

8.5.3.1. Метод капли

На взятую пинцетом сеточку с подложкой наносят каплю взвеси объекта. Через 1 мин после адсорбции объектов поверхностью на сеточку помещают каплю раствора для негативного контрастирования. Избыток жидкости удаляется путем касания конца сеточки фильтровальной бумагой. После высушивания в течение 15-30 мин образец может быть исследован в ЭМ. Можно смешать взвесь образца с красителем (1: 1, по капле) на пленке парафильма, а затем каплю смеси поместить на сеточку.

8.5.3.2. Метод флотации

Сеточку с подложкой помещают на поверхность капли взвеси объекта. За 1 мин объект успевает адсорбироваться на поверхности подложки. Затем сеточку с объектом переносят на рядом расположенную каплю раствора негативного контрастера на 30 с и высушивают.

8.5.3.3. Метод распыления

Раствор красителя смешивают с взвесью объекта и напыляют на подложку. При анализе патогенных частиц такая процедура представляет большую опасность для здоровья. Взвесь материала готовят обычно в 1%-ном водном растворе контрастера и из пульверизатора либо с помощью микропипетки наносят на поверхность сеточки с подложкой. Сеточки высыхают почти мгновенно, и образуется тонкая пленка красителя, заключающая в себе объект [9, 172, 173].

8.6. КОНТРАСТИРОВАНИЕ ПРИ КРИОЗАЛИВКЕ

После фиксации альдегидами и заливки в Ловикрил визуализация ультраструктур в ТЭМ обусловлена главным образом рельефом поверхности получаемых УС [309]. Поэтому требуется контрастирование. В большинстве случаев ловикриловые УС контрастируют 3%-ным водным раствором УА (5 мин), а затем ацетатом или цитратом свинца по Миллонигу (45 с). Можно улучшить контрастность путем введения УА при дегидратации [94, 97, 309].
Разработан очень эффективный способ контрастирования ловикриловых УС - адсорбционное контрастирование раствором УА в метилцеллюлозе (МЦ) [309]. Сеточки с УС помещают на поверхность капли раствора, содержащего 1.8 % УА и 0.2 % МЦ (рН 4.5-6.0), затем удаляют избыток жидкости путем прикосновения края сеточки к фильтровальной бумаге. УС высушивают на воздухе. Приготовление 2%-ного раствора МЦ (Methocell, Fluka) осуществляется путем добавления порошка при постоянном перемешивании к нагретой до t=95®С воде. Затем раствор выдерживают на льду в течение 8 ч, центрифугируют при 55000 об./мин в Бекмановской центрифуге в течение 1 ч при t=4®С, хранят в холодильнике. Контрастирование УС из гидрофильных акрилатов с помощью УА + МЦ основано на том, что УА аккумулируется в щелях, формирующихся в процессе резания в месте контактирования мембран объектов с акрилатами, обеспечивая их высокую электронную плотность. МЦ выполняет функцию среды, содержащей УА, кроме того, она защищает УА от преципитации.
Для контрастирования ловикриловых УС рекомендуются следующие режимы: 1) насыщенный водный раствор УА (если НМ20 и НМ23, то 25-35 мин; если К4М и КИМ, то 5-15 мин); 2) тщательное промывание в трех сменах по 5 мин; 3) ацетат свинца по Миллонигу (можно использовать ЦС) в течение 1-3 мин. Необходимо удалить углекислый газ из камеры для контрастирования. УС из ловикрилов К4М и КИМ перед помещением на каплю раствора УА рекомендуется поместить на короткое время на каплю воды (см. Приложение, 85.5).

8.7. КОНТРАСТИРОВАНИЕ КРИО-УС

Для предупреждения образования мембранных везикул на нефиксированных замороженных срезах (реакция на обнажение гидрофобного слоя мембраны при скалывании) можно использовать обработку срезов вначале нейтральным, а затем кислым раствором УА.
К сожалению, интенсивность контрастирования значительно варьирует от среза к срезу. Это связано с тем, что из замороженных срезов контрастер быстро и неравномерно вымывается. Для того чтобы этого избежать, используют контрастирование в смеси УА + МЦ без отмывания в воде (см. Приложение, 85.6).
Вначале крио-УС стабилизируют, контрастируя их 10 мин в крупной капле 2%-ного нейтрального УА, который готовят путем смешивания равных объемов 4%-ного УА и 0.3 М оксалата калия (рН доводят до 7.0-7.4 путем добавления небольших объемов 10%-ного гидрохлорида аммония), промывают в 4-6 крупных каплях воды, переносят на каплю 1.8-2%-ного раствора МЦ, содержащего 0.1-0.4 % кислого УА, на 10 мин; можно также использовать смесь, содержащую 1.8 % ПЭГ-1540, 0.2 % МЦ (вязкость 400 или 1500 сП) и 0.005-0.1 % кислого УА. Каждую сеточку поднимают с помощью платиновой петли и после удаления избытка заливочной среды фильтровальной бумагой высушивают на воздухе. Избыток жидкости надо удалять только до такой степени, чтобы высушенная пленка заливочной среды имела серебристо-золотой или золотисто-голубой цвет [309].
Часто после этой процедуры крио-УС обнаруживают специфические черты негативного контрастирования: контрастер больше концентрируется вокруг органелл, чем в цитоплазматическом матриксе. Этот метод применяют, если маркером служит коллоидное золото (КЗ), а не ферритин, поскольку после негативного контрастирования частицы ферритина плохо выявляются [172].
Эти методы чаще используют для контрастирования мембранных структур. Для контрастирования фибриллярных структур крио-УС вначале обрабатывают (15 мин) 1%-ным ЧО, промывают два раза в воде, обезвоживают в двух сменах этанола и два раза промываются в амилацетате. Каждая промывочная или дегидратационная процедура продолжается 2 мин. Сеточки затем оставляют в 1%-ном растворе этилцеллюлозы, приготовленном на амилацетате, на 10 мин, вынимают с помощью пинцетов, немедленно касаются сеточки со срезом фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.
При контрастировании крио-УС в смеси УА и поливинилового спирта, если соотношение их концентраций 1 : 10 (0.2-0.3 % УА и 2-3 % поливинилового спирта), контрастирование будет позитивным, если 1 : 1 или 10 : 1 - негативным. Контрастирование УА можно усилить с помощью ЦС. Для этого после окрашивания 2%-ным кислым УА сеточки промывают в воде и помещают на каплю смеси, содержащей 0.002-0.01 % ЦС и 3 % поливинилового спирта, на 5-10 мин, а затем заключают в эту смесь. Можно сделать по-другому: после контрастирования в УА промыть в воде, окрасить в 0.3%-ном ЦС (2 мин), промыть в трех каплях воды и поместить в смесь УА и поливинилового спирта. В первом случае опасен контакт с воздухом, что приводит к образованию частиц (5-10 нм) карбоната свинца. Крио-УС можно контрастировать в 40 [161, 350] (см. Приложение, 8.5.6).

8.8. АРТЕФАКТЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ КОНТРАСТИРОВАНИИ

Артефакты появляются в основном при недостаточном или избыточном окрашивании структур, в случае использования старых растворов, грязных реактивов и др. Артефакты часто обусловлены наличием электростатического заряда на поверхности среза, изменениями температуры воздуха и влажности.
Контрастеры легко реагируют с двуокисью углерода, образуя нерастворимые осадки. ЦС при взаимодействии с двуокисью углерода, который может быть растворен в воде или содержаться в воздухе, образует углекислый свинец. Последний в виде мелких темных частиц оседает на срезах, делая их совершенно непригодными для изучения. Предотвратить это часто бывает чрезвычайно трудно, да же если очень тщательно оберегать краситель от контакта с углекислым газом. ЦС иногда откладывается в виде скоплений размером 5 нм, что существенно ограничивает разрешение.
УА на срезах часто выпадает в виде игольчатых или ромбовидных кристаллов умеренной электронной плотности или гранулярных скоплений, а ЦС - в виде прямоугольных кристаллов высокой электронной плотности. Форма кристаллов может меняться в зависимости от условий контрастирования.
Осадки карбонатов свинца имеют округлую форму и часто оказываются сгруппированными вблизи переплетов сеточки. При сильном загрязнении они покрывают весь препарат.
Нечеткость мембран, которые выявляются не сплошной линией, а конгломератом точек и мелких гранул, может быть результатом не только плохой фиксации, но и плохого контрастирования. Своеобразным артефактом является ложная негативная контрастность, иногда возникающая при избыточной обработке срезов насыщенным раствором УА.

8.8.1. Артефакты микроскопии

Под пучком электронов может сублимироваться заливочная среда, уменьшая толщину среза. Кроме того на срезах под пучком могут образовываться углеводородные пленки, увеличивающие общую электронную плотность среза. Поэтому желательно вначале делать снимки на малом увеличении (с малой лучевой нагрузкой на объект), а потом на большом. Возможен тепловой дрейф срезов, обнаруживаемый при больших увеличениях. Рекомендуется в начале просмотра объектов расфокусировать электронный пучок для стабилизации исследуемых срезов [11,121].
Глава 9 ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ ГИСТОХИМИЯ

9.1. ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Среди множества гистохимических методов, применяемых для СМ, лишь небольшое число адаптировано для ЭМ. Это связано с тем, что конечный продукт реакции должен быть электронно-плотным, не растворяться и не смещаться в процессе препарирования, быть стабильным под электронным пучком. ЭМ-гистохимия стремительно развивается, однако из-за ограниченного объема книги мы не в состоянии привести все ее методы (см. Приложение, 9), число модификаций которых насчитывает десятки тысяч наименований (подробнее см. [15, 235]).

9.2. ЭМ-ГИСТОХИМИЯ ФЕРМЕНТОВ

Ферментная ЭМ-гистохимия - это комплекс методов ЭМ-визуализации ферментов в тканях и клетках. Их цель - продемонстрировать наличие ферментативной активности на морфологически хорошо сохраненных тканях. Метод считается прецизионным, если электронно-плотный осадок конечного продукта реакции локализуется в месте прижизненной локализации фермента in vivo, воспроизводимым, если дает воспроизводимые результаты независимо от места и времени проведения, специфичным, если продукт реакции образуется исследуемым ферментом, и пропорциональным, если количество образующегося продукта реакции пропорционально активности фермента in vivo [15, 235].
ЭМ-гистохимия ферментов использует способность ферментов при расщеплении субстратов выявлять места своего расположения. Для проведения ферментной реакции экзогенный субстрат добавляют к биологическому объекту, непрореагировавший материал отмывают, а объекты готовят для ЭМ-исследования с применением более или менее стандартной процедуры. Общая схема гистохимической реакции может быть представлена следующим образом: экзогенный субстрат ? фермент ? нерастворимый продукт реакции ? захватывающий агент ? электронно-плотный продукт (осадок) [15, 235, 357].
Можно выделить три группы методов: 1) преципитация солей тяжелых металлов, например свинца; 2) осаждение органических неметаллических компонентов (окисление-восстановление), например солей тетразолия; 3) образование осмиофильных полимеров, связывающих осмий при последующей проводке, например ДАБ; 4) реакции со вспомогательными экзогенными ферментами (любой из вышеупомянутых принципов).
Захватывающий агент - это экзогенно добавляемое вещество, которое связывает и сохраняет (захватывает) продукты энзиматической реакции, а также делает их видимыми под ТЭМ или СЭМ. В ряде случаев требуются дальнейшие превращения захватывающего агента, для того чтобы сделать его электронно-плотным. В качестве такого реагента в большинстве случаев применяют нерастворимые соли тяжелых металлов, которые интенсивно рассеивают электроны. Наиболее часто для этих целей используют свинец, церий, магний, барий, кадмий, кобальт, медь и др. Так, фосфатные группы, освобождающиеся под действием фосфатаз, связываются свинцом с образованием нерастворимого фосфата свинца. Захватывающий агент сам по себе может быть ферментом (например, пероксидазой), который обладает способностью реагировать с другими субстратами с образованием электронно-плотных осадков.
Реакции осаждения солей тяжелых металлов обычно состоят из трех этапов: ферментативная реакция, реакция захвата (осаждения), реакция превращения в электронно-плотный продукт. Последний этап присутствует не во всех случаях.
Реакции окисления-восстановления обычно проводятся с акцепторами электронов (тетразолиями). В ЭМ используют тетранитротетразолий и тиокарбимил нитротетразолий, так как они осмиофильны. Можно применять искусственный переносчик электронов - феназинметасульфат. Эти реакции можно проводить в один этап, например для выявления цитохромоксидазы и пероксидазы [235, 357].
При проведении ЭМ-гистохимических реакций некоторые конечные продукты требуют осмирования, поэтому обработка в ЧО включена в пропись. Однако ЧО может использоваться и в качестве постфиксатора. Для улучшения контрастности объектов в этом случае рекомендуется использовать ЧО в комбинации с ферроцианидом (см. Приложение, 3.10.2) [235, 357].

9.2.1. Методы осаждения металлов при выявлении гидролитических ферментов

Наиболее типичными методами в данной группе являются методы выявления кислых гидролаз: фосфатазы, 5'-нуклеотидазы и др. Особняком стоят методы выявления АТФаз, щелочной фосфатазы, глюкозо-6-фосфатазы. Широкое применение в ЭМ нашли методы детектирования эстераз и особенно холинэстеразы.
Методы выявления оксидаз делятся на две группы: 1) с использованием ДАБ (для определения пероксидазы, цитохромоксидазы, каталазы, производных гема); 2) с использованием хлорида церия (для выявления НАДН-оксидазы и других оксидаз, дегидрогеназ). Методы ЭМ-гистохимии с ДАБ (для выявления цитохром-С-оксидазы, каталазы, пероксидазы) приобрели широкое распространение. Мономер ДАБ имеет слабо-коричневый цвет, водорастворим, тогда как полимер коричневый, осмиофильный, не растворим в воде (см. Приложение, 9.5). Существуют методы серебряного усиления ДАБ-реакции. Диффузия окисленного ДАБ в препаратах может быть предупреждена с помощью обработки тканей (после иммуноцитохимической реакции связывания) гипертоническим раствором сахарозы. В качестве ЭМ-гистохимического реагента широко применяется феррицианид. Методы с феррицианидом используются для выявления оксидаз и дегидрогеназ, эстераз и арилсульфатаз. Феррицианид в качестве искусственного акцептора восстанавливается до ферроцианида, который в присутствии ионов меди выпадает в осадок, имеющий высокую электронную плотность. Этот первичный продукт может быть усилен с помощью ДАБ и ЧО. Основанные на использовании церия методы превосходят те, что базируются на реакции с феррицианидом. Поэтому реакции выявления оксидаз здесь также не приводятся (см.: [235, 357]).
Соли тетразолия нашли широкое применение в ЭМ-гистохимии при выявлении дегидрогеназ (сукцинатдегидрогеназы, диафоразы, лактатдегидрогеназы и др.). Поглощая электроны, они легко восстанавливаются до формазанов. Для проведения реакции используют физиологические субстраты, поэтому любые дегидрогеназы и оксидазы могут выявляться с помощью солей тетразолия. Мы не приводим здесь примеров реакции с тетразолиями для выявления оксидаз и дегидрогеназ, поскольку в первом случае лучшие результаты получаются с солями церия, а во втором - с феррицианидом (подробнее см.: [15, 235, 357]). Здесь лишь отметим, что в ЭМ-гистохимии используются только производные нитросинего тетразолия, например дистирилнитросиний тетразолий, и BPST-тетразолия. Они довольно медленно проникают в ткани, поэтому к инкубационной среде рекомендуется добавлять Тритон Х-100. Обработка в ЧО из-за окисления формазана может вызывать ложные отрицательные результаты. То же иногда является следствием медленного проникновения красителя в ткани. Наконец, остающийся связанным с тканями непрореагировавший тетразолий может давать ложный положительный результат. Поэтому образцы надо тщательно отмывать.
В ЭМ-гистохимии нашла применение реакция азосочетания, например для выявления аминопептидаз. Методы с солями диазония (гексазотированный парарозанилин и гексазотированный новый фуксин) используются для ЭМ-выявления эстераз и протеаз.
Методы азосочетания очень похожи на азоиндоксиловый метод, но в качестве субстрата используется альфа-нафтилацетат.
Протеазная активность выявляется с помощью синтетических субстратов, содержащих или одну аминокислоту, или их цепочку в зависимости от специфичности реакции. Большинство протеаз и их физиологических ингибиторов очень чувствительны к фиксации, а некоторые и к колебаниям рН. К примеру, лизосомальные катепсины ингибируются при рН меньше 7.0. Добавление в инкубационную среду поливинилового спирта повышает точность этих методов.
Существуют и другие методы выявления ферментов для ЭМ-гистохимии: свинцово-оксалацетатный метод определения трансаминазы, орнитин-карбамоилтрансферазы, ацилтрансферазы, других трансфераз, карбонилангидразы [15, 235, 357].

9.2.2. Применение ионов церия - новый шаг в ЭМ-гистохимии

При использовании хлорида церия конечный продукт реакции - перекись водорода - захватывается церием с образованием нерастворимого в воде электронно-плотного осадка. Вначале церий был предложен только для выявления оксидазной активности, а затем и для захвата образующихся фосфатных ионов. Сейчас стало понятным, что в принципе все методы, основанные на осаждении металлов, могут быть осуществлены с ионами церия. Причем получаемые результаты оказываются лучше.
Недостатки иона свинца как захватывающего агента очевидны. Так, в случае применения методов осаждения свинца возможны появление неспецифических осадков свинца и диффузия продуктов промежуточных реакций. При высоких значениях рН очень сложно удержать ионы свинца в растворе, кроме того, они ингибируют активность многих ферментов. Ионы церия имеют существенные преимущества: 1) методы лучше воспроизводятся; 2) образующийся осадок имеет более мелкогранулярную структуру; 3) образуется меньше неспецифических осадков; 4) ингибирующее влияние на ферменты выражено меньше [235, 357].
Существует несколько способов увеличения проницаемости тканей для церия: 1) преинкубация в среде без субстрата; 2) добавление к инкубационной среде 0.0001-0.0002 % Тритона Х-100; 3) замораживание объектов в жидком азоте. Инкубацию (и преинкубацию) обычно проводят при t=37®С в течение 10-60 мин (в зависимости от ткани). Неспецифические осадки, такие как гидроокись церия, могут образовываться в щелочной среде, однако они легко удаляются путем промывания объектов в течение ночи в 6.8%-ной сахарозе на 0.1 М КБ (рН 6.0, t=4®С).
Ионы церия применяют и для выявления оксидазной активности. Одним из продуктов реакции является перекись водорода, которая связывается ионами церия с образованием, вероятно, гидроокиси церия. Осадок имеет мелкогранулярную структуру, неспецифические преципитаты не найдены. Поскольку каталаза пероксисом также образует перекись водорода, то во время проведения оксидазной реакции активность каталазы желательно блокировать с помощью добавления в среду азида натрия или 3-амино-1,2,3-триазола (а чаще преинкубации с этими веществами). Кроме церия в ЭМ-гистохимии используются стронций и барий [15, 235, 357] (см. Приложение, 9.1-9.8).

9.2.3. Условия проведения гистохимических реакций в ЭМ

Процесс препарирования, как правило, включает фиксацию (обычно альдегидную), измельчение, инкубацию с раствором субстрата, обработку захватывающим агентом, отмывание, постфиксацию, обезвоживание, заливку, подготовку к просмотру в ТЭМ. В зависимости от исследуемого фермента может отсутствовать тот или иной этап. К примеру, в некоторых случаях, для того чтобы избежать маскировки продукта реакции осмиевой чернью, постфиксацию опускают.
Криоультратомия не нашла практического применения в ферментной ЭМ-гистохимии. В крио-УС содержится слишком малое количество фермента для успешного проведения реакции. Подавляющее большинство ЭМ-гистохимических реакций основано на использовании вибратомных или криостатных срезов толщиной 40-60 мкм. суспензии клеток и, реже, измельченных образцов (до, 0.2-0.5 мм ). Разработаны методы проведения реакций на УС с повторным заключением в смолу [158].
Очень важными являются физико-химические параметры инкубационного раствора, время инкубации и т.д. Для проведения ферментной гистохимической реакции необходимы определенная температура, рН, присутствие субстрата в оптимальной концентрации. Используемый буфер должен быть совместим с реакцией. Например, КБ чаще используется в методах с применением свинцовых солей. Ферменты имеют разную субстратную специфичность. При проводке продукты реакции могут вымываться эпоксидными смолами и органическими растворителями. Субстраты и(или) захватывающие агенты проникают в ткани не более чем на 100 мкм. Созданы специальные вибратомы, которые позволяют получать срезы из нефиксированной или слабо фиксированной ткани толщиной от 10 до 150 мкм. Перед резанием объекты обычно заключаются в теплую смесь агара. После застывания агар создает необходимые условия для резки на вибратоме [15, 235, 357].

9.2.4. Фиксация и активность ферментов

Основной задачей метода ЭМ-гистохимии является необходимость одновременного сохранения ультраструктуры, активности и локализации ферментов. Для фиксации обычно используется ГА в концентрации 0.2-2 %. Изредка вместе с ГА применяется ФА для обеспечения быстрой фиксации. Режим фиксации должен подбираться для каждого исследуемого фермента отдельно.
Для того чтобы получить хорошую сохранность ультраструктур, лучше фиксировать до инкубации с субстратом. Это накладывает существенные ограничения на режим фиксации, от которого требуется в этом случае выполнение двоякой задачи: обеспечить сохранность как ультраструктур клетки, так и активности ферментов. В большинстве случаев фиксация осуществляется с помощью 4%-ного ФА при t=4®С в течение 30-120 мин. Иногда используют смеси ФА и ГА.
На активность ферментов оказывают влияние буфер, на котором растворен фиксатор, и буфер, использующийся для промывания. Например, показано, что ФБ полностью ингибирует активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Ферменты очень чувствительны к действию фиксаторов. Инактивироваться некоторые ферменты могут и в ФА. Сохранность ферментов при альдегидной фиксации находится в обратной зависимости от реакционной способности фиксатора. Фиксация обычно снижает активность ферментов прямо пропорционально способности фиксатора к образованию поперечных связей. К сожалению, морфологическая сохранность тканей возрастает с увеличением способности фиксатора к образованию этих связей. Следовательно, невозможно совместить высокий уровень ферментативной активности и хорошую морфологическую сохранность ткани. Компромиссом является использование ФА, который обладает ограниченной способностью к формированию поперечных связей.
Для лучшей сохранности ферментов можно, во-первых, фиксировать объект в присутствии субстрата, во-вторых, обрабатывать фиксированные образцы трипсином и, в-третьих, стабилизировать объекты с помощью микроволнового излучения. Фиксация может помочь в дифференцировке энзиматической активности: например, использование низких концентраций ГА не угнетает активность щелочной и кислой фосфатазы, однако разрушает нуклеозидфосфатазу [15, 235, 357].

9.2.5. Контроль

При ЭМ-гистохимическом анализе ферментов обязательно должны быть проведены все возможные контроли: 1) замена субстрата, 2) исключение субстрата, 3) активация фермента. Существуют так называемые маркерные ферменты, характерные для определенных органелл. При биохимическом изучении субклеточных фракций маркерные ферменты используются для оценки степени чистоты выделенной фракции. Например, можно оценить степень загрязненности фракции плазматической мембраны элементами комплекса Гольджи с характерной маркерной энзиматической активностью. Ферменты, меченные коллоидным золотом (КЗ), применяются для локализации субстратов на УС [93].

9.3. МЕТОДЫ УДАЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ ИЗ ТКАНЕЙ

До сих пор в ряде лабораторий используется ферментная идентификация различных веществ: вначале их выявляют окрашиванием, а затем обрабатывают срезы ферментом и смотрят, сохранилась ли окраска. Однако методы ферментного переваривания в основном имеют исторический интерес. Сравнивая ткани, подвергшиеся воздействию фермента и не подвергавшиеся таковому, иногда можно установить локализацию тех веществ, которые исчезли под влиянием фермента.
Однако при использовании указанного метода могут возникать значительные повреждения ткани [235, 357].

9.4. МЕТОДЫ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ОКРАШИВАНИЯ

Наряду с энзимоцитохимией существуют и успешно развиваются методы специфического цитохимического окрашивания. Для визуализации актина используют фрагменты миозина, которые специфически связываются с F-актином. Для перфорирования цитоплазматической мембраны клетки обрабатывают неионными детергентами - Тритоном Х-100 или Нонидетом NP-40. После обработки меромиозином актиновые филаменты декорируются таким образом, что вершина образующейся своеобразной "елочки" направлена в сторону начала актинового филамента.
Методы выявления гликопротеидов и гликозаминогликанов можно разделить на три группы: 1) производные классической ШИК-реакции, 2) основанные на сродстве ФВК при низких значениях рН к полисахаридам, 3) специфичные для кислых групп, например окрашивание рутениевым красным (РК).
Часто для выявления гликопротеидов и гликозаминогликанов используют модификации окраски Шифф-йодной кислотой. При этом реактив Шиффа обычно заменяется веществами, которые образуют отложения электронно-плотных веществ в месте реакции. Применяют ФВК (при низких значениях рН), коллоидную двуокись тория, коллоидное железо, РК, альциановый синий, соли лантана и коллоидный лантан. Добавление к ГА альцианового синего (1%-ная концентрация) делает гликозаминогликаны нерастворимыми. Образующийся в результате комплекс краситель-мудин осмиофилен и, таким образом, его можно увидеть в ТЭМ после дополнительной фиксации ткани в ЧО. Гидроксильные группы могут выявляться этилатом таллия. РК очень плохо растворим в воде. Поэтому в процессе растворения его рекомендуется растирать в фарфоровой ступке [15, 235]. Окрашивание анионных групп с помощью РК может быть осуществлено и после фиксации в ГА. Число рутениевых гранул, маркирующих анионные группы, может быть подсчитано. Рутениевые гранулы исчезают при обработке образцов растворами солей при высокой их концентрации (15-2.0 М). Для улучшения проницаемости тканей для РК добавляют Тритон Х-100, однако в этом случае сохранность ультраструктур часто оказывается неудовлетворительной (см. Приложение, 9.10 и 9.11)). Окрашивание анионных групп, напротив, резко усиливается. Для выявления отрицательно и положительно заряженных сайтов в интерстиции применяют катионные и анионные частицы КЗ. Для получения отрицательно заряженных трейцеров частицы КЗ покрывают ацетилированными и "вытянутыми" молекулами БСА, а для создания положительного заряда частицы покрывают метилированными молекулами БСА [166, 179]. Разработан новый маркер для мечения в СЭМ анионных сайтов и сиаловых кислот на поверхности клеток - КЗ, конъюгированное с хитозаном [194, 235, 357].
Для окрашивания кислых гликоконыогатов рекомендуется после заливки в водорастворимые смолы (ЛР Байт) окрашивать УС 1%-ным альциановым синим (рН 1.0-2.5, 40-90 мин), затем после промывания в кислом растворе докрашивать в 2%-ной ФВК (10-30 мин). Гликозаминогликаны связываются с коллоидными растворами. Плотный аморфный осадок образуется в местах локализации карбогидратов. Для окрашивания гликозаминогликанов часто применяется коллоидная двуокись тория, карбогидраты выявляют при помощи коллоидного железа, гликозаминогликаны можно обнаружить после обработки тканей акридиновым оранжевым. Для выявления протеогликанов используют сафранин О, а для сульфатсодержащих полианионов (например, гепаран-сульфатпротеогликан) - альциановый синий в присутствии 0.3 М хлористого магния. Гликокаликс хорошо, но неспецифически контрастируется с помощью РК или Купролинового синего (Cuprolinic Blue) (см. Приложение, 9.9). Оптимальными условиями для окрашивания гликозаминогликанов с помощью РК является добавление в растворы ГА и ЧО 0.4-0.7 % красителя. Следует использовать КБ с рН 7.4. Оптимальной следует считать осмолярность раствора в пределах 320 мОсм Ђ20 мОсм. При добавлении РК к раствору ГА рН падает до 6.95 (при концентрации красителя 0.7 %) или до рН 7.0 (при концентрации красителя 0.4 %) [15, 235, 357].
Для выявления карбогидратов и олигосахаридов применяют лектины, ТК и металлы. Можно использовать модифицированную Шифф-реакцию. Объекты обрабатывают йодной кислотой для специфического оксигенирования карбогидратов. При этом образуются альдегидные группировки. Они затем реагируют со щелочным раствором серебра, которое выпадает здесь в осадок. Вместо серебра можно использовать щелочной висмут. Карбогидраты окрашивают с помощью РК (трихлорид гексамина рутения). Карбогидраты могут окрашиваться последовательно тиокарбогидразидом и протеинатом серебра (см. Приложение, 9.12). Гликоген выявляется щелочным висмутом, кислые карбогидраты - ионами железа в комплексе с диамином, коллоидным железом, коллоидным диоксидом тория. Для визуализации карбогидратов применяется метод серебрения: вначале молекула сахара оксидируется с образованием альдегидных группировок, которые затем выявляются серебром. В этом случае нельзя применять ГА. Обычно используется ФА [15, 235, 357].
Для ЭМ-изучения гликокаликса пригодны следующие методы: 1) визуализация анионных групп кислых гликопротеидов путем связывания с электронно-плотными катионными реагентами; 2) идентификация клеточной поверхности путем отщепления гликопротеидов с помощью гликозидаз известной специфичности с последующей обработкой электронно-плотными катионными реагентами; 3) визуализация группировок гексоз путем окисления их до альдегидов с помощью периодата с последующим контрастированием; 4) высокоразрешающая радиоавтография с использованием изотопов, связывающихся с определенными группировками гликопротеидов; 5) меченые лектины, специфически связывающиеся с углеводными детерминантами клеточной поверхности. Последний метод сочетает хорошую разрешающую способность с высокой специфичностью [15,190, 235, 357]. Добавление к фиксатору тиофосфамида позволяет выявить на поверхности клеток толстый осмиофильный слой гликокаликса [33].
Для демонстрации холестерина и других стеролов применяют сапонин, Филиппин и другие антибиотики (подробнее см.: [366]).
Для ЭМ-гистохимического окрашивания белков используют ФВК, методы выявления сульфгидрильных групп. Биогенные амины окрашиваются акролеин-дихроматиновым методом, а нуклеиновые кислоты - трихлоридом индия, вольфраматом натрия, уранилацетатом. Специфическими для ДНК являются метод Фельге-на с протеинатом серебра и сочетание метода Фельгена-Шиффа с этилатом таллия. Для окрашивания нуклеиновых кислот в ГА добавляют малахитовый зеленый и нейтральный красный [190, 227].
Базальные мембраны хорошо контрастируются при последовательной обработке УС аммиаком, йодной кислотой, тиосемикарбазидом, аммиаком и желатиновым раствором метамина серебра [269]. Ионы серебра окрашивают лизосомы или энтерохромаффинные клетки. Перспективным контрастирующим агентом для внутриядерных структур является комплекс темно-фиолетового индия (III) с гематоксилином. Комплекс Гольджи окрашивается раствором ЧО [15, 157, 235, 357].
Обработка тканей с помощью ТК и УА или ТК и коллоидного железа увеличивает электронную плотность эластических волокон. Смесь ЧО и ферроцианида натрия используется для выявления гликогена, эндогенных пероксидаз, для увеличения контрастности ферритинсодержащего материала, клеточных мембран [135]. При нейтральном рН смесь ЧО с феррицианидом (при отсутствии ионов кальция) селективно окрашивает межклеточные пространства [208]. Имеется множество методов выявления неорганических ионов (калия, натрия, кальция, тяжелых металлов). Широко используется фиксация тканей в присутствии пироантимоната калия (калиевой соли сурьмяной кислоты), который при наличии катионов образует преципитат [192, 193]. Первоначально эта методика была предложена для выявления натрия, однако большая часть работ посвящалась изучению ионов кальция. При изучении локализации кальция в клетке можно не только осаждать катион с помощью аниона (пироантимонатный, оксалатный методы и др.), но и выявлять не сам ион кальция, а кальцийсвязывающие компоненты ткани. Результаты всех этих методов необходимо контролировать с помощью РМА [248].
Разработаны методы ЭМ-маркировки рецепторов, например гистаминовых, с помощью конъюгатов гистамина с ферритином [182]. Из срезов ткани, залитой в эпоксидные смолы, можно частично удалить белки и полисахариды. При этом снижается электронная плотность рибосом. ДНК можно извлечь из эпоксидных срезов с помощью хлорной кислоты. Предложены способы импрегнации эндоплазматической сети [15, 235, 357] (см. Приложение, 9.13, 9.14).

9.5. СУБСТРАТНАЯ ЭНЗИМОГИСТОХИМИЯ

Принцип данного класса методов состоит в том, что срезы тканей и клеток обрабатываются ферментами, конъюгированными с маркерами, для выявления их субстратов. Обычно используется комплекс фермента с КЗ. Наиболее оптимальное мечение достигается на хорошо идентифицируемом субстрате.
УС на никелевых сеточках инкубируют на капле 0.01 М забуференного физиологического раствора при оптимальном для фермента рН, а затем - на капле раствора комплекса фермента с КЗ (время зависит от фермента, но обычно составляет 30 мин, t=20®С), промывают струей буфера, потом водой, высушивают и контрастируют в УА и ЦС [235, 357].
Используются следующие контроли: 1) инкубация УС с комплексом фермент-КЗ с добавлением соответствующего специфического субстрата, который связывает фермент в растворе; 2) инкубация в неподходящем буфере или при неподходящем рН; 3) инкубация с комплексом, у которого ферментная активность инактивирована нагреванием; 4) инкубация с комплексом в присутствии специфического ингибитора фермента; 5) инкубация с комплексом в присутствии специфических антител против фермента; 6) инкубация с комплексом постороннего белка с КЗ; 7) продолжительная инкубация с немеченым ферментом, что ведет к экстрагированию субстрата, затем следует инкубация с комплексом фермента с КЗ; 8) обработка тканей, в которых заведомо отсутствует специфический субстрат.
Глава 10 ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ АВТОРАДИОГРАФИЯ

Гистоавторадиография (гисто-АРГ) - это метод, позволяющий с помощью изотопов и радиочувствительных эмульсий или растворов локализовать вещества на срезах и на поверхности объектов. Он дает возможность выявить экзогенные или вновь синтезированные молекулы, если их радиоактивные предшественники были метаболизированы. Возможны следующие способы мечения молекулы-предшественника с помощью изотопа: 1) замещение одного или нескольких атомов радиоактивным изотопом; 2) присоединение радиоактивного изотопа к молекуле; 3) внедрение радиоактивного изотопа или радиоактивной молекулы в избранную молекулу во время ее синтеза.

10.1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

Электронно-микроскопическая авторадиография (ЭМ-АРГ) является практически единственным морфологическим методом, позволяющим судить о динамике метаболических процессов в тканях. Наиболее часто ЭМ-АРГ используется для исследования процессов синтеза и секреции макромолекул. Этот метод полезен для изучения синтеза нуклеиновых кислот, метаболизма липидов, синтеза полисахаридов, а также более мелких молекул. Если изучают диффундирующие молекулы, то применяют криометоды. ЭМ-АРГ используется при гибридизации in situ и для локализации мест связывания гормонов. Возможно также сочетание двух методов: ЭМ-АРГ и иммуно-ЭМ [68, 107, 226].
Кристаллы бромистого серебра в фотографической эмульсии относятся к несовершенным кристаллам, т.е. таким, которые имеют различные нарушения в кристаллической решетке. Эти нарушения представляют собой включения кристаллического серебра и называются "центрами чувствительности", или "центрами проявления", от которых начинается проявление всей массы кристалла галоидного серебра. Желатина, отделяя кристаллы друг от друга, делает процесс проявления в них автономным. Он начинается не обязательно в месте попадания бета-частицы, а с центров скрытого изображения, которые могут располагаться в любом месте кристалла. Это, конечно, снижает разрешающую способность метода.
Чувствительность метода определяется минимальной концентрацией радиоактивных атомов, вызывающих восстановление серебра в фотоэмульсии [28]. Она прямо пропорциональна концентрации в срезах радиоактивного вещества и содержанию кристаллов галоидного серебра в эмульсии. Это связано с тем, что при испускании частиц ионизирующего излучения (бета-частиц) больше половины их уходит в сторону от эмульсии, а часть поглощается желатиной и не достигает кристаллов. Кроме того, не каждая частица может образовать центр скрытого изображения.
Специфичность ЭМ-АРГ определяется путем подсчета разницы в уровнях мечения в условиях введения меченой молекулы по сравнению с введением смеси меченой молекулы с 40-100-кратным избытком немеченого вещества. В последнем случае чаще всего получается 60-90%-ное уменьшение уровня мечения. Обычно реакция оценивается на ПС. In vitro специфичность может быть определена путем снижения температуры до 4®С, добавления ингибиторов, например ингибиторов синтеза белка, а также заменой гормона агонистом, антагонистом или неактивным аналогом. При исследовании биосинтеза белка естественный предшественник может заменяться метаболически инертным аналогом [25, 68, 261].

10.2. РАЗРЕШЕНИЕ

Разрешающая способность метода ЭМ-АРГ превышает аналогичный светооптический показатель в 10-15 раз и составляет 50-100 нм, что, однако, значительно меньше разрешения ТЭМ. Такая низкая разрешающая способность объясняется тем, что на автографе регистрируется не сам радиоактивный атом, находящийся в каком-либо участке структуры, а побочный эффект его действия на кристаллы бромида серебра, размеры которых довольно значительны. Следовательно, разрешающая способность метода зависит прежде всего от размеров кристаллов галоидного серебра в фотоэмульсии, толщины ее слоя и расстояния между источником излучения и эмульсией, т.е. толщины среза. Чем меньше величина кристаллов и толщина срезов, тем больше разрешающая способность метода. Если толщина срезов и диаметр кристаллов примерно равны, а эмульсия расположена монослоем, то разрешающая способность соответствует величине зерен серебра.
Рассеяние зерен вокруг источника радиации при гисто-АРГ выше, чем при ЭМ-АРГ. Расстояние между источником излучения и кристаллом бромида серебра представляет собой геометрическое отклонение (ошибку), а расстояние между центром кристалла бромида серебра и центром зерна после проявления называется фотографическим отклонением (ошибкой) метода. Суммарная ошибка составляет сумму указанных выше отклонений. В числе факторов, увеличивающих геометрическую ошибку, следует назвать толщину УС и слоя эмульсии, угол испускания (эмиссии) бета-частиц. Размеры кристаллов и зерен определяют фотографическую ошибку.
Разрешение ЭМ-АРГ зависит от следующих показателей: 1) толщины срезов, 2) толщины слоя эмульсии, 3) использованного проявителя, 4) типа эмульсии, 5) применявшегося изотопа. В лучшем случае разрешение ЭМ-АРГ не превышает 100 нм. Экспериментально установлено, что бета-частица трития может восстановить только одно зерно [25, 68, 261].
В последние годы введено понятие "половинное расстояние" - это расстояние между источником излучения и окружностью вокруг него, в пределах которой откладывается 50 % тотально проявленных зерен серебра: например, для УС толщиной 120 нм, покрытого монослоем эмульсии Ilford L4, после проявления в проявителе Microdol оно составило 165 нм [25, 68, 261].
Для оценки уровня мечения вначале подсчитывается площадь, занимаемая органеллой. Затем определяется центр каждого зерна (или с помощью кольцевой маски, или нахождением центра зерна), вокруг которого проводится круг. Радиус круга равен вероятной величине разрешения (зависит от указанных выше ошибок). Если только одна органелла локализована в пределах круга, то зерно обозначается как целое. Если в круг попадает несколько органелл, то зерно обозначается как долевое: например, если три органеллы, то к каждой относят 1/3. Затем подсчитывается абсолютный уровень мечения, который соответствует сумме целых и долей зерен для каждого вида органелл, выраженной в процентах к общему числу зерен. Относительный уровень мечения вычисляется как частное от деления абсолютного уровня на процент площади, занятой данной органеллой в данной клетке. Если относительный уровень мечения превышает 1, то можно считать, что произошло мечение данной органеллы.
Круг вокруг зерна с диаметром, равным возможному пути пробега частицы, называется кругом разрешения. Он показывает, в каких пределах может находиться источник излучения в срезе. Тритий имеет диаметр круга 1 мкм. Рисование кругов вокруг всех зерен и подсчет площади ультраструктур под этими кругами может помочь интерпретировать результаты и определить вероятность, где действительно находится источник излучения в клетке. Можно просто подсчитать органеллы под зернами или определить численную плотность гранул над данным видом органелл и сравнить с таким же показателем над другими органеллами.
Разрешение может быть существенно повышено лишь путем одновременного уменьшения толщины среза и размеров кристаллов. Существенное влияние на разрешающую способность оказывает энергия заряженных частиц - с ростом энергии увеличивается область действия излучения, а следовательно, ухудшается разрешение. Если провести подсчет, то окажется, что для трития разрешение составляет 100 нм, а для фосфора-32 - порядка 300 нм. Все множество используемых в биологии изотопов укладывается между этими пределами [25, 68, 261].
Для анализа фона вначале подсчитывается среднее число зерен вне среза, затем среднее число зерен в пределах среза. Их частное дает соотношение уровней сигнала и фона. В гетерогенных тканях за уровень фона принимается минимальное среднее количество зерен на популяцию определенных клеток. Если фон превышает 5%, то такой УС лучше не анализировать. Если фон незначителен, а сигнал (число гранул) достаточно велик, то при подсчете можно использовать точечный принцип подсчета, принимая за точку центр зерна.
Повышение фона при ЭМ-АРГ связано с самопроизвольной активацией кристаллов эмульсии во время длительного хранения, со случайной засветкой или радиационным облучением, с возникновением напряжений в слое эмульсии при высушивании, перепроявлением. Кроме этих причин сходное влияние (позитивная хемография) на эмульсию могут оказывать некоторые химические компоненты тканей, например лизосомы. Для предупреждения рекомендуется между УС и эмульсией напылить тонкий слой угля. Позитивную хемографию можно выявить с помощью препарирования немеченых УС. Хемографические зерна на электронограм-мах особенно большие и сложные. Такой же эффект оказывают медные сеточки, не покрытые подложкой. Проблема диффузии меченых молекул решается путем замены или исключения заливочных сред. Негативная хемография - исчезновение засвеченных кристаллов под действием тканевых компонентов при ЭМ-АРГ - встречается редко.

10.3. ПЛАНИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА

Перед началом исследования необходимо решить, какую молекулу пометить, в какой биохимической форме будет данная молекула использована, какова стоимость препарата и токсичность эксперимента. Обязательно следует учитывать удельную радиоактивность. Если взять слишком маленькую дозу, то экспонирование придется сделать продолжительным и из-за этого резко возрастет фоновая "засветка". Напротив, если доза очень высока, то нарушится функция клеток.
Введение изотопа может быть осуществлено импульсно (однократно) или импульсно-последовательно (за однократным введением изотопа вводят нерадиоактивный компонент). Выбор метода введения изотопа существенно влияет на интерпретацию получаемых результатов. Последовательность основных процедур метода ЭМ-АРГ представлена на рис. 27.
Место введения меченых молекул зависит от объекта исследования. Если исследуется мозг, то лучше инъецировать метку в желудочки мозга, при изучении кишечника рекомендуется вводить изотоп внутрибрюшинно, почки лучше метить с помощью внутриартериального введения изотопа и т.п. В экспериментах на млекопитающих чаще всего используется внутрибрюшинное введение изотопов (см. Приложение, 10.1).

0x01 graphic

Рис. 27. Этапы метода электронной авторадиографии. А - введение изотопа экспериментальному животному; Б - взятие кусочка ткани; Bi - получение УС (а) и ПС (б); Вг - погружение ПС на стекле в эмульсию и проведение гистоавторадиографии; Г - размещение сеточек с УС на опорных столбиках; Д - погружение проволочной петли (1) в разведенную фотоэмульсию (2); Е - подсушивание образовавшейся эмульсионной пленки; Ж - нанесение монослоя (3) эмульсии (в верхней части петли) на сеточки с УС; 3 - прикрепление сеточек с УС и эмульсией к стеклу; И - экспонирование сеточек в светонепроницаемом контейнере; К - нанесение УС на капле прямо на предметное стекло, покрытое подложкой; Л - погружение стекла с УС в разведенную фотоэмульсию; М - подсушивание эмульсии и экспонирование УС; Н - снятие подложки с покрытыми эмульсией УС на поверхность воды; О - размещение сеточек на УС; П - извлечение из жидкости плавающей подложки с УС, которую покрывают фильтровальной бумагой; Р - взятие сеточек пинцетом (4) для просмотра в ТЭМ.
После введения раствора надо выждать определенное время, для того чтобы препарат всосался в кровь и включился в определенную структуру. Затем объекты быстро фиксируют обычным способом для ЭМ [25, 68, 261].
Разрушение меченых молекул в организме способствует усилению фона. На получаемых препаратах, особенно в конце эксперимента, не все излучение исходит от введенных молекул. Источником его являются также метаболиты введенной молекулы. Поэтому в подобных случаях меченые молекулы рекомендуется вводить внутривенно, а не внутрибрюшинно, поскольку в последнем случае меченое вещество проходит через печеночные микрососуды и интенсивно метаболизируется. [25, 68, 261].
При изучении биосинтетических процессов обычно используют дозы радиоактивных предшественников 10-40 мкКи на 1 г массы, для исследования связывания гормонов лигандами применяется внутривенная инъекция в дозе менее 1 мкКи/г. In vitro используется концентрация лигандов 0.2 мкКи/г.
Время экспонирования УС для ЭМ-АРГ колеблется в зависимости от задач исследования от 1 до 12 мес. Большинство исследователей проводят экспонирование при t=4®С, хотя можно это делать при t=20®С. Более низкая температура уменьшает хемографический эффект.
Перед проведением ЭМ-АРГ можно проверить корректность процедур на ПС с помощью гисто-АРГ. ПС содержат большее количество изотопа и требуют для экспонирования меньше времени. Время экспозиции для ЭМ определяется по количеству зерен на ПС. Одна неделя светооптической экспозиции эквивалентна месяцу экспозиции для ЭМ (см. Приложение, 10.2).
При использовании метода ЭМ-АРГ рекомендуется готовить в 5-10 раз больше УС, чем обычно.

10.4. УСЛОВИЯ ЭМ-АРГ

На чувствительность метода сильно влияют процесс проявления, а также регрессия скрытого изображения. Причиной исчезновения скрытого изображения является "реокисление". Наиболее значительных размеров (до 60 %) оно может достигать при длительной экспозиции и, таким образом, ставит под сомнение воспроизводимость и количественную оценку метода. Размеры регрессии можно контролировать, экспонируя препараты в атмосфере сухого азота без кислорода или в атмосфере углекислого газа при t=О®С над осушающим реагентом.
Наиболее широко используемым маркером в ЭМ-АРГ является тритий, который испускает бета-частицы с коротким пробегом. В меньшей степени применяется изотоп серы ³⁵S. Период полураспада трития составляет 125 лет. Время, необходимое для того чтобы то незначительное количество вещества, которое содержится в срезе толщиной 60 нм, облучило фотографическую эмульсию, лежит в пределах от 2 до 3 мес.
Если в экспериментах используются радиоактивные препараты высокой удельной активности, то надо следить, чтобы они были свежими, поскольку при длительном хранении таких веществ происходит их разрушение под действием собственного радиоактивнбго излучения (радиола). Кроме того, при подготовке образцов следует помнить о возможности неспецифического связывания вводимых радиоактивных аминокислот, что может имитировать высокий уровень радиоактивной метки и адсорбции нуклеотидов внутриклеточными структурами. Для предупреждения данного явления необходимо после фиксации в ГА длительное время (1-2 сут) промывать ткани буфером, после чего постфиксировать в ЧО [25, 68, 261].

10.5. МЕТОД ЭМУЛЬСИОННОЙ ЭМ-АРГ

Методы ЭМ-АРГ разделяют на эмульсионные и адсорбционные. Общая схема метода эмульсионной ЭМ-АРГ следующая. Радиоактивный компонент вводят в живой организм или в часть его (жизнеспособность последней поддерживают с помощью методов культивирования тканей). Через некоторое время образцы фиксируют и заключают в смолы, затем из них изготавливают срезы, которые покрывают или приводят в контакт с фотографической эмульсией или радиочувствительным веществом. Через несколько недель или месяцев (применение эмульсии) или часов (применение радиочувствительного раствора) инкубации под действием ионизирующего излучения, выделяющегося из изотопа, происходит экспонирование эмульсии, наступают изменения, которые можно проявить с помощью фотографического процесса. Проявленная эмульсия и препарат наблюдаются одновременно. Полученный препарат называют радиоавтографом. Аминокислоты, нуклеозиды, сахара и некоторые липиды, используемые в качестве меченых предшественников, хорошо сохраняются с помощью обычных методов препарирования. Для визуализации нейтральных жиров, стероидов, нативных пептидов и некоторых других веществ лучше использовать замораживание.
С каждого блока, предназначенного для ЭМ-исследования, рекомендуется изготовить ПС и сделать светооптический автограф с целью предварительного анализа материала. Такой анализ позволяет, во-первых, сравнивать общий характер распределения зерен в свето- и ЭМ-автографах и выявлять возможные артефакты, во-вторых, выбирать участок для ультрамикротомирования не только по морфологическим особенностям, но и по содержанию метки, в-третьих, ориентировочно судить о сроке экспонирования ЭМ-радиоавтографа по плотности зерен над структурами ПС. Если эта плотность после экспозиции в течение 3-5 сут низка, то не стоит бесполезно тратить недели и месяцы на ожидание хороших результатов от эксперимента с применением ЭМ-АРГ.
При исследовании кусочков органов, удаленных при биопсии, разрезанные на мелкие кусочки (OS • 0.5 • 1.0 мм) объекты рекомендуют [68] помещать в охлажденную до t=2®С смесь среды 199 с сывороткой крупного рогатого скота в отношении 9 : 1. На каждые 5.5 мл полученного раствора советуют добавить 500 мкКи меченного изотопом предшественника, например уридина (удельная активность не менее 24 Ки на 0.001 М), и перенести флаконы в термостат (t=37®С) на 15 ч. Во время инкубации через раствор медленно пропускается кислород. Далее кусочки промывают холодной средой (1 смена), ФБ (рН 7.4; 3 смены) и фиксируют в течение 15 ч 25%-ным раствором ГА. После фиксации кусочки оставляют на ночь в ФБ с 10-кратной сменой раствора для отмывания невключившегося в РНК предшественника. После этого следует постфиксация в ЧО и заливка в эпоксидную смолу.
При изучении с помощью ЭМ-АРГ легко диффундирующих молекул можно рекомендовать следующие подходы: 1) фиксация с помощью тщательно подобранного фиксатора, который образует осадок с мечеными молекулами; 2) замораживание-высушивание или замещение в замороженном состоянии; 3) лиофилизация крио-УС (в данном случае покрывают сухие крио-УС только сухой эмульсией с помощью метода петли). Так как ГА полимеризуется на поверхности объектов, разрешение покровных структур (например, эндотелия) после длительной фиксации в нем резко снижается. Для повышения прочности объектов при подготовке их к СЭМ желательно, но не обязательно фиксировать их в ГА несколько суток. При выявлении водорастворимых веществ ткани обычно замораживают, высушивают и заливают в смолу в вакууме. Замороженную ткань чаще подвергают лиофильной сушке, заливают в смолу, избегая контакта с водными средами, и покрывают слоем сухой эмульсии. Пригоден также метод замещения в замороженном состоянии [25, 68, 261].
Метод двойной метки [68] позволяет исследовать в одном препарате обмен двух различных веществ или одного и того же вещества, но введенного дважды с определенным промежутком времени. Метод дает лучшие результаты на ПС и менее специфичен на УС. В качестве изотопов применяют обычно тритий и углерод-14. Дозы изотопов подбирают таким образом, чтобы излучение трития приводило к образованию достаточно плотного скопления зерен серебра над клеткой уже через 3-4 сут экспонирования, а углерод-14 - только через 20-40 сут. Предметные стекла со срезами тканей покрывают тонким слоем эмульсии, экспонируют 3-4 сут, а затем проявляют и окрашивают. Затем эмульсию покрывают тонким слоем какого-нибудь прозрачного и водонепроницаемого вещества, например пластмассы, используемой для заключения срезов, а сверху снова наносят слой эмульсии и экспонируют 20-40 сут. После проявления получают радиоавтограф с зернами серебра, расположенными на двух уровнях. В первом, лежащем непосредственно над срезом, представлены главным образом зерна, образовавшиеся вследствие излучения трития. Доля зерен, отражающих излучение углерода-14, в данном случае незначительна из-за короткого срока экспозиции и малого содержания углерода-14 в клетках. Во втором верхнем слое зерна образуются только за счет излучения изотопа углерода, тогда как слабое излучение трития не проникает за пределы первого слоя эмульсии и промежуточного слоя пластмассы. Отдельный подсчет зерен в нижнем и верхнем слоях эмульсии позволяет определять активность синтеза двух веществ в одной и той же клетке.
Чтобы легче отличать зерна двух слоев, их можно окрашивать, например, в первом слое в синий цвет, а во втором - оставлять черными [355]. С этой же целью можно использовать для второго слоя эмульсию с большей величиной зерен. Определение излучений трития и углерода-14 можно проводить и в одном слое эмульсии, для чего наносят толстый (15-20 мкм) слой эмульсии и подсчитывают отдельные зерна серебра, образуемые тритием, а также треки, которые возникают при пробеге в эмульсии бета-частиц углерода-14 и состоят из ряда последовательно расположенных зерен.

10.5.1. Нанесение эмульсии

Для ЭМ-АРГ требуется специальная эмульсия. Работы с эмульсией производятся в абсолютно светонепроницаемой комнате (фотолаборатории) с использованием безвредного желто-зеленого светофильтра (например, Ilford 902S или N 117) и фонаря с мощностью лампочки не выше 15 Вт. Все манипуляции с эмульсией осуществляются на расстоянии 15-2 м от источника света. Для того чтобы проверить затемнение, надо выждать в полной темноте 15 мин, так как только после этого человеческий глаз сможет определить возможные источники засветки. Фонарь со светофильтром следует направить в сторону от эмульсии.
Температура в комнате не должна быть выше 26®С, влажность 70-80 %. В комнате для нанесения эмульсии необходим термостол с автоматической регуляцией температуры, которую следует установить в диапазоне от 39 до 42®С. На нем размещают препараты, на которые наносится эмульсия. В комнате должна быть водяная баня с автоматически регулируемой температурой, которую необходимо установить на 40®С. В водяную баню помещают кронштейн-держатель для градуированной мерной посуды различного объема.
Стеклянным или фарфоровым шпателем желеобразную эмульсию осторожно извлекают из темной посуды, в которой она хранится при t=4®С. Стакан помещают в водяную баню. Эмульсию постоянно перемешивают стеклянной палочкой, вращая ее все время в одном направлении. Помешивать эмульсию следует медленно, так как интенсивное перемешивание приводит к образованию воздушных пузырьков. Этот этап длится 25-30 мин, до исчезновения комков эмульсии. Чтобы убедиться в полном расплавлении эмульсии, необходимо вынуть из нее стеклянную палочку. Если на ней отсутствуют комки и эмульсия равномерно стекает, то можно приступать к следующему этапу. Нужно определить количество расплавленной эмульсии в стакане и в соответствии с этим добавить 3%-ный раствор тимола из расчета 5 мл на 100 мл эмульсии. Если не предполагается длительное хранение препаратов, то антисептик можно не добавлять. В этом случае мерной пипеткой приливают необходимое количество пластификатора (смачивателя, например, 15%-ного раствора СВ1ВЗ), тщательно его размешивают и добавляют дубитель. Обычно на каждые 100 мл разведенной эмульсии 1 мл раствора смачивателя.
Некоторые исследователи предпочитают не расплавлять эмульсию, а сразу помещать необходимое ее количество в подогретый до нужной температуры растворитель и размешивать эмульсию уже там.
При растворении эмульсии необходимо использовать только стеклянную посуду и избегать контакта эмульсии с металлическими предметами. Температура водяной бани, в которой плавится эмульсия, должна быть не выше 41®С. При расплавлении эмульсии и помешивании ее стеклянной палочкой следует исключить резкие удары стеклянных предметов друг о друга. При t=41®С фотоэмульсию (например, типа М) расплавляют и смешивают с равным объемом дистиллированной воды или коммерческого раствора специального умягчителя или 0.02%-ного раствора бромида калия. Однако некоторые авторы считают, что для разбавления эмульсии раствор бромида калия лучше не применять, поскольку он снижает смачивающие свойства эмульсии. Некоторые типы эмульсий рекомендуется разводить водой в объемном соотношении 1:9с добавлением 1 % глицерина. Глицерин добавляют в эмульсию от растрескивания при хранении. Разведенную эмульсию желательно отфильтровать. В дальнейшем эмульсию из водяной бани вынимать не рекомендуется. Однако некоторые авторы предпочитают разведенную эмульсию охлаждать при комнатной температуре [52, 68, 261].
Наиболее ответственным этапом является нанесение фотоэмульсии на УС. Эта операция производится в темноте. Разработано несколько приемов нанесения эмульсии на УС. Можно сеточку с УС просто пинцетом опустить в жидкую эмульсию после соответствующего ее разведения. Если УС не находятся на подложке, то в этом случае обеспечивается двухстороннее покрытие пленкой срезов.
Прикрепить сеточки на чистое предметное стекло можно с помощью двухсторонней липкой ленты Scotch.

10.5.1.1. Метод погружения

Предметное стекло покрывают коллодиевой или формваровой пленкой, на которую с помощью проволочной петли помещают УС (рис. 28). Для этого изогнутую специальным образом проволочную (лучше платиновую) петлю подводят под УС, плавающие в ванночке, и быстрым движением петлю поднимают (рис. 28, А). Петля захватывает УС, которые оказываются на верхней поверхности капли, оставшейся на петле. Предметное стекло подносят к УС, плавающим на капле, и прикасаются к ней той стороной, которая покрыта пленкой, - УС прилипают к подложке (рис. 28, Б). Очень важно точно отметить место прикрепления УС и не "потерять" их из виду. Если в дальнейшем эмульсия наносится методом погружения, то лучше всего УС помещать в верхней части стекла. Затем на УС напыляют тонкий слой углерода, который улучшает прикрепление эмульсии, контрастируют их с помощью ЦС (см. гл. 8), помещая каплю раствора последнего на место расположения срезов, и промывают. Эмульсию наносят непосредственно на ленты срезов каплями с помощью пастеровской пипетки. Избыток эмульсии отсасывают или дают ему стечь. Иногда стекло просто погружают в расплавленную и разведенную эмульсию. После экспонирования и проявления пленку-подложку снимают на поверхность воды, сеточки помещают прицельно на каждую группу УС, подложку с сеточками снимают с поверхности воды и высушивают. Пробные стекла окунают в эмульсию и выносят из фотолаборатории для оценки - после высушивания слой эмульсии над сеточкой должен иметь в отраженном свете фиолетовый цвет, что свидетельствует об образовании монослоя эмульсии и удачно подобранном разведении.

0x01 graphic

Рис. 28. Способ переноса УС из ванночки на подложку, расположенную на предметном стекле.
1 - проволочная петля; 2 - УС; 3 - стеклянный нож; 4 - ванночка; 5 - предметное стекло с подложкой на нижней поверхности; 6 - капля жидкости с плавающими УС.

10.5.1.2. Метод проволочной петли

Петлю из медной или платиновой проволоки диаметром 20-40 мм погружают в эмульсию. Лучше использовать петлю в форме капли с крючком на остром конце, за который подвешивают петлю при высушивании. После извлечения петлю постепенно переводят в вертикальное положение, держа ее на черном фоне перед лабораторным фонарем со светофильтром 118 на расстоянии 1 м от фонаря. Промакивать избыток эмульсии с петли не следует - надо дождаться, когда лишние капли стекут сами. Свет фонаря направляют на пленку в петле под острым углом. По мере стекания эмульсии можно наблюдать образование полос интерференции (красного, золотистого и других цветов). При этом в верхней части петли формируется монослой кристаллов эмульсии, который и имеет вид золотистой зоны. Как только полоска монослоя эмульсии станет достаточно широкой, ее можно нанести на сеточку, укрепленную на столбике. Иногда пленка лопается до возникновения монослоя. Зоны золотистого и красного (в которой кристаллы бромида серебра также образуют сравнительно однородный монослой) цветов существуют очень короткое время, а затем высыхают и сморщиваются. Если вовремя не нанести эмульсию на срез, то перенесенный на сеточку слой будет иметь многочисленные складки. В этом случае операцию лучше повторить. Однако постоянно следить за строением и цветом пленки необязательно. Если к моменту нанесения эмульсии на бленду пленка в петле сморщивается, то достаточно осторожно подышать на нее, чтобы полностью расправить и создать обширную красную зону, значительно превышающую ширину бленды. Продолжительное пребывание эмульсии при t=42®С приводит к появлению вуали. Поэтому всегда надо готовить такое количество эмульсии, которое позволит покрыть 20-30 сеточек. Высушенные после нанесения эмульсии препараты помещают на 3-5 ч в пары перекиси водорода, что уменьшает количество фоновых зерен на 90-95 % [25, 68, 261].
Существенно улучшает результаты нанесение эмульсии с обеих сторон среза. Для этого ленту срезов помещают на бленду. Предварительно на нее наносят пленку, приготовленную из 0.6%-ного раствора формвара в дихлорэтане. Эта концентрация обеспечивает механическую прочность пленки, позволяющую сохранить ее целостность при многочисленных манипуляциях [68]. В то же время получающаяся пленка формвара достаточно тонка и проницаема для бета-частиц. Ленту срезов на бленде покрывают сверху тонким слоем углерода, а затем на обе стороны бленды наносят монослой эмульсии. Нанесение эмульсии с обеих сторон среза в два раза увеличивает чувствительность метода. Сравнение распределения серебра в соседних серийных УС делает полученные данные еще более достоверными.
Для ускорения нанесения эмульсии на срезы (на сеточках или блендах) рекомендуется одновременно использовать четыре петли. Петли с пленками могут быть развешены на крючках.
Нанесение пленки эмульсии на сеточку удобно осуществлять, вложив особым образом вырезанный кусочек фильтровальной бумаги между браншамй пинцета с закрепленной в нем ЭМ-блендой или сеточкой (рис. 29). Такой способ позволяет избежать загибания краев эмульсионной пленки на сеточку. Сеточкой, которую располагают параллельно плоскости петли, быстро прикасаются к пленке, натянутой в петле. Эмульсия прилипает к одной стороне сеточки. Затем берут вторую петлю с пленкой эмульсии и таким же образом покрывают эмульсией другую сторону сеточки.
После нанесения эмульсии сеточки или бленды закрепляют в разрезанной продольно полиэтиленовой трубочке (диаметр 3-5 мм), например в стержне от шариковой авторучки (рис. 30). В трубочке через каждые 4 мм делают поперечный разрез овальной формы. Внутрь трубочки помещают прочный пластмассовый стержень (металлический может влиять на процесс проявления). Вдвинув его до нужного поперечного разреза и согнув трубочку на этом уровне, можно раздвинуть края продольного разреза в этом месте и поместить (взять) в данный участок разреза сеточку. После прекращения сгибания края продольного разреза, стремящиеся в силу эластичности сомкнуться, достаточно прочно удерживают сеточки и бленды (от 3 до 10-12 штук). В таких трубочках очень удобно проводить экспонирование и проявление сразу нескольких препаратов.
Экспонирование удобно проводить в специальных пластмассовых контейнерах. На дно контейнера для экспонирования рекомендуют насыпать прокаленный силикагель, в который, как в песок, погружают трубки с блендами [68].

10.5.2. Экспонирование

Обычно сеточки с УС экспонируют в темных боксах от 2-3 недель до нескольких месяцев. Длительное экспонирование может приводить к регрессии скрытого изображения. В результате хемографического эффекта при продолжительном экспонировании исчезает около 60 % активированных зерен серебра, что значительно снижает воспроизводимость результатов. Во избежание хемографического эффекта препараты следует хранить в темных коробках в атмосфере инертного газа в присутствии достаточного количества влагопоглотителя, например силикагеля. Можно использовать откачиваемые герметические контейнеры. Для снижения фона на дно контейнера помещают фильтровальную бумагу, слегка смоченную раствором перекиси водорода.

0x01 graphic

Рис. 29. Схема взятия сеточки (1) пинцетом (2) с вложенным между браншами кусочком фильтровальной бумаги (3).

0x01 graphic

Рис. 30. Устройство для крепления нескольких сеточек (бленд) в процессе их проявления и закрепления. 1 - пластмассовый стержень; 2 - трубочка диаметром 3-5 мм; 3 - поперечные разрезы трубочки, 4 - продольные разрезы трубочки; 5 - пинцет; 6 - сеточки.

10.5.3. Проявление

Чтобы скрытое изображение сделать видимым, его проявляют. При проявлении следует четко соблюдать температурный режим. Количество зерен серебра и их размеры возрастают с увеличением длительности проявления. Для уменьшения размеров зерен серебра используют мелкозернистые проявители, однако они снижают чувствительность эмульсии. Так, при использовании проявителя, состоящего из 0.1 М раствора парафенилендиамина и 1 М раствора сульфата натрия, проявление в течение 1 мин дает мелкое круглое зерно, диаметр которого меньше непроявленного кристалла. Чувствительность при этом снижается.
Для повышения чувствительности скрытого изображения препараты обрабатывают тиоцианатом золота, а затем растворами метола и аскорбиновой кислоты, что увеличивает количество проявленных кристаллов. Чувствительность метода при этом увеличивается в 4 раза, однако разрешающая способность падает.
Чтобы увеличить точность локализации, а следовательно, и разрешения, часто прибегают к так называемому мелкозернистому проявлению. Мелкозернистого проявления с одновременным повышением чувствительности и разрешения можно добиться путем обработки ионами золота [25, 68, 261].
Фиксируют препараты в 20-25%-ном растворе тиосульфата натрия обычно в течение 2-4 мин.
Для эмульсии типа М наилучшим оказался метол-гидрохиноновый проявитель. Для эмульсии типа Пр более всего подходит пирогалловый проявитель. В случае проявления эмульсий типа М или Пр проявитель разводят водой в соотношении 1 : 10, время проявления 1.5-25 мин при t=20®С. Затем объекты переносят в 1%-ный раствор уксусной кислоты. После метол-гидрохинонового проявителя фиксацию проводят в кислом фиксаже, после пирогаллового - в 25%-ном растворе гипосульфита в течение 5 мин. Промывают в двух сменах воды (по 1 мин) (см. Приложение, 10.3) [25, 68, 261].

10.5.4. Контрастирование

Контрастирование можно осуществлять с помощью УА в процессе дегидратации объектов. УС могут контрастироваться как до, так и после экспозиции. В первом случае срезы обычно окрашиваются с помощью УА. После проявления пользуются ЦС. Лучшие результаты получаются, если контрастировать препараты, покрытые эмульсией, после проявления. В этом случае рекомендуется удалить желатину 0.2%-ным раствором пепсина или трипсина, 0.05-0.2 М NaOH или теплой водой, а затем обработать УС с помощью УА (30 мин при t=32®С) и ЦС (10-12 мин при комнатной температуре). Однако, несмотря на усиление контраста, происходит смещение зерен серебра. Часто (при достаточно тонкой эмульсионной пленке) в процессе контрастирования удаляется желатина. При этом контрастность объектов возрастает. Некоторые исследователи считают, что контрастирование УС после экспонирования, как правило, дает худшие результаты, так как красители плохо проникают через слой фотоэмульсии (если ее не удалить) [25,68,261].

10.5.5. Оценка результатов

Зерна проявленной эмульсии представляют собой неправильной формы треки или точки в зависимости от применяемого способа проявления. Результаты ЭМ-АРГ могут оцениваться количественно (см. выше). Разработаны эффективные приемы статистического анализа препаратов, например селективный метод мечения везикул радиоактивным йодом. Кроме того, для подсчета уровня мечения разработаны программы компьютерного анализа [25, 68, 261].

10.6. МЕТОД АДСОРБЦИОННОЙ ЭМ-АРГ

Метод безэмульсионной ЭМ-АРГ основан на восстановлении до металла положительных ионов растворов солей благородных металлов в отрицательном поле бета-излучения изотопа. Сущность метода состоит в том, что при контакте растворов некоторых комплексных соединений тяжелых, чаще благородных металлов (обычно золотохлористоводородной кислоты) с УС, излучающим бета-частицы, выпадает осадок восстановленного металла [273]. Микрокристаллы металлов растут в точках излучения ультрафиолетового света, начиная с устойчивого состояния двух атомов, и образуют радиоавтографы размером до 25 нм за несколько секунд.
Сеточки срезами вниз помещают на поверхность водного раствора хлорного золота для экспонирования, высушивают, быстро промывают, снова высушивают. Рекомендуется использовать сеточки, покрытые палладием или другим благородным металлом, без пленки-подложки.
Наиболее существенными параметрами данного метода являются температура и концентрация раствора золотохлористоводородной кислоты, а также продолжительность экспозиции. Оптимальное сочетание этих параметров даст возможность получать более высокое разрешение, чем при обычном эмульсионном способе. Эффект взаимодействия бета-частиц и ионов золота будет усиливаться, если капля раствора тяжелого металла не растекается по поверхности, а остается круглой, упругой [52] (см. Приложение, 10.4).
Манипуляции с сеточками, следующие за экспонированием срезов, часто приводят к потере части кристаллов, что делает невозможным количественный анализ, а ограничение метода в использовании контрастеров, разрушающих отложения металла в точках излучения, предопределяет и очень низкую контрастность изображения.
Поэтому после второй сушки срезы напыляют в вакууме слоем углерода толщиной 3-5 нм, закрепляя тем самым микрокристаллы золота и создавая над ними защитный гидрофобный слой. Это делает возможным использовать УА и ЦС для контрастирования УС [13].

10.7. СЭМ и ЭМ-АРГ

Для изучения больших тканевых пластов в СЭМ необходимо, чтобы метод ЭМ-АРГ отвечал следующим требованиям: 1) препарат должен включать всю интересующую исследователя поверхность и обеспечивать возможность проведения топографических исследований и картирования распределения меченых клеток; 2) ядра клеток должны находиться на минимальном расстоянии от эмульсии, чтобы изображение не экранировалось и регистрировалось как можно полнее; 3) количество клеток должно быть достаточным для проведения статистически достоверных измерений.
Мы рекомендуем следующую пропись [49]. Под наркозом животным внутрибрюшинно вводят Н-тимидин, разведенный на среде 199 (05 мл на 300 г массы). Очень удобно вводить экспериментальным животным раствор изотопа микропипеткой через небольшой разрез в нижнем отделе брюшной стенки. Через 1 ч производят перфузионную фиксацию (см. гл. 2). После дофиксации объекты (например, сосуды) распластывают, обезвоживают, высушивают и приклеивают на чистые предметные стекла. Стекла погружают на несколько секунд в разведенную фотоэмульсию.
Для анализа мелких полостных образований после фиксации их не вскрывают, а высушивают целиком, затем приклеивают к полоскам алюминиевой фольги и под стереомикроскопом с помощью свежих лезвий разрезают на две половинки. Полученные препараты погружают в эмульсию. Экспозицию проводят в течение 20-26 сут. Проявление осуществляют амидоловым проявителем в течение 3 мин [28]. После обработки закрепителем и промывания в воде препараты высушивают на воздухе, покрывают тонким слоем золота и просматривают в СЭМ.
Глава 11 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛЕКТИНОВ В ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

11.1. ЛЕКТИНЫ, ИХ СВОЙСТВА И СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Пектины (Л) - это белковые поливалентные лиганды, которые специфически и обратимо связывают углеводы, не вызывая при этом их химического превращения. Лигандом мы будем называть любую молекулу, специфически связывающуюся с локализованной в объекте исследуемой молекулой, находящейся в образце независимо от характера взаимодействия. Специфичность связывания углеводов является важнейшим свойством Л и лежит в основе их функциональной классификации. Связывание углеводов Л -процесс легко обратимый. В его основе лежит образование молекулярных комплексов с белком, при этом специфичность взаимодействия определяется структурой активного центра Л. Устойчивость комплексов обеспечивается нековалентными связями, главным образом водородными и гидрофобными (силы Ван-дер-Ваальса) [39, 77].
Комплекс углевода с Л может быть неспецифически диссоциирован в кислой среде (рН 3-4), при связывании ионов кальция комплексонами, в присутствии ионов бората, при повышении температуры до 50®С. Специфическая диссоциация комплекса происходит в присутствии простых углеводов, взаимодействующих с активным центром Л и конкурентно вытесняющих первоначально связанный лиганд. В отличии от антител связывание Л с гликопротеидами менее специфично, поэтому вызвать диссоциацию комплекса проще. Это эффективно используется в аффинной хроматографии гликопротеидов.
В молекуле Л имеется несколько центров связывания углеводов. В большинстве случаев Л тетравалентны. Поливалентность обусловливает агглютинацию клеток и частиц, а также преципитацию гликопротеидов. Эта же особенность отличает Л от гликозидаз и переносчиков углеводов, которые имеют один активный центр в молекуле, т.е. моновалентны. Кроме того, в отличие от гликозидаз и других углеводсвязывающих ферментов Л не вызывают химического превращения субстрата [24, 39].
Наиболее ценными для гистохимических целей являются Л, специфические к определенному углеводу (моноспецифические), которые, однако, встречаются довольно редко.
Реакция связывания моносахаридов с Л зависит от принадлежности моносахарида к D- или L-ряду и положения гидроксилов при третьем и четвертом атомах углерода пиранозного кольца. Исходя из этого все взаимодействующие с Л моносахариды разделены на четыре группы: 1) 3,4-ОН, цис-положение, L-ряд (L-фу-коза, L-галактоза); 2) 3,4-ОН, цис-положение, D-ряд (D-галактоза); 3) 3,4-ОН, транс-положение, D-ряд (D-глюкоза, D-манноза); 4) 3,4-ОН, транс-положение, L-ряд (L-глюкоза, L-ксилоза). В соответствии с группами углеводов классифицированы по углеводной специфичности и Л [29, 39, 77].
Очистку Л проводят методом аффинной хроматографии, используя самые разнообразные сорбенты. В качестве элюента для вытеснения связанных на сорбентах Л используют растворы углеводов; 0.1 М уксусную кислоту или кислые буферные растворы, блокирующие активность Л; растворы ЭДТА применяют для Сазависимых Л; в некоторых случаях можно использовать боратный буфер. Для правильного выбора аффинного сорбента необходимо знать углеводную специфичность Л. Аффинная хроматография используется и для очистки меченых производных этих белков [24, 25, 260].

11.2. ПУТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЧЕНЫХ ЛЕКТИНОВ

Как структурные зонды Л позволяют определять не только химическую природу доступных углеводных детерминант, но и их распределение по поверхности клеток. Располагая набором Л, специфичных к углеводам, которые встречаются в животных гликопротеидах, можно установить наличие и распределение гликопротеидов на поверхности клеток и в других тканевых структурах. Сохранение нативности гликопротеидных структур не является обязательным - необходимо сохранение только углеводных детерминант. Для исследования экранированных с поверхности углеводных остатков используют метод умеренной модификации клеточной поверхности ферментами. При этом следует учитывать, что связывание Л с мембранными рецепторами может происходить не только по концевым углеводным детерминантам, но и по углеводным остаткам внутри олигосахаридной цепи (см. Приложение, 11).
Кроме структуры Л позволяют исследовать функциональное состояние клеточной мембраны. Это обусловлено тем, что молекулы мембранных рецепторов-гликопротеидов перемещаются в плоскости мембраны и этот процесс регулируется субмембранными сократительными цитоскелетными структурами [22]. При этом подходе обязательным условием является сохранение жизнеспособности клеток, обработанных Л.
Важный аспект использования меченых Л - подсчет количества Л-связывающих мест и плотности расположения рецепторов различных Л на поверхности клеток, изучение константы ассоциации и диссоциации комплексов Л с рецептором. Л можно использовать для выявления гликоконъюгатов с помощью ТЭМ и СЭМ на сколах клеток и тканей [214].

11.3. МАРКЕРЫ ЛЕКТИНОВ

Нативные Л невидимы в ЭМ, поэтому для визуализации мест связывания Л обычно используются конъюгаты Л с маркерами. Конъюгирование должно обеспечивать сохранение биологических свойств Л (сродство к углеродам и специфичность). Выбор маркера для Л зависит от метода последующего исследования (см. гл. 21). Связь метки с Л должна быть прочной (аффинное специфическое или ковалентное связывание), а неспецифическое связывание у них должно быть минимальным [24, 25, 260, 278].

11.4. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕНЫХ ЛЕКТИНОВ

Для получения пероксидазных конъюгатов предложено несколько методов (см. Приложение, 11.1.4). Для получения конъюгатов ферритина с Л обычно используют ГА. Процедура обработки клеток Л, меченными ферритином, для ЭМ практически не отличается от таковой для конъюгатов Л с пероксидазой хрена (ПХ).
Образование комплексов Л с коллоидным золотом (КЗ) обеспечивается силами электростатического взаимодействия и поверхностной адсорбции. Необходимым условием получения устойчивых коллоидных растворов золота является высокая степень чистоты посуды и реактивов.
Для эффективного связывания КЗ с молекулами Л следует соблюдать следующие условия: рН растворов КЗ и Л перед смешиванием должны быть несколько выше изоэлектрической точки Л; количество Л должно быть оптимальным для получения стабилизирующего эффекта в смеси; раствор Л должен быть тщательно обессолен диализом против воды или гельфильтрацией. Изоэлектрическая точка Л чечевицы соответствует значению рН 7.0; Л арахиса - 6.3; Л сои - 6.0; Л зародышей пшеницы - 8.7; Л бобовника анагиролистного -7.0; Л утесника европейского, тип I - 6.1; конканавалина А - 55; агглютинина клещевины - 8.0. После достижения соответствующего значения рН опытным путем определяют количество Л, необходимое для получения стабилизирующего эффекта [167].
Применение Л, меченных КЗ, обеспечивает получение постоянных невыцветающих препаратов и дает хорошо воспроизводимые результаты как в СМ, так и в ЭМ. Возможность мечения частицами КЗ различной величины (от 5 до 150 нм) позволяет проводить обработку препаратов одновременно двумя-тремя мечеными Л.
Допустима комбинация пероксидазных и ферритиновых конъюга-тов с Л, меченными с помощью КЗ; возможно одновременное использование материала; обработанного лектин-пероксидазным конъюгатом, для исследования с помощью СМ и ЭМ. Электронно-плотные частицы при этом должны различаться по размерам.
Для обнаружения Л, которые не могут стабилизировать золь КЗ, разработаны реакции связывания с глюкопротеидами, меченными с помощью КЗ. При этом углеводные детерминанты тканевого гликопротеина взаимодействуют со специфичным для нее немеченным Л, который, в свою очередь, связывается со вторым реагентом (гликопротеином), меченным КЗ [24, 25, 260] (см. Приложение, 11.1.1 и 11.1.2).

11.5. ПРИНЦИПЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЧЕНЫХ ЛЕКТИНОВ В ЭМ

Использование Л, меченных ферментами ПХ либо электронно-плотными маркерами (ферритином, гемоцианином, КЗ и т.п.), предусматривает фиксацию клеток через различные промежутки времени и исследование таким образом динамики распределения метки. Индуцированная Л латеральная миграция комплексов лектиновых рецепторов с Л при последовательном образовании "кластеров", "пятен" и "шапочек" приводит к эндоцитозу меченых лектиновых рецепторов. Изучение скорости этого процесса позволяет строить так называемые гликограммы. Как правило, для их построения используют 3-4 временные точки [24, 25, 260].

11.5.1. Фиксация

Требования к процедуре фиксации при использовании Л оказываются во многом близкими к таковым, предъявляемым к процедуре фиксации объектов для иммуно-ЭМ (см. гл. 2). При проведении реакций с Л можно использовать ГА и ЧО и заливать образцы в эпоксидные смолы. Для блокирования альдегидных групп после фиксации альдегидами используются обычные способы, например обработка 0.2 М глицином на ФБФР.

11.5.2. Методы визуализации мишеней с помощью лектинов

Эти методы принято классифицировать на прямые и непрямые. В первом случае конъюгаты Л с маркером используют одномоментно, во втором - клетки сначала взаимодействуют с Л, а затем маркер связывается с комплексом Л-рецептор (см. ниже, рис. 31) (см. Приложение, 11.2, 115, 11.6).

11.5.2.1. Прямые методы

Примером может служить техника использования конъюгатов Л с ПХ и Л с ферритином для ТЕМ (см. Приложение, 11.1.3 и 11.1.4). Следует подчеркнуть важность температуры, при которой происходит мечение, поскольку t > 5®С способствует распаду конъюгатов, а если используются нефиксированные объекты, то обработка их с помощью Л индуцирует перераспределению рецепторов на клеточной поверхности.

11.5.2.2. Непрямые методы

При непрямом двухстадийном методе срезы обрабатывают нативным Л, а затем зондом, конъюгированным с маркером и обладающим сродством к Л. К примеру, для конканавалина А зондом может служить ПХ, для выявления Л чечевицы, агглютинина клещевины и конканавалина А можно использовать конъюгированный с ПХ тиреоглобулин. При этом происходит связывание молекул зонда с молекулами Л, фиксированными на гликополимере. Для большинства лектинов рекомендуется использовать концентрацию 25-100 мкг/мл (для конканавалина А 100-200 мкг/мл).
Примером непрямых методов является мечение лектиновых рецепторов с помощью ПХ для ТЭМ и с помощью гемоцианина для СЭМ (см. Приложение, 11.5). ПХ является гликопротеином, поэтому ряд Л, в первую очередь манноспецифичные (конканава-лин А, лектин гороха и чечевицы) связываются с ней с образованием нерастворимых комплексов. Это свойство используется для локализации связанного с рецепторами Л. Гранулы гемоцианина имеют характерную форму и легко идентифицируются под СЭМ. После обезвоживания образцы также можно провести и для ТЭМ.
КЗ вначале можно связать с овомукоидом (белок, специфически связывающийся с некоторыми Л, например с ВГА (WGA -wheat germ agglutinin), церулоплазмином, фетуином) или с ПХ (которая связывается с конканавалином А), и только потом присоединить полученный комплекс к Л, связанному с мишенью объекта. Ряд преимуществ для выявления многих Л непрямым методом имеет нативный гликопротеин - тиреоглобулин [24, 25, 260]. Можно использовать антитела и систему биотин-стрептавидин. В первом случае (рис. 31, А) объект обрабатывают вначале лектином, а затем маркером, конъюгированным со специфичным для лектина гликопротеином. Во втором случае (рис. 31, Б) объект обрабатывают вначале лектином, а затем противолектиновым антителом, конъюгированным с маркером (см. Приложение, 11.6). В третьем случае (рис. 31, В) объект обрабатывают вначале лектином, конъюгированным с биотином, а затем стрептавидином, конъюгированным с маркером. Непрямые методы имеют ряд преимуществ: во-первых, исключается необходимость получения конъюгатов Л с соответствующими маркерами; во-вторых, с помощью одного реагента (например, меченого тиреоглобулина) можно выявлять лог кализацию нескольких Л. Кроме того, непрямые методы предполагают использование нативных Л, что гарантирует сохранность их активных центров и соответственно предотвращает возможность неспецифического связывания с гликополимерами.

0x01 graphic

Рис. 31. Схема непрямых двухступенчатых методов выявления углеводных детерминант клеточных мембран с помощью лектинов (Л). 1 - углеводные детерминанты; 2 - клеточные мембраны; J - Л; 4 - маркеры; 5 - гликопротеин, специфичный для Л; 6 - противолектиновсе антитело; 7 - биотин; 8 - стрептавидин.

В целом непрямые методы проще. Однако у них есть и свои недостатки: 1) используемые реагенты связываются нековалентно, что может привести к их спонтанной потере в ходе препарирования; 2) непрямой метод не подлежит количественному анализу, так как связывание маркера во многом определяется числом свободных пектиновых валентностей; 3) необходим контроль на наличие эндогенной пероксидазной активности, так как определенные типы клеток могут реагировать с ДАБ и создавать ложное впечатление эндоцитоза Л; 4) многостадийность обработки препарата обусловливает потребность в контроле специфичности реакции на каждом этапе [24, 25, 77, 260].

11.5.3. Контроля

Для контроля специфичности реакции препараты обрабатываются мечеными Л при наличии в инкубационной среде 10 % соответствующего углерода-ингибитора. Для Л чечевицы и конканава-лина А рекомендуется использовать альфа-О-маннозу, для Л клещевины и арахиса - лактозу, для Л сои - N-ацетилгалактозамин, для Л зародышей пшеницы - N-ацетилглюкозамин, хитобиозамин или овомукоид, для Л бобовника анагиролистного и утесника европейского - L-фукозу. Для контроля специфичности используют также предварительную обработку срезов с помощью немеченого Л, нативной ПХ, либо только ДАБ с пероксидазой, а также окисление углеводных детерминант 1%-ным раствором KJО₄ (в течение 30 мин).
Следует отметить, что отрицательного контроля в присутствии ингибитора удается добиться не для всех Л. Это объясняется тем, что степень сродства Л к терминальным углеводным остаткам в составе гликополимеров может быть выше, нежели к молекулам простых углеводов. Хорошие результаты при проведении контролей получаются с конканавалином А и Л клещевины, худшие -при использовании Л зародышей пшеницы, арахиса, сои, бобовника анагиролистного. Окрашивание препаратов при обработке конъюгатами указанных Л с ПХ в присутствии ингибитора в большинстве случаев наблюдается вследствие того, что сродство Л к углеводам в молекуле гликополимеров намного выше, нежели к простым сахарам-ингибиторам. При этом подтверждением специфичности реакции обычно служит отрицательный результат при исключении Л из процесса обработки препарата либо при окислении углеводных остатков гликополимеров 1%-ной HJO₄.

11.5.4. Методы обработки объектов

Мечение с помощью Л возможно в режиме как преэмбеддинга (до заключения объектов в смолу), так и постэмбеддинга (после заключения объектов в смолу) (подробнее см. гл. 12). В первом случае приготовленные криосрезы или изолированные клетки (например, культура ткани) инкубируют в растворах Л или их конъюгатов с ПХ. Увеличение проницаемости тканей объектов (пермеабилизация) достигается за счет обработки сапонином, добавляемым в инкубационную среду. Концентрация Л в этом случае варьирует от 30 до 200 мкг/мл. Инкубация ведется при комнатной температуре в течение 3-6 ч. После обработки чистым Л обычно следует обработка ПХ.
Криосрезы во время инкубации постоянно перемешиваются (см. Приложение, 11.4).
Для проведения мечения с помощью лектинов в качестве растворителя для фиксатора и промывочного раствора нельзя использовать среду 199, содержащую глицин. Лучше пользоваться средой Хэнкса.
После инкубации с Л объекты необходимо промыть и дофиксировать в ГА. Для визуализации реакции связывания криосрезы и образцы культуры инкубируют в растворе ДАБ, несколько раз промывают в бидистиллированной воде, обрабатывают препараты в феррицианиде осмия, а затем в ЧО, обезвоживают в этаноле и заливают в эпоксидные ЗС. УС и ПС исследуют без контрастирования.
Процедура мечения УС с помощью Л и комплексов гликопротеин-КЗ в режиме постэмбеддинга сходна с таковой при иммуномечении. Потребность в контрастировании УС зависит от применяемого маркера и заливочных сред [24, 25, 77, 260] (см. Приложение, 11.3).

11.6. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ ЛЕКТИНОВ

Синтезируемые гликопротеины можно использовать для анализа эндогенных Л и гликоконъюгатов [260]. Они метятся с помощью ПХ, КЗ, ферритина и т.п. Синтезируемые гликопротеиды могут связываться с биотином или его производными. Маркирование же биотина проводится с помощью авидина.
Для определения эндогенных Л препарат обрабатывают синтезированным гликопротеином, который может быть уже помечен с помощью маркера или метится им после присоединения к исследуемому Л. Разработан способ мечения с использованием гликопротеинов, гликозильные части которых ковалентно прикреплены к белку-переносчику. Это позволяет проследить судьбу эндогенных Л.
Определение мембранных гликоконъюгатов с использованием Л, меченных синтезированными гликопротеидами, можно проводить на изолированных клетках перед фиксацией с помощью ГА или после нее на гистосрезах, небольших тканевых блоках, УС тканей, залитых в гликольметакрилат [24, 25, 77, 260].
Глава 12 ИММУНОЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

12.1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

Реакция антиген-антитело высокоспецифична и используется для выявления антигенов (АГ) в тканях. Методы регистрации АГ в тканях с использованием антител (AT) объединены в раздел иммуногистохимии. В случае выявления АГ внутри клетки говорят о методах иммуноцитохимии. В зависимости от применяемого для детектирования реакции АГ-АТ прибора все эти методы могут быть разделены на методы иммуносветовой микроскопии (иммуно-СМ) и методы иммуноэлектронной микроскопии (иммуно-ЭМ). Иммуно-ЭМ более чувствительна и дает возможность выявлять антигенные детерминанты, присутствующие в низких концентрациях [184, 185]. Этот метод позволяет изучать распределение АГ как по поверхности, так и внутри клеток.
Антигенные детерминанты - это уникальные части молекулы АГ, распознаваемые с помощью AT. Эпитопы - топографические структуры на поверхности белка, определяемые конформацией нативной молекулы и распознаваемые AT. Антигенная детерминанта - это скопление (кластер) эпитопов. Животное, иммунизированное определенным иммуногеном, будет продуцировать поликло-нальную антисыворотку, которая содержит смесь популяций AT, или поликлональные AT.
Поликлональная антисыворотка может быть очищена с помощью аффинного связывания на твердой фазе. Для этого чистый АГ адсорбируют на специальном сорбенте, упакованном в колонку. Антисыворотку пропускают через колонку, при этом AT реагируют с АГ, адсорбируются и не удаляются при промывании колонки стандартными буферами. Высокоаффинные AT затем отделяют с помощью буферного раствора с низким (или высоким) рН. Парадокс заключается в том, что AT с самой высокой аффинностью и авидностью наиболее трудно выделить из колонки. Поэтому в результате обычно получается относительно бедная популяция AT, сравнительно низкоаффинных по отношению к изучаемому АГ. Монорецепторные AT - это раствор поликлональных AT, истощенных на сорбенте против различных антигенных детерминантов и содержащих обычно AT только против одной антигенной детерминанты.
Моноклональные AT (МАТ) синтезируются одной иммунной клеткой-гибридомой. Эта клетка в культуре не только синтезирует один клон AT, но и способна бесконечно долго делиться. МАТ обычно высокоспецифичны. Однако они могут быть низкоаффинными и связываться только с одной антигенной детерминантой, которая может быть изменена в процессе препарирования .объектов.
AT обычно присутствуют в глобулиновой фракции сыворотки крови и в совокупности образуют субфракцию иммуноглобулинов (Ig), в которую входят иммуноглобулины G, А, М, D, Е. Против одного АГ может образоваться несколько AT. Средний диаметр AT достигает 10 нм [54, 115, 279, 300, 310, 357].

12.2. МЕТОДЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ АНТИГЕНОВ

В иммуно-ЭМ используют прямой и непрямой способы выявления АГ (рис. 32).

Двухслойный метод может быть реализован несколькими способами: 1) на первом этапе с помощью ПАТ метят АГ, а затем с ПАТ связывают противоиммуноглобулиновое AT, конъюгированное с маркером; 2) вначале АГ метят с помощью ПАТ, а затем с ПАТ связывают протеин А, конъюгированный с маркером; 3) первоначально АГ метят с помощью ПАТ, конъюгированного с биотином, а затем биотин связывают со (стрепт) авидином, конъюгированным с маркером; 4) на первом этапе АГ метят с помощью ПАТ, а затем к ПАТ присоединяется маркер, конъюгированный с изолированным специфическим АГ (подробнее см. ниже) (рис. 32, Я).
Трехслойный метод осуществляют следующими способами (рис. 32, III): 1) вначале с АГ связывают ПАТ, затем ПАТ метят вторым противоиммуноглобулиновым AT, наконец, с ВАТ связывают маркер, конъюгированный с иммуноглобулином, в роли которого может выступать и ПАТ; 2) на первом этапе с АГ связывают ПАТ, конъюгированное с гаптеном, затем с гаптеном соединяют второе противогаптеновое AT, наконец, ВАТ метят с помощью маркера, конъюгированного с гаптеном; 3) вначале АГ метят с помощью ПАТ, затем с ПАТ связывают второе противоиммуноглобулиновое AT, наконец, с ВАТ соединяют маркер, обработанный противомаркерным AT; 4) первоначально с АГ связывают ПАТ, затем с ПАТ сшивают второе гибридное AT, обладающее авидностью как против иммуноглобулинов, так и против маркера, наконец, препарат обрабатывается маркером, который связывается с гибридным AT.

0x01 graphic

Рис. 32. Методы иммуно-ЭМ.
1 - ПАТ; 2 - Мр; 3 - АГ; 4 - второе противоиммуногпобучиновое АГ; 5 - протеин А; 6 - биотин; 7 - стрептавидин; 8 - иммуноглобулин; 9 - гаптен; 10 - противомаркерное AT; 11 - гибридное AT. I-IV - пояснения см. в тексте, с.173-175.

Четырехслойный метод состоит в следующем (рис. 32, IV): вначале с АГ связывается ПАТ, затем с ним связывается противо-иммуноглобулиновое ВАТ, конъюгированное с биотином; последний связывается со стрептавидином, а к стрептавидину присоединяется маркер, конъюгированный с биотином.
Преимущества непрямого метода следующие: 1) антисыворотки к IgG обычно имеют высокий титр и авидность; 2) с каждой молекулой первого (специфического) AT могут связываться две меченые молекулы ВАТ, что увеличивает чувствительность метода (визуализация АГ становится более четкой); 3) экономичность - один препарат меченых ВАТ может быть использован для окрашивания множества ПАТ, необходимо только, чтобы последние были получены у животных того вида, IgG которого использованы для получения ВАТ; 4) связывание маркера с ПАТ представляет определенные трудности и не всегда эффективно, кроме того, добавление маркера может снижать авидность ПАТ [115, 279, 300, 310, 357].
Сущность метода иммуносорбентной ЭМ состоит в том, что подложку обрабатывают с помощью AT. Затем на подложку наносят суспензию исследуемых объектов. AT подложки связываются с АГ поверхностных структур этих объектов (вирусов, фагов и т.д.), как бы "вылавливая" их. После промывания и негативного контрастирования структуру адсорбированных частиц изучают в ТЭМ. В качестве носителя AT можно использовать поверхность бактериальной клетки. Вместо AT на сеточку можно вначале адсорбировать протеин А, а затем AT. Это повышает чувствительность и эффективность метода [179].

12.2.1. Метод меченого антигена

Частицы коллоидного золота (КЗ) покрывают белком - АГ, против которого получены AT. Ткань вначале обрабатывают избытком AT, а затем метят с помощью КЗ, конъюгированного с белком-АГ.
При этом каждая молекула AT одним концом связывается с тканевым АГ, а другим - с АГ на поверхности частицы КЗ. Реакцию можно провести и в другой последовательности. КЗ связывается с АГ, который затем взаимодействует с избытком AT. При этом часть антигенсвязывающих участков остается свободной и может при иммуномечении взаимодействовать с тканевыми АГ. Однако в этом случае пропадает одно из достоинств непрямых реакций - универсальность меченого реагента второго слоя.

12.2.2. Метод с протеином А или G

Определенными штаммами Staphylococcus aureus (А) или стрептококков G (G148) продуцируются белки (протеины А и G соответственно), которые имеют свойство специфически связываться с Fc-фрагментом иммуноглобулинов (главным образом IgG) нескольких видов животных. С протеином А и G можно конъюгировать несколько маркеров, но чаще всего используется КЗ. Протеин А или G можно связывать также с пероксидазой хрена (ПХ) и ферритином.
Протеин А имеет очень высокую аффинность к человеческим IgGl, IgG2, IgG4 (но не к IgG3) и к мышиным IgG2a, высокую - к человеческим IgG2b, среднюю - к IgG3, слабую - к IgGl и к крысиным IgG2c, к остальным IgG аффинность отсутствует. Протеин G очень высокоспецифичен ко всем 12 видам IgG за некоторыми исключениями: так, он имеет высокую аффинность к мышиным IgG2b и IgG3; слабую - к крысиным IgGl и IgG2b; среднюю - к крысиным IgG2c [171].
Метод иммуно-ЭМ с протеином А или G относится к двухступенчатым. После первичного взаимодействия AT с АГ, присутствующим на поверхности УС, комплекс АГ-АТ визуализируется с помощью связывания протеина А или G с Fc-фрагментом молекулы первого иммуноглобулина. Другими словами, комплекс маркера с протеином А или G при иммуномечении выполняет функцию ВАТ (второй слой). Недостаток метода в том, что протеин А или G на УС выявляет все присутствующие иммуноглобулины. Поэтому стадию блокирования неспецифического связывания нормальной сывороткой приходится опускать. Другими словами, при использовании метода с протеином A(G) нельзя применять блокаторы, содержащие глобулины, так как может иметь место неспецифическая псевдоиммунная реакция с протеином А.
Протеин А или G бывает удобно использовать лишь в тех случаях, когда не применяются ВАТ против иммуноглобулинов того вида животных, от которого получены ПАТ. Протеин А используется в том же разведении, что и ВАТ.
Хотя спонтанное взаимодействие между смолой, используемой для заливки, и комплексом маркера с протеином А или G в стандартных условиях минимально, неспецифическое связывание все же может наблюдаться, если проводить реакцию в нестандартных условиях или не обрабатывать УС перед иммуномечением растворами в ФБФР инертных протеинов (05%-ного раствора яичного белка, 05%-ного бычьего сывороточного альбумина или 2%-ного обезжиренного порошка молока).
Очень важно, чтобы комплекс протеина А или G с КЗ находился в растворе при соответствующем разведении. Если для приготовления КЗ пользовались таниновой кислотой (ТК), то к буферному базовому раствору, применяемому для разведения, необходимо добавлять для предупреждения неспецифического связывания Тритон Х-100 или Твин-20 до концентрации 0.05-0.1 % [307].
Метод с протеином А или G имеет ряд преимуществ перед методами с использованием противовидовых AT: 1) протеин А или G связывается с IgG многих видов животных (нет необходимости подбирать антитела против ПАТ); 2) он высокорезистентен к денатурирующим воздействиям; 3) способ конъюгирования протеина А или G с КЗ отличается простотой, является прямым и дает высокоактивный мономерный комплекс, который сохраняет свои свойства в течение года; 4) специфические AT того же самого животного можно использовать для двойного мечения; 5) комплекс КЗ с протеином А или G имеет очень низкую степень неспецифического связывания с заливочной средой УС; 6) один и тот же раствор протеина А или G может одновременно использоваться как для СМ, так и для ЭМ; 7) возможно мечение нескольких АГ на одном срезе с помощью КЗ с частицами разного размера. Если применяется протеин А или G для локализации двух АГ, то надо обязательно использовать обе стороны УС (без подложки).
Популярность способа объясняется его относительной простотой, а также возможностью обнаружения разных иммуноглобулинов с помощью одного маркера и одновременного окрашивания нескольких АГ одной клетки протеином А или G, связанным с частицами КЗ разного размера. Метод с протеином А или G среди других способов иммуномечения дает наибольшее разрешение, поскольку размер его молекулы равен 5 нм, а длина молекулы AT 8 нм. Если диаметр частиц КЗ равен 15 нм, то на поверхности каждой из них укладывается по 60 молекул протеина А.
К недостаткам метода можно отнести слабое реагирование протеина А или G с определенными мышиными и крысиными МАТ; иногда для усиления реакции после воздействия ПАТ применяют промежуточную обработку УС высокоочищенными кроличьими противомышиными или противокрысиными IgG.
Перед иммуномечением с помощью комплекса КЗ с протеином А или G надо проверить, нет ли на УС компонентов, которые связываются с КЗ. Для этого УС обрабатывают раствором КЗ, стабилизированным полиэтиленгликолем или Твином-20 при тех же значениях рН и ионной силы раствора, которые будут использованы при иммуномечении. Если КЗ неспецифически связывается УС, то нужно подобрать белок с высокой аффинностью к КЗ и слабой - к тканевым компонентам и включить его в состав инкубационной среды.
Для уменьшения неспецифического связывания комплекса КЗ с протеином А или G применяют один из следующих способов: 1) блокирование непрореагировавших альдегидных групп с помощью аминирования (инкубация объектов в 0.05 М растворах NH4CI, лизина или глицина в буфере в течение 45-60 мин, t=4®С); 2) блокирование мест неспецифического связывания путем преинкубации с инертными белками; 3) использование оптимальных концентраций комплекса КЗ с протеином А или G [308].
Кроме того, фоновое окрашивание уменьшается, во-первых, с помощью преинкубации УС в растворе альбумина или Твина-20, во-вторых, путем использования акрилатов вместо эпоксидных смол, в-третьих, вследствие применения метода плавания сеточки на капле вместо погружения в нее. Комплекс КЗ с протеином А или G перед каждым использованием необходимо центрифугировать при малой скорости центрифуги. Этот комплекс стабилен несколько месяцев, если его готовить в стерильных условиях и хранить при t=4®С (замораживать не рекомендуется). В тех случаях, когда необходимо замораживание, комплекс должен быть разведен 50%-ным глицерином. Перед лиофилизацией необходим диализ против 0.005 М NH₄HCO₃.
Мечение протеином А или G осуществляют при физиологических значениях рН. Протеин G с поликлональными AT лучше всего связывается при рН 7.2-7.4, с моноклональными мышиными AT (IgGl, IgG2) - при рН 5.0. Все последующие промывания также лучше осуществлять при рН 5.0. Протеин А или G обычно используют в концентрации 20 мкг/мл. Инкубация должна проводится в хорошо увлажненной атмосфере, особенно если она занимает длительное время [54, 115, 279, 300, 310, 357].

12.2.3. Метод санидином (стрептавидином)

Авидин - высокомолекулярный гликопротеин, выделяемый из яичного белка и имеющий очень высокое сродство (четыре участка связывания) к биотину - низкомолекулярному витамину, присутствующему в яичном желтке. Связывание биотина с авидином необратимо, что делает образующиеся комплексы очень устойчивыми к промыванию и сходным процедурам. Биотин ко-валентно соединяется с белковым лигандом без значительного снижения его способности к связыванию и специфичности. При этом сам биотин сохраняет значительную степень сродства к авидину, конъюгированному с маркером. С авидином может быть конъюгировано множество маркеров: КЗ, ферритин, гемоцианин, ферменты и др. Комплекс авидина с КЗ является единым универсальным лигандом не только для AT, но и для многих биотинилированных лектинов, гормонов, токсинов и т.п.
Авидин из яичного белка способен образовывать комплексы с КЗ при рН 8.5. Комплекс стабилен и может долго храниться в холодильнике без нарушения способности к связыванию. Взаимодействие авидина с биотином не нарушается при альдегидной фиксации. Следовательно, можно фиксировать ткань после взаимодействия биотинилированного лиганда с рецептором, что позволяет избежать потери молекул лиганда или их перемещение из-за последующих гистохимических процедур.
Для того чтобы избежать нежелательного связывания авидина с биотином, присутствующим в таких тканях, как печень и почки, срезы обрабатывают свободным авидином, который затем насыщают биотином. На каждой молекуле биотина имеется только один авидинсвязывающий участок и, следовательно, связывание биотин-авидинового комплекса, помеченного маркером, с тканью исключается.
Биотин можно присоединить к молекуле AT или к маркеру, например ПХ. Авидин также можно пометить ПХ. В этом случае реакция иммуномечения будет иметь следующий вид. Первый "слой" - кроличьи AT к исследуемому АГ, второй "слой" - биотинилированные козьи AT к кроличьим IgG, третий "слой" - комплекс авидина с биотинилированной ПХ или КЗ. Компоненты необходимо смешивать в таком соотношении, чтобы часть биотин-связывающих участков молекулы авидина была не занята биотинилированным маркером и могла бы взаимодействовать с биотином, присоединенным к AT второго "слоя". Затем ПХ обычно проявляют диаминобензидином или другим методом. Очевидно, что в данном случае к каждой точке, содержащей АГ, будет присоединено довольно много молекул маркера. Разведенный комплекс авидина с КЗ перед использованием следует отцентрифугировать.
Стрептавидин, который получается из бактерии Streptomyces avidim, имеет физико-химические свойства, сходные с таковыми авидина из белка куриного яйца. Оба вещества являются тетрамерами и связываются с коферментом биотином с чрезвычайно высокой аффинностью. Стрептавидин не гликозилирован и имеет нейтральную изоэлектрическую точку, что делает его чрезвычайно удобным для детектирования биотинилированных лигандов.
При использовании этого метода возможны различные варианты проведения иммуномечения - можно либо биотинилировать ПАТ и ВАТ, либо к ПАТ или ВАТ присоединить стрептавидин, связанный с КЗ (либо вначале присоединить стрептавидин, а затем - связанное с биотином КЗ). Возможна процедура мечения в три ступени: 1) ПАТ; 2) биотинилированные антивидовые ВАТ; 3).меченый стрептавидин. Последний может маркироваться с помощью ПХ или КЗ при использовании стрептавидина в качестве мостика по такой схеме: первая ступень - ПАТ, вторая - биотинилированные антивидовые ВАТ, третья - стрептавидин, четвертая - биотинилированный фермент или КЗ. Для этой же цели можно применять преформированные комплексы: первая ступень - ПАТ, вторая - биотинилированные антивидовые ВАТ, третья - биотинилированный фермент, конъюгированный со стрептавидином. Очень часто биотин конъюгируется и с AT, и с молекулой фермента, а авидин используется в качестве мостика.
Биотин-стрептавидиновый метод обладает высокой специфичностью и аффинностью. Кроме биотинилированных целых AT можно использовать биотинилированные фрагменты AT (F(ab)2), которые получают из молекул AT с помощью переваривания пепсином, для того чтобы получить АГ-связывающие сайты имму-ноглобулиновых молекул без Fc-фрагмента [54, 115, 279, 300, 310].
Молекула авидина обладает большим зарядом и из-за высокой аффинности к биотину она связывается с любым ферментом, роль кофактора у которого выполняет биотин. Кроме того, авидин неспецифически связывается с ДНК (стрептавидин имеет к ДНК меньшую аффинность), гранулами тучных клеток и компонентами соединительной ткани [116]. Для предупреждения этого используют специальные наборы. Вначале ткани обрабатывают авидином, который связывается с эндогенным биотином, а затем биотином, блокирующим реакционные центры авидина. Поскольку молекула биотина содержит только одно место связывания авидина, дальнейшей обработки не требуется. Для блокирования неспецифического связывания с гранулами тучных клеток и компонентами соединительной ткани раствор авидина разводят бикарбонатным буфером (рН 10), содержащим высокую концентрацию соли (5 М NaCl) [115, 116].

12.2.4. Метод с комплексом пероксидаза-антипероксидаза (ПАП)

Комплекс пероксидаза-антипероксидаза обычно используется в качестве третьей ступени иммуноцитохимической реакции: он реагирует с ВАТ, свободные реакционноспособные группы которых связываются с имеющимися в его составе IgG. Суть метода в том, что вначале ПХ связывают с AT против нее, при этом образуется ПАП-комплекс. К препарату, обработанному последовательно ПАТ и ВАТ, добавляют ПАП-комплекс. Так как AT против ПХ имеют другие антигенные детерминанты по сравнению с ПАТ, то ВАТ связываются как с ПАТ, так и с AT против ПХ. Другими словами, третий "слой" образует очень стабильный комплекс, состоящий, как правило, из кроличьих AT к пероксидазе, связанных с ПХ (ПАП-комплекс). Он служит в качестве АГ для немеченых противокроличьих ВАТ (обычно козьих). В качестве ПАТ также применяют кроличьи IgG. Козьи противокроличьи ВАТ должны быть в избытке по отношению к AT первого "слоя", чтобы второй антиген-связывающий участок ВАТ мог взаимодействовать с ПАП-комплексом; последний используется в разведении 1 : 100 или 1:1000. Время инкубации в рабочем растворе ПАП чаще всего составляет 3 мин.
Метод иммуно-ЭМ с ПАП имеет ряд преимуществ: 1) ПАП - комплекс состоит из трех молекул фермента и двух молекул AT, поэтому к одному АГ присоединяются три молекулы фермента, следовательно, образуется в 3 раза больше продукта реакции, чем при использовании обычного метода с ПХ; 2) чувствительность метода повышается в 100-1000 раз по сравнению с пероксидазным, так как молекулы ПХ связаны с AT не химически, а как АГ с AT, что не сопровождается потерей ферментной активности; 3) можно использовать более высокие разведения ПАТ, что понижает неспецифическое окрашивание; 4) метод обеспечивает очень высокую специфичность реакции, так как ПАП-комплекс представляет собой высокоочищенный препарат и взаимодействует только с AT к кроличьим иммуноглобулинам второго "слоя"; 5) ПАП-комплекс не реагирует с неспецифически связавшимися AT, поскольку они не являются анти-IgG. Для того чтобы ПАП-комплекс не связывался непосредственно с тканью (фоновое окрашивание), достаточно провести блокирование объектов с помощью нормальной сыворотки.
Недостатки ПАП-метода следующие: 1) требуются дополнительные реагенты; 2) процедура окрашивания удлиняется. Использование ПАП-комплекса для преэмбеддинга не очень эффективно, поскольку и IgG и ПАП-комплекс имеют довольно большие размеры (молекулярная масса 156 000 и 420 000 соответственно) и плохо проникают через клеточные мембраны. Преэмбеддинг обычно применяется только в том случае, когда не дает результатов метод постэмбеддинга [106].
В последние годы альтернативным ПАП-комплексу является авидин-биотиновый комплекс с пероксидазой (АБПХ). После связывания с ПАТ объект обрабатывают ВАТ, конъюгированными с биотином, а затем комплексом АБПХ, авидин которого связывается с биотином ВАТ. Высокая чувствительность метода обеспечивается большим числом молекул ПХ, конъюгированных с авидином. Комплекс АБПХ имеет меньшие размеры (молекулярная масса 188 000), чем ПАП, и больше пригоден для преэмбеддинга [106].
Использование комплекса авидин-биотин-пероксидаза, особенно для исследования плохо стабилизируемых АГ, увеличивает воспроизводимость результатов и снижает уровень неспецифического окрашивания [115, 116].

12.2.5. Метод динитрофенол-гаптенового сандвича

Вначале проводится реакция иммуноглобулина с имидоэфирным производным динитрофенола (DNP-N-IE) - образуется гаптен. Обработанные таким образом AT сохраняют свою авидность к тканевым АГ. В качестве ВАТ используют IgM против динитрофеноля, которые связываются с полученным гаптеном с высокой эффективностью. Третьим "слоем" является меченная динитрофенолом ПХ (или КЗ) [115, 310].

12.3. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИТЕЛ

AT должны обладать, во-первых, высоким сродством к АГ, во-вторых, хорошей авидностью (липкостью, или силой связывания с АГ), в-третьих, достаточным титром (концентрацией AT). В случае использования МАТ фактор разведения не столь важен, так как в принципе можно получить неограниченное количество AT и практически без побочных реакций. AT, используемые для локализации любого гликопротеина, должны быть проверены на их реакцию с углеводными эпитопами для предупреждения перекрестной реакции с гликопротеинами, содержащими сходные группы. Созданы так называемые гибридные AT, содержащие Fab-фрагменты против двух разных эпитопов (см. рис. 32).
В настоящее время значительное число ПАТ продается фирмами. Однако они дороги и поставляются в небольших количествах. Цены на ВАТ значительно ниже. Для каждого нового объекта проводится определение оптимального уровня разведения. Разведение ПАТ, как правило, невелико (от 1: 2 до 1: 25) [240]. Для разведения ПАТ используют физиологический раствор, забуференный ФБ или Трис-буфером (рН 7.2) и содержащий 0.1 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0.01 % азида натрия. Обработка препаратов с помощью ВАТ обычно продолжается 1- 2 ч при комнатной температуре или 12 ч при t=4®С [54, 279, 300]. Раствор ПАТ, разведенный с помощью раствора, блокирующего неспецифическое окрашивание, носит название "рабочего раствора".
Следует тщательно следить за возможностью бактериальной контаминации инкубационных сред и других рабочих растворов: раствора, блокирующего неспецифическое связывание (РБНС), и раствора для разведения AT, особенно если реакция проводится при комнатной температуре. Поэтому эти растворы рекомендуется использовать свежеприготовленными или фильтровать через миллипоровый фильтр [116].

12.4. МАРКЕРЫ

Иммуноглобулины электронно-прозрачны и поэтому для их выявления используют маркеры (подробнее см. гл. 22). Это могут быть ферменты (ПХ, кислая и щелочная фосфатаза, глюкозо-оксидаза), неферментные макромолекулы и микроорганизмы (гемо-цианин, вирусы, цитохром С), дериваты связанных с гемом микропероксидаз, обладающие способностью расщеплять перекись водорода, псевдопероксидазы, металлопротеины или комплексы полисахарида с металлом (ферритин, железодекстран, железоманнан), коллоидные частицы металлов (золота или других благородных металлов), металлы (уран, комплекс урана с осмием, железо, ртуть), полимеры (полиэтиленимин, образующий комплексы с золотом и серебром в виде частиц диаметром 10 нм, полистирен, полиметакрилаты, кополимеры с железом и кремниевые микросферы) и др.
Применимость различных маркеров зависит от конкретных условий проведения реакции. Так, хотя КЗ лучше выявляется в ЭМ, однако конъюгат AT с ферритином более чувствителен к АГ. Поэтому в том случае, когда важнее иметь большую чувствительность, лучше использовать ферритиновый маркер. Если окрашивание УС тщательно контролируется, то частицы ферритина могут быть легко распознаны.
При конъюгации маркера с AT свойства последних (в том числе авидность) могут меняться. Конъюгация маркера с ПАТ (см. гл. 21) обеспечивает минимальное отклонение локализации частицы маркера от местоположения АГ. Двух и более этапные реакции ведут к увеличению этого отклонения. В процессе конъюгирования с маркером не все молекулы лиганда связываются с меткой. Эффективностью мечения называется доля молекул АГ, меченная частицами маркера.
Эффективность мечения зависит от следующих причин: 1) специфичности AT и маркера; 2) доступности антигенных детерминант; 3) чувствительности АГ к химической фиксации; 4) степени диссоциации маркера во время мечения; 5) стехиометрии процесса мечения; 6) способа препарирования; 7) способа мечения [115, 279, 300, 310]. Конъюгирование маркера с AT может быть одно- и двухступенчатым [103].
На процесс иммуномечения существенное влияние оказывает способность AT и маркера проникать внутрь УС, а фиксаторов воздействовать на сохранность АГ. Для улучшения доступа AT и маркера к внутриклеточным структурам используется метод раскалывания образцов, защищенных криопротектором, с иммуномечением после оттаивания и удаления криопротектора. Для оценки латерального распределения антигенных детерминант в плоскости мембраны используют метод иммуно-ЭМ в сочетании с замораживанием-травлением [115, 310].

12.5. МЕТОДЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ В ИММУНО-ЭМ

В зависимости от того, когда проводится реакция АГ с AT, методы иммуно-ЭМ могут быть разделены на три группы: 1) беззаливочные (использование крио-УС), 2) предзаливочные (преэм-беддинг), 3) постзаливочные (постэмбеддинг).

12.5.1. Крио-УС в иммуно-ЭМ

Использование крио-УС из предварительно фиксированной или нефиксированной ткани позволяет проводить иммуномечение тканевых АГ с помощью AT без обработки объектов дегидратантом и без заключения их в заливочные среды. Метод используется для локализации лабильных АГ. Обычно иммуномечение крио-УС проводят после их оттаивания при комнатной температуре. Этот метод обеспечивает лучшую доступность АГ и позволяет быстро получить результат иммунной реакции. Сохранность антигенов на крио-УС гораздо выше, чем при других методах, поскольку значительно сокращено число этапов препарирования. В большинстве случаев перед криоультратомией объекты фиксируют. Для улучшения проникновения AT в качестве маркера рекомендуется применять частицы КЗ сверхмалого размера (1 нм) с последующим серебрением (см. ниже) [102].

12.5.1.1. Иммуномечение

Иммуномечение крио-УС осуществляется различными способами, но чаще всего непрямым двухступенчатым, в том числе и с протеином А или G. В случае альдегидной фиксации объектов для инактивации альдегидных групп крио-УС дважды обрабатывают раствором глицина (см. Приложение, 12.1).
Перенос срезов лучше осуществлять с помощью петли диаметром 3-4 мм. После этого сеточки готовы для окрашивания ПАТ: на парафильм или специальный планшет наносят по капле раствора AT (около 10 мкл) для каждой сеточки, затем с помощью противокапиллярного пинцета (рис. 33) каждую сеточку из буфера переносят на эту каплю. Для промывания надо сделать по шесть больших капель буфера для каждой сеточки и перенести сеточку сначала в первую каплю буфера, а затем промывать в течение по крайней мере 1 мин в каждой капле. Обработку раствором ВАТ и последующее промывание осуществляют также. После иммуномечения сеточки также проводят через шесть крупных капель 0.1 М ФБ для удаления глицина и фиксируют в 2%-ном ГА в течение 5 мин (эта ступень может быть исключена, если ГА уже использовался, но желательна, если применялся один только ФА). Затем сеточки промывают в шести крупных каплях воды для подготовки к контрастированию (см. Приложение, 12.2 и 12.3). Для уменьшения фона вместо желатины можно использовать бычью сыворотку новорожденных телят. Эта сыворотка содержит только следы IgG, которые не связывают протеин А. Она дает также минимум фона после оттаивания крио-УС, особенно когда применяют очень аффинные и авидные (клейкие) белки, такие как лектины и МАТ. Сеточки перед реакцией с AT обрабатывают в течение 10 мин с помощью 10%-ного раствора этой сыворотки на ФБФР. Все растворы AT и комплекса КЗ с протеином А или G рекомендуется готовить на этой смеси. Методы контрастирования крио-УС после иммуномечения аналогичны таковым при обычном контрастировании (см. гл. 8) [115, 310].

0x01 graphic

Рис. 33. Оротивокапиллярный пинцет (1) с зажатой в нем сеточкой (2).

12.5.2. Преэмбедцинг

Метод преэмбеддинга предполагает, что иммунологическая реакция проводится перед легкой фиксацией или после нее, но до заключения в заливочную среду (ЗС) и получения УС. Эта техника необходима для исследования АГ, вымывающихся или денатурирующихся в процессе обработки в дегидратанте, пропитки ЗС и их полимеризации. Метод преэмбеддинга включает фиксацию, изготовление микросрезов (вибратомных или, реже, криостатных) и(или) пермеабилизацию объектов (увеличение проницаемости клеток и тканей), иммуномечение, исследование объектов в СМ, осмирование, заливку в ЗС, изготовление УС, исследование в ТЭМ.
При изучении органов реакция с AT в режиме преэмбеддинга чаще всего производится на микросрезах тканей (как фиксированных, так и нефиксированных). Это улучшает соотношение поверхность/объем. Микросрезы толщиной 20-80 мкм готовят перед проведением иммуномечения с помощью вибратома. Можно использовать также криостатные срезы. После иммуномечения объект обычно дофиксируется, осмируется и готовится для ТЭМ. Осмирование существенно увеличивает контрастность препаратов (см. Приложение, 12.4).
Преэмбедцинг удобен для мечения поверхности живых клеток, клеточных фракций и изолированных клеток, когда метка легко достигает расположенного на их поверхности АГ, однако мечение внутриклеточных компартментов часто затруднено. Преимуществом преэмбеддинга является лучшая сохранность АГ тканевых и клеточных структур. Это обусловлено тем, что АГ не контактируют с растворителями до иммуномечения. Кроме того, эта техника позволяет на микросрезах при помощи СМ до заливки объектов найти и отметить нужный участок.
Однако у данного метода есть ряд недостатков: 1) не всегда удовлетворительная сохранность ультраструктуры тканей, что существенно затрудняет интерпретацию изображений; 2) иммуномечение необходимо проводить почти сразу же после взятия объектов; 3) требуются значительные по объему опытный и контрольный объекты, поскольку для выявления каждой антигенной детерминанты нужен как минимум один микросрез; 4) AT плохо проникают в ткани, что создает добавочные проблемы при препарировании и делает необходимым повышение проницаемости объектов; 5) в процессе обработки тратится большое количество дорогостоящих AT; 6) затруднено проведение двойного иммуно-мечения [54, 115, 279, 300, 310].

12.5.2.1. Фиксация и хранение объектов

Особенности фиксации образцов для иммуно-ЭМ изложены в гл. 2. Подчеркнем, что тип применяемого фиксатора зависит от резистентности антигенных детерминант. В последующем объекты могут сохраняться либо в буфере, либо в слабом растворе ФА при t=4®С. В первом случае, если фиксированный объект хранится при комнатной температуре, в буфер необходимо добавлять 0.2 % азида натрия.

12.5.2.2. Пермеабилизация

Существенным недостатком метода преэмбеддинга является незначительная глубина проникновения в ткани AT. Увеличение концентрации и длительности инкубации не дают существенного улучшения результатов. Если не проводить специальной обработки, то из-за больших размеров AT и комплексов AT с маркером реакции AT с АГ в основном ограничиваются поверхностными слоями объектов. Использование AT, меченных КЗ (частицы размером 1 нм), иногда позволяет без помощи детергентов исследовать более глубокие слои объекта.
При работе с предварительно фиксированными криостатными микросрезами, препаратами органных или клеточных культур, мазками или целыми кусочками тканей необходимо разрушить липидные компоненты мембраны, чтобы обеспечить их проницаемость для AT.
С целью повышения доступности тканевых структур для AT объекты подвергаются обработке, увеличивающей проницаемость клеток и тканей - пермеабилизации. Для этого используют, во-первых, вещества, разрушающие барьерные свойства биологических мембран, и прежде всего детергенты (например, добавление 0.02-0.1 % сапонина в промывающий раствор после фиксации, 10-20-минутная обработка 0.04-1.0%-ным Тритоном Х-100 на ФБФР после фиксации или его добавление в тех же концентрациях непосредственно к фиксатору), во-вторых, обработку органическими растворителями для удаления мембранных липидов (например, обработка фиксированных объектов этанолом при низких, порядка 5-20 %, его концентрациях в течение 2-10 мин). В ряде случаев используют замораживание-оттаивание (например, быстрое замораживание и оттаивание объектов, обработанных криопротекто-ром). Проникновение крупных частиц КЗ в ткани после воздействия сапонина затруднено. В этом случае рекомендуется использовать более мощные детергенты, в том числе и до фиксации объектов.
Однако применение неионных детергентов, таких как НП40 (NP40), Тритон Х-100 (и даже сапонинов), разрушает мембранные структуры клеток и вызывает значительное экстрагирование клеточного содержимого, а также вымывание и перераспределение самих АГ. Использование Тритона Х-100 в смеси с фиксирующими жидкостями в .значительной степени нарушает ультраструктуру клеток и тканей, его воздействие после фиксации повреждает ткани в меньшей степени, но и достигаемое повышение проницаемости тканей для AT, особенно конъюгированных с маркером, будет существенно снижено. Сапонин и метанол, если их применять после фиксации, обеспечивают наибольшую сохранность субмикроскопической морфологии объектов, но также пермеабилизируют их в небольшой степени [115].

12.5.2.3. Иммуномечение и заливка

После пермеабилизации объекты (клетки, кусочки тканей или микросрезы) обрабатывают раствором AT в соответствующем разведении. Для преэмбеддинга обычно требуются более высокие концентрации AT. Обработка объекта раствором ПАТ (обычно в концентрации 0.5 мкг/мл) продолжается несколько часов (до 17 ч). В качестве маркера обычно используют ферменты. КЗ дает менее удачные результаты. После иммуномечения образцы фиксируют с помощью ГА и ЧО, обезвоживают и заключают в ЗС (как правило, в эпоксидную смолу). При этом применяется обычная процедура обезвоживания и заливки. Вибратомные срезы лучше вначале расправить и приготовить препараты для СМ, из которых впоследствии и получают УС [300].

12.5.3. Постэмбеддинг

Постэмбеддинг - это группа методов иммуно-ЭМ, при которых процедура иммуномечения проводится на УС, что позволяет применять очень маленькие объемы растворов AT. Данное семейство методов можно разделить на две группы в зависимости от того, какой тип смол используется в качестве ЗС: 1) гидрофобные смолы (эпоксидные и полиэфирные смолы, Ловикрилы НМ20 и НМ23 и др.); 2) гидрофильные акрилаты [306] (см. Приложение, 12.5). Следует иметь в виду, что при использовании эпоксидных смол метод постэмбеддинга имеет небольшую чувствительность и эффективность. В качестве маркеров чаще всего применяются КЗ и ПАП-комплекс.
Схема препарирования включает фиксацию, обезвоживание, заключение в ЗС и изготовление УС, которые и подвергаются иммуномечению. УС, полученные из заключенных в гидрофобные смолы объектов, перед иммуномечением нуждаются в травлении. В этом случае желательно использовать золотые или никелевые сеточки с углеродной подложкой [115, 126, 300, 310].

12.5.3.1. Использование гидрофобных ЗС

В случае заключения объектов в гидрофобные смолы необходима процедура травления УС, улучшающая доступность АГ для AT. Точное время травления определяют эмпирически. Следует учитывать, что сама процедура травления способна повреждать АГ. Сокращение времени травления приводит к снижению доступности тканевых АГ, а его удлинение ведет к повреждению УС и увеличению неспецифического связывания. Залитые блоки могут храниться много лет [189].
Эпоксидные УС перед иммуномечением с целью демаскировки АГ обрабатывают 5-10%-ным раствором перекиси водорода в течение 8-10 мин, однако перекись водорода не должна быть старой (срок хранения не более 2 мес). Ее рекомендуют разводить ех tempore, лучше в бидистиллированной воде. Для травления можно применять раствор этоксида натрия (см. Приложение, 123.3) в разведении 1 : 10 или больше (время обработки 1-3 мин). Если объекты фиксировались в ЧО, то для демаскировки АГ лучше использовать насыщенный (0.1%-ный) раствор метаперйодата натрия (время обработки 3-10 мин). Эта процедура предпочтительнее, если в качестве маркера используется коллоидное золото [115, 116, 240]. После травления УС промывают и обрабатывают раствором ПАТ. Сохранность ультраструктуры при такой обработке обычно удовлетворительная. После травления и иммуномечения УС могут быть вновь заключены в смолу [87].
Для установления СМ-ЭМ-корелляций ПС после иммуномечения можно обработать серебром, а с соседнего участка изготовить УС и, не проводя физического проявления, исследовать локализацию маркера малого диаметра [54].

12.5.3.2. Использование гидрофильных акрилатов

Процедура заключения в акрилаты описана в гл. 6. Для улучшения иммуномечения УС рекомендуется, во-первых, облучагь их перед иммуномечением с помощью УФО, во-вторых, разводить комплекс КЗ с протеином А в 10-50 раз больше, чем рекомендуется производителями, в-третьих, промывать в промежутке между процедурами УС при t=60®С. Все это позволяет уменьшить неспецифическое связывание, например, в случае комплекса КЗ с протеином А до 6-10 частиц на 1000 мкм² [225].

12.5.4. Условия проведения иммуномечения

Для иммуно-ЭМ удобнее использовать чуть более толстые акриловые УС. Лучше брать желтоватые, а не серые УС, поскольку при высушивании их толщина становится нормальной, тогда как серые УС при этом будут слишком тонкими и хрупкими, а контрастность получаемого изображения очень низкой. Если работать с сеточками, покрытыми подложкой, по УС повреждаются значительно меньше [249].

12.5.5. Процедура иммуномечения

Обычно для проведения иммуномечения используют пластинку воска, парафильм в чашке Петри или пластиковый иммунологический планшет с мелкими лунками. На пластинку помещают ряды с каплями реактивов в нужной последовательности. Количество рядов должно быть равно числу окрашиваемых сеточек. Чашки Петри и планшеты необходимо закрывать крышкой - это предохраняет объекты от загрязнения и помогает сохранить 100%-ную влажность внутри чашки. На крышке чашки пишут номера сеточек. Для улучшения перемешивания жидкости планшеты удобно помещать на вращающиеся столики. В этом случае во время инкубации сеточка должна плавать на поверхности капли срезами вниз. Иммуномечение крио-УС можно производить либо на поверхности капли реагента, либо погружением в каплю.
Время инкубации чаще всего составляет 1-2 ч при комнатной температуре или около 12 ч при t=4®С. Некоторые АГ не требуют столь длительной инкубации - достаточно 30-120 мин [300].
Если необходимо локализовать на УС два разных АГ, то сначала обрабатывают одну поверхность среза соответствующими ПАТ и ВАТ, а затем, поворачивая сеточку другой стороной, обрабатывают таким же образом вторую поверхность УС соответствующими AT. Иммуномечение в этом случае обязательно осуществляется в процессе флотации сеточки на поверхности капли реагентов.
Для того чтобы предупредить загрязнение первой стороны сеточки во время второго мечения, первую сторону после высушивания можно напылить тонким слоем углерода. Если УС собирали на подложку, то после первого иммуномечения их напыляют углеродом, подложку растворяют, проводят второе мечение, после чего УС можно вновь покрыть формваровой подложкой [115].

12.5.6. Промывание

После иммуномечения сеточки с УС должны быть тщательно отмыты. Обычно непосредственно после инкубирования сеточек с УС в рабочем растворе ПАТ их вначале промывают в холодном (t=0®С) ФБ или РБНС, а затем в бидистиллированной воде. Использование холодных растворов позволяет удалять загрязнения и одновременно препятствует вымыванию специфически связавшихся AT [116]. Промыть сеточки можно, если переносить их из одной крупной капли в другую или многократно погружать в емкость с промывающей жидкостью. Высушивать УС во время процедуры мечения нежелательно. Это возможно только перед контрастированием при помощи УА и ЦС. Промывание (до 6 раз) сеточек удобно осуществлять на большой капле (100-200 мкл) промывочной жидкости. Можно промывать сеточку струей буфера из шприца. Поскольку в большинстве случаев в иммуно-ЭМ применяют никелевые сеточки, то можно воспользоваться магнитными мешалками, которые заставляют сеточки интенсивно вращаться на капле промывочной жидкости. Скорость вращения не должна быть очень высокой (60 об./мин). Нельзя использовать магнитные мешалки, которые нагревают жидкость на платформе, так как это ведет к денатурации АГ и испарению жидкости [310].

12.5.7. Контрастирование и просмотр в ТЭМ

Для контрастирования обычно используются УА и ЦС (подробнее см. гл. 8). Так, после иммуномечения УС из ловикрила или ЛР Байт рекомендуется контрастировать на капле УА и капле ЦС, а затем подвергнуть действию паров ЧО, этап обезвоживания проводить в метаноле и на соответствующем этапе обработать объекты 2%-ным УА на 70%-ном метаноле (в течение 1 ч). После просмотра УС в ТЭМ процесс формирования поперечных сшивок завершается, поэтому повторные иммуномечение и контрастирование делаются затруднительными и не рекомендуются.

12.5.8. Одновременное исследование ПС и УС

Данный метод предполагает заливку образцов в гидрофильные акрилаты, изготовление ПС толщиной 1 мкм, которые монтируют на стекла. Сразу же после изготовления ПС с той же пирамидки получают несколько УС, которые с свою очередь помещают на сеточки. ПС используют для иммуно-СМ и последующего изготовления УС для ТЭМ. Последовательный просмотр ПС и УС позволяет визуализировать одни и те же клетки под СМ и ЭМ.

12.5.9. Иммуно-СЭМ

Для иммуно-СЭМ маркер должен иметь размеры, превышающие 20 нм. При меньших размерах маркера необходимы прецизионные СЭМ высокого разрешения или надо использовать метод серебряного усиления (см. гл. 21, а также Приложение, 12.6 и 21.4).

12.5.10. Комплексные реакции

На одном образце можно комбинировать реакции иммуно-ЭМ и ЭМ-гистохимии. При этом вначале проводят гистохимическую реакцию, а затем иммуномечение. Можно комбинировать иммуно-ЭМ с авторадиографией. Для этого вначале вводят меченную изотопом молекулу, затем осуществляют иммуномечение и, наконец, УС покрывают фотоэмульсией [145, 310].

12.5.11. Оценка результатов иммуно-ЭМ

Одним из наиболее применимых контролей для иммуно-ЭМ является иммуно-СМ. Поэтому довольно часто возникают проблемы ложнонегативной реакции на уровне СМ (при иммуно-ЭМ мечение есть, а при иммуно-СМ его нет). Это может быть связано с фокальным распределением АГ. Одна из причин - маскированные АГ. Ложноположительная (на уровне СМ) реакция может быть обусловлена одним из следующих обстоятельств: 1) перекрестной реактивностью; 2) неспецифическим связыванием AT с тканями; 3) наличием эндогенной активности пероксидазы или авид-ности некоторых клеточных компонентов для индикатора реакции; 4) захватом чужеродной ткани (например, опухолевых клеток, которые имеют исследуемый АГ); 5) освобождением растворимых протеинов из прилежащих клеток.
Гетерогенность популяции поликлональных AT в сыворотке ведет к их взаимодействию не только с исследуемым АГ, но и с другими компонентами ткани. С другой стороны, несколько родственных веществ (особенно это касается пептидов) часто имеют общие аминокислотные последовательности, в результате чего AT реагируют с несколькими АГ вместо одного.
Перекрестная реактивность является наиболее важным моментом из всех отмеченных. Очень часто надо дать ответ на вопрос, что это - перекрестная реактивность или коэкспрессия. В первом случае одни и те же структуры будут метиться несколькими AT, однако более интенсивно - с истинной антигенной детерминантой, во втором случае будут метиться различные структурные компоненты. Иногда приходится последовательно метить серийные срезы несколькими AT для окончательного решения этого вопроса [184, 185].
AT может перекрестно реагировать с другими пептидсодержащими молекулами, которые имеют те же самые или сходные детерминанты. Перекрестная реакция может протекать с белками, которые имеют лишь незначительное функциональное или структурное сходство с исходным АГ, за исключением наличия сходной антигенной детерминанты.
Истинную перекрестную реакцию устранить нельзя. Можно попытаться работать с AT, специфичными к разным частям молекулы, если, конечно, такие препараты AT имеются. Более того, хотя тот или иной АГ у разных видов животных может иметь одно и то же название, чаще всего ему присущи некоторые отличия в строении. Поэтому перекрестная реакция с АГ животного другого вида может протекать, а может и отсутствовать.
Для ориентировки можно рекомендовать также непрямой метод - двойное или тройное окрашивание, проводимое последовательно или параллельно при помощи AT, не дающих перекрестной реакции. Именно так поступают в случае использования двойного иммуноферментного метода. Можно покрасить две стороны одной и той же ЭМ-сеточки разными препаратами AT, отличающимися по диаметру конъюгированных с ними частиц КЗ.
Перекрестное реагирование становится несущественным при использовании лигандов, не связанных друг с другом химически, например, если первый АГ идентифицируется с помощью биотинилированных МАТ с последующей обработкой комплексом стрептавидина с КЗ (диаметр частиц 15 нм), то второй АГ - с помощью небиотинилированных МАТ с последующей обработкой комплексом козьих AT, конъюгированных с КЗ (диаметр частиц 40 нм).
Для двойного мечения ПАТ, продуцируемые разными видами животных, можно смешивать в одном растворе; в случае, если нет перекрестной реактивности, это же допустимо и с ВАТ [54, 115, 279, 300, 310]. Метод иммуно-ЭМ позволяет осуществлять иммуномечение и трех различных АГ [145].

12.5.12. Неспецифическое мечение

Одним из недостатков всех методов иммуно-ЭМ являются неспецифические реакции, связанные с возникновением гидрофобных и электростатических взаимодействий между иммуноглобулинами и компонентами ткани, а также реакции загрязняющих AT с тканевыми АГ. Неспецифическое связывание приводит к возникновению фона. В числе причин этого феномена можно отметить, во-первых, существование в объектах непрореагировавших альдегидных групп, во-вторых, наличие неспецифических мест связывания на объектах, в-третьих, неполное протеиновое покрытие частиц КЗ, что и вызывает электростатические взаимодействия между маркером и объектом. Присутствие в препаратах некротически измененных или плохо фиксированных клеток приводит к увеличению неспецифического окрашивания, возможно, из-за адсорбции сывороточных протеинов и КЗ.

12.5.13. Способы снижения фона

При наличии сильного фона его необходимо уменьшить одним из следующих способов: 1) использовать более высокие разведения ПАТ и(или) ВАТ; 2) до нанесения ПАТ провести блокирование нормальной сывороткой животного - донора ВАТ; 3) удалить свободный маркер из рабочего раствора; 4) провести адсорбцию ПАТ и ВАТ альбумином или порошком ткани животного того вида, ткань которого окрашивают (например, добавить нормальную козью сыворотку в рабочий раствор); 5) провести аффинную очистку ПАТ (при этом может понизиться авидность); 6) удалить комплемент из препарата ПАТ путем добавления постороннего комплекса АГ-АТ или прогревания антисыворотки в течение 30 мин при t=56®С; 7) вместо одного маркерного фермента использовать другой; 8) увеличить время иммуномечения, но снизить температуру рабочего и промывающего растворов до t=4®С; 9) изменить протокол фиксации-заливки [116].
Неспецифическое связывание иммуноглобулинов за счет гидрофобных или электростатических взаимодействий можно предотвратить, если адсорбировать на исследуемых объектах антисыворотку или порошок ткани.
Другой метод сводится к предварительной обработке ткани альбумином или нормальной неиммунной сывороткой, которая готовится из крови неиммунизированного животного того же вида, что и донор ВАТ, и используется в основном для блокирования неспецифического окрашивания. При этом блокируется большинство участков неспецифического связывания, но образующиеся связи слабее, чем связь АГ с AT, и поэтому не мешают специфическим ПАТ взаимодействовать с АГ. К рабочему раствору AT можно также добавить нормальную сыворотку до концентрации 1 %. Связывания иммуноглобулинов с Fc-рецепторами при окрашивании фиксированной ткани обычно не наблюдается, однако при исследовании поверхностных АГ на живых клетках в культуре или в суспензии могут возникать трудности. Неспецифические реакции такого рода можно исключить, работая с Fab-фрагментами вместо целых иммуноглобулинов.
В результате сильного разведения антисыворотки абсолютное количество загрязняющих AT падает. Введение в буфер для промывания детергента (0.2 % Тритона Х-100) снижает неспецифическое связывание белков.
В качестве белков-блокаторов чаще всего используются овальбумин (1 %), БСА (1-3 %), желатина, включая полученную из рыбы (1-5 %), обезжиренный порошок сухого молока (2-4 %), ацетилированный БСА (0.01 %), сывороточный альбумин человека (0.25%). Для уменьшения фона лучше преинкубировать УС в растворе овальбумина либо добавить к раствору AT альбумин (1 %), желатину (1 %) или Твин-20 (0.5 %). Преинкубация ПС в 5%-ном растворе нежирного сухого молока в значительной степени подавляет неспецифическую адсорбцию частиц КЗ.
Обработка препаратов ацетилированными и "вытянутыми" молекулами БСА перед инкубацией объектов с меченными КЗ реагентами второго "слоя" практически полностью блокирует связывание конъюгатов КЗ с гидрофобными субстратами. В этом случае для предупреждения маскирующего действия ацетилированного БСА на АГ в раствор добавляется Твин-20, поскольку он как бы инкапсулирует конъюгаты золота.
Еще раз подчеркнем, что если в качестве усиливающего реагента используется протеин А или G, то нельзя применять БСА или другие сывороточные белки в качестве блокирующего неспецифическое связывание агента, поскольку иммуноглобулины нормальной сыворотки могут связываться с протеином А. Однако с протеином А не реагирует сыворотка цыплят [115, 300].

12.6. ОСНОВНЫЕ КОНТРОЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ

Для предварительной оценки результатов, обнаружения определенных структур, а также для проведения первых контрольных опытов целесообразно комбинировать СМ и ЭМ. Ввиду возможного неспецифического связывания AT очень важно проводить контроль для каждого этапа иммуно-ЭМ.

12.7. ВОЗМОЖНЫЕ НЕУДАЧИ В ИММУНО-ЭМ, ИХ ПРИЧИНЫ И ПУТИ УСТРАНЕНИЯ

Нет мечения. Причины: 1) трудности, связанные с реактивностью AT (выполнить тест на реактивность); 2) АГ поврежден (попробовать другие фиксаторы, заливочные среды, обработать ферментами для демаскировки АГ); 3) нарушение последовательности этапов (повторить процедуру); 4) чрезмерное разведение ПАТ (определить оптимальное разведение); 5) ПАТ испорчены (повторить процедуру с новой порцией ПАТ); 6) маркер денатурирован (попробовать свежий маркер); 7) искаженные параметры инкубации (использовать рекомендованные параметры).
Сигнал слишком слабый. Причины: 1) чрезмерное разведение ПАТ; 2) чрезмерное разведение маркера; 3) время серебряного усиления слишком мало.
Гетерогенность маркерных частиц после серебряного усиления. Причины: 1) неподходящий метод серебряного усиления.
Высокий фон. Причины: 1) неправильные условия инкубации; 2) избыточная концентрация ПАТ; 3) неподходящий тип желатины или другого блокирующего белка; 4) микропреципитация серебра во время серебряного усиления.
Преципитация проявляющего раствора. Причины: 1) хромовая кислота, применявшаяся для мытья посуды, не отмыта с ее стенок; 2) имеет место контакт с металлами во время препарирования.
В случае двойного мечения УС, если перепутать его стороны, будет происходить связывание других ПАТ свободными молекулами протеина А, адсорбированными на частицах КЗ, которые использовались во время первой реакции [115, 279, 300, 310].
Глава 13 гибридизация in situ в электронной микроскопии

13.1. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

Гибридизация - это реакция формирования водородных связей между нуклеотидами при взаимодействии цепочек нуклеиновых кислот с комплементарными последовательностями нуклеотидов. Гибридизация может происходить между двумя цепями ДНК, между цепью ДНК и цепью РНК и между двумя цепями РНК. Гибридизация in situ (ГИС) с использованием нуклеиновых кислот в качестве зондов позволяет морфологически (на срезе или мазке) исследовать уровень экспрессии тех или иных генов в различных нормальных и патологических условиях.
ГИС позволяет выявлять определенные последовательности нуклеиновых кислот в целых клетках, на гистологических срезах и УС, в хромосомах, а также селективно распознавать генетический материал и молекулы РНК-посредников (т. е. локализовать специфические нуклеотидные последовательности в ДНК и РНК на ультраструктурном уровне в пределах клетки), морфологически идентифицировать локусы репликации, транскрипции и трансляции генов, места взаимодействия цепочек РНК со специфическими структурами клеток. Данный метод дает возможность выявлять специфические последовательности нуклеотидов как в тканях и клетках, так и в хромосомах. ГИС может быть использована вместе с мечением антигенов на одном и том же объекте [114, 372].
Идея метода очень проста - использовать меченые зонды из нуклеиновых кислот, которые способны связываться с "мишенями" - комплементарными цепочками нуклеотидов ДНК или РНК - с образованием гибридных молекул.
Суть метода ГИС состоит в том, что синтезируется зонд - последовательность нуклеотидов, комплементарная анализируемой последовательности нуклеотидов молекулы-мишени ДНК или РНК. Зонд метят либо изотопом (радиационные зонды), либо "молекулами-репортерами" (нерадиационные зонды), для обнаружения которых существуют специфические иммунные или аффинные системы. Детектирование зонда осуществляется, во-первых, посредством регистрации излучения включенных в его состав изотопов (чаще всего трития), во-вторых, с помощью аффинного или. иммунного выявления "молекулы-репортера" [89, 168, 270, 289, 290, 360] (см. Приложение, 13).

13.2. ОСОБЕННОСТИ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

В процессе препарирования необходимо достичь двух во многом взаимоисключающих целей: сохранить молекулы нуклеиновых кислот и структурную организацию клеток. В конечном итоге получаемый сигнал зависит от ряда факторов: 1) вида объектов; 2) степени разрушения мишени; 3) выбора фиксатора; 4) метода препарирования.
Главной опасностью при препарировании является возможность деградации РНК с помощью РНКазы - вездесущего и очень термостабильного фермента. В связи в этим все манипуляции необходимо проводить в перчатках. Посуда и другое термостабильное оборудование должны подвергаться автоклавированию при t=250®С как минимум в течение 4 ч. Пластмассовые изделия и растворы также следует автоклавировать перед использованием. В процессе препарирования в растворы необходимо добавлять ингибиторы РНКазы.
Использование нефиксированных объектов, их дегидратация и потеря целостности клеток в процессе резания при рутинном препарировании существенно ускоряют процессы деградации нуклеиновых кислот из-за освобождения содержимого лизосом и действия эндогенных нуклеаз. Поэтому фиксацию желательно осуществлять сразу же после взятия материала. От момента изъятия до момента начала фиксации не должно проходить более 10-20 мин. Увеличение этого времени резко снижает уровень получаемого сигнала.
В качестве фиксаторов используют вещества, образующие поперечные связи (например, ГА, ФА), и так называемые преципитаты (например, этанол, метанол, ацетон), последние, однако, для целей ЭМ имеют весьма ограниченное применение.
Из-за интенсивного образования поперечных связей после использования фиксаторов перед ГИС клетки и ткани подвергают пермеабилизации для улучшения проникновения зонда.
Наиболее широко в настоящее время используют ФА, который обеспечивает возможность проведения на одном и том же объекте иммуноцитохимических исследований и ГИС. Однако в большинстве случаев перед началом исследования необходимо подбирать адекватный фиксатор. Обычно чем дольше фиксируют объект, тем меньше уровень получаемого сигнала. В этом случае требуется обработка срезов протеиназами.
Фиксированный материал может храниться с определенными предосторожностями в буферном промывочном растворе в течение 1-2 мес при t=4®С. С другой стороны, с фиксированных объектов следует как можно быстрее (делая минимальным риск бактериального загрязнения и деградации мишени) приготовить кри-остатные срезы (однако подобный метод резко снижает пригодность объектов для ЭМ). Наконец, замороженные блоки сохраняются значительно дольше в жидком азоте или при t=-70®С. Криостатные срезы обычно помещают на свободные от РНКазы предметные стекла, покрытые поли-Ь-лизином, и высушивают на воздухе. Они могут храниться в течение года при t=-70®С. Изолированные клетки рекомендуется осаждать на покрытое полилизином предметное стекло.

13.3. ЗОНДЫ

Нуклеотидные последовательности, применяемые в качестве зондов, могут состоять из одной или двух цепочек ДНК и одной цепочки РНК. Одноцепочечные зонды обеспечивают повышенную эффективность гибридизации в условиях насыщения без конкурирующей собственной нуклеотидной цепочки, отделенной в процессе нагревания. При этом одноцепочечные зонды РНК имеют преимущество, так как гибриды РНК с РНК представляют собой наиболее стабильные двойные нуклеотидные цепи. Более эффективны небольшие по размеру последовательности нуклеотидов вследствие их лучшей способности к проникновению в ткани. Большинство исследователей, работающих в этой области, синтезируют собственные зонды. Однако в настоящее время быстро увеличивается число коммерчески доступных зондов [89]. Зонды для ГИС имеются в продаже.
Перед использованием необходимо проверить специфичность зонда (в соответствии с методами молекулярной биологии). Имеется обратная зависимость между размерами зонда и его специфичностью. При выборе специфичного зонда желательно избегать наличия повторяющихся нуклеотидных последовательностей, для того чтобы зонд не связывался с множественными посторонними нуклеотидными цепочками. Варьирование последовательности нуклеотидов минимально в областях, кодирующих белки.
Температура плавления гибридов имеет обратную зависимость от длины зонда и коррелирует с количеством в нем тех или иных нуклеотидов: зонды с увеличенным содержанием аденина и тимина имеют более низкую температуру плавления по сравнению с цепочками, где преобладают гуанин и цитозин. Чаще всего используют зонды, состоящие из 100-400 оснований.
Для ГИС применяют следующие виды зондов: 1) ДНК (одно-и двухцепочечные), 2) РНК, 3) олигонуклеотиды. ДНК и РНК продуцируют с клонируемых последовательностей, а олигонуклеотиды синтезируют химическим путем с помощью автоматических синтезаторов ДНК. Зонды из ДНК клонируются в бактериальных плазмидах или бактериальных векторах. После клонирования их достаточно легко пометить посредством имеющихся в продаже специальных наборов.

13.3.1. ДНК-зонды

ДНК-зонды обычно прочнее, чем РНК, поскольку ДНКазы легче удаляются из зоны препарирования, чем РНКазы. Гетерологичные двухцепочечные ДНК способны формировать в клетке сеть, вызывая усиление сигнала. Такая ситуация особенно часто встречается, если зонд имеет на одном конце свободное основание, комплементарное основанию на другом конце зонда. В связи с большими размерами ДНК-зонды с трудом проникают внутрь клеток. ДНК-зонды, состоящие из двух цепочек, перед использованием должны быть денатурированы (например, с помощью кипячения) для отделения цепочек друг от друга и для того, чтобы комплементарная цепь могла гибридизироваться с комплементарной цепочкой мишени. В процессе проведения реакции идет конкуренция между реакциями восстановления ДНК и гибридизации зонда с мишенью, причем первая имеет преимущество.
ДНК-зонды, включающие меченую векторную цепочку, могут увеличивать уровень фона при проведении ГИС на клетках из-за реагирования с геномом мишени и неспецифического связывания с клеточным матриксом. Для предупреждения этого проводят очистку зонда от векторной цепочки с помощью электрофореза в геле.

13.3.2. РНК-зонды

РНК-зонды имеют как преимущества, так и недостатки. Например, поскольку они состоят из одной цепочки нуклеотидов, перед их использованием не требуется денатурации. Кроме того, не происходит реакции восстановления двойной цепочки в растворе. К нуклеотидной цепочке зонда может быть получена комплементарная цепочка, которую используют в качестве негативного контроля. Поскольку температура плавления (денатурации) гибридов, содержащих РНК, выше, чем в случае двойной цепочки ДНК, для проведения реакции гибридизации требуется более высокая температура. Однако такие условия способствуют снижению неспецифического связывания. При проведении ГИС необходимо осуществлять борьбу с РНКазами, легко разрушающими зонд. Скорость реакции гибридизации с РНК-зондами ниже, чем в случае ДНК-зондов, что заставляет увеличивать либо концентрацию зонда, либо время реакции.
Для проведения реакции гибридизации РНК-зонды требуются в меньшей концентрации, чем ДНК-зонды, что существенно снижает уровень фона. Они имеют определенный размер. Оптимальный размер зонда - 100-400 оснований. Как правило, РНК-зонды синтезируют с помощью транскрипции с кусков ДНК, внедренных в бактериальную плазм иду рядом с промотором (участком нуклеотидной цепочки, связывающим РНК-полимеразу). Наборы с РНК-полимеразой для этой цели имеются в продаже. Если матрица ДНК, используемая для получения зонда, имеет большие размеры, то с помощью гидролиза размер получаемого зонда легко может быть уменьшен. РНК-зондам присуща высокая специфичность, они содержат до 80 % меченых нуклеотидов.

13.3.3. Олигонуклеотидные зонды

Использование олигонуклеотидных зондов увеличивает доступность метода для исследователей, поскольку такие зонды можно легко и достаточно быстро на основе опубликованных матриц синтезировать в больших количествах. Эти зонды особенно применимы для маркировки семейств генов с высокогомологичными участками цепочек нуклеотидов. Олигонуклеотидные зонды состоят из одной цепочки ДНК. Поэтому реакции восстановления двойной цепи в растворе не происходит. Кроме того, зонд не разрушается РНКазами. Обычные размеры зонда составляют 17-150 оснований, что позволяет обходиться без процедуры пермеабилизации. Однако специфичность таких зондов существенно ниже.

13.4. МАРКЕРЫ

Для визуализации радиационных зондов используются принципы ЭМ-АРГ. Этот довольно простой прямой метод чаще всего применяют при работе с большими по размерам объектами (целыми клетками на подложках, хромосомными "развертками" и т.п.). Однако степень разрешения при этом довольно низкая. Более высокое разрешение достигается при использовании для детектирования зонда биотин-стрептавидиновой системы, когда вначале осуществляют биотинилирование зонда, а после проведения реакции гибридизации биотин детектируют комплексом стрептавиди-на (или авидина) с КЗ, либо конъюгированными с маркером про-тивобиотиновыми антителами. Если используют неконъюгиро-ванные антитела, то их затем выявляют с помощью анти-IgG соответствующего вида или протеина А или G, конъюгированного с КЗ или ПХ.
Такого рода зонды обычно представляют собой последовательность из 200-1000 нуклеотидов, причем каждое десятое основание является биотинилированным. Процесс биотинилирования проводится с помощью так называемой НИК-трансляции (от английского nick - разрезать) с использованием биотинилированного D-уридинтрифосфата (УТФ). Биотинилированные зонды химически стабильны и сохраняют активность в течение долгого времени при t=-20®С. Перед использованием зонды, состоящие из двух цепочек, подвергают денатурации.

13.4.1. Процедура мечения

Большинство методов мечения зондов обеспечено имеющимися в продаже наборами (китами) и соответствующей литературой.

13.4.1.1. Реакция НИК-трансляции

В присутствии ДНК-полимеразы и четырех молекул нуклеотидтрифосфата (одна из которых содержит метку) в одну из цепочек ДНК с помощью фермента вносят разрывы. Полимераза восстанавливает заново одну цепочку ДНК, используя неповрежденную цепочку в качестве матрицы. Обычно одновременно воздействуют двумя ферментами. Первый - панкреатическая ДНКаза-1, которая формирует случайным образом разрывы (щели, nick) в каждой цепочке нуклеотидов вдоль молекулы ДНК. Второй - ДНК-полимераза-1 из кишечной палочки, которая, оперируя в области разрывов, в свою очередь также обладает двойной энзиматической активностью: эндонуклеазной активностью, с помощью которой постепенно удаляются нуклеотиды с 5'-конца разорванной цепочки, и полимеразной активностью, с помощью которой к 3'-концу одновременно присоединяются комплементарные к основаниям другой цепочки меченые нуклеотиды. В результате этого начальный разрыв перемещается вдоль молекулы ДНК в 5'?3'-направлении и при этом формирует однородно меченный зонд. Субклонирования не требуется.

13.4.1.2. Метод удлинения ДНК-зонда от "матрицы" (primer extension)

Вначале двойную молекулу ДНК денатурируют с целью получения изолированных нуклеотидных цепочек, для чего лучше использовать линейную, а не кольцевидную ДНК. Затем к каждой из полученных изолированных цепочек нуклеотидов ДНК случайным образом присоединяют состоящие из шести оснований фрагменты ДНК, которые используются в качестве своеобразного "запала" (матрицы). В дальнейшем с помощью фрагмента ДНК-полимера-зы-1 к 3'-концу "запала" присоединяют меченые (и немеченые) нуклеотиды. Гексануклеотидные цепочки образуются при гидролизе ДНК с помощью ДНКазы или посредством химического синтеза олигонуклеотидов. Наборы для проведения реакции "запального удлинения" имеются в продаже. Из-за перемещения цепочек нуклеотидов по отношению друг к другу возможно образование сетчатых структур. Размеры зонда могут быть уменьшены в результате обработки ультразвуком.

13.4.1.3. Одноцепочечный однородно меченный ДНК-зонд

Применение такого зонда позволяет избежать проблем, связанных как с восстановлением двойной цепочки ДНК зонда после денатурации, так и с действием РНКаз. ДНК-зонд, состоящий из одной цепочки нуклеотидов, получают посредством одноцепочеч-ного вектора из бактериофага М13. Вначале цепочку нуклеотидов субклонируют в М13. Затем к вектору добавляют "запал" - синтетический олигонуклеотид, меченые нуклеотиды и фрагмент ДНК-пол имеразы-1. После синтеза зонда его вместе с матрицей отрезают с помощью рестрикционной эндонуклеазы, денатурируют для отделения меченого зонда от матрицы и очищают с помощью электрофореза на агарозовом геле.

13.4.1.4. Мечение концов олигонуклеотидных зондов

Обычно для синтеза имеются фирменные наборы. Суть метода в том, что с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы к концу синтетического олигонуклеотида присоединяют несколько меченых нуклеотидов.

13.4.1.5. Транскрипция in vitro РНК-зондов

Наборы для синтеза имеются в продаже. Суть метода заключается в том, что РНК-полимераза катализирует синтез РНК из нуклеотидов на матрице ДНК. В плазмиду встраивается промотор, а сразу же за ним - матрица. Если "отрезать" плазмиду с помощью рестрикционной эндонуклеазы непосредственно перед промотором, то можно потом добиться транскрипции только зонда (без цепочки самого вектора). Биотинилированные зонды можно получить с помощью биотинилированного УТФ или аллил-УТФ, который биотинилируется уже после транскрипции.

13.4.1.6. Прямое мечение

Ковалентно связываться с нуклеиновыми кислотами могут как фотоактивируемые, так и химически реактивные группы. К примеру, синтезирован и имеется в продаже фотоактивируемый аналог биотина, который может использоваться для мечения больших количеств ДНК или РНК.

13.4.2. Выбор меченого зонда

Как уже упоминалось выше, все меченые зонды можно разделить на две группы: радиоактивные и нерадиоактивные. Выбор типа мечения определяет получаемое разрешение. Как правило, существует обратная зависимость между разрешением и чувствительностью. На выбор типа мечения оказывают влияние также скорость проявления, необходимость в количественном анализе, стабильность зонда, безопасность, легкость использования и стоимость реактивов. Для ЭМ можно рекомендовать только один тип изотопа - тритий. Его детектирование осуществляется в процессе ЭМ-АРГ. Экспозиция занимает в среднем 1-3 мес. Ее можно укоротить, если пометить зонд более чем одним меченным тритием нуклеотидом.
Среди нерадиоактивных маркеров наиболее широко используется биотин, который в дальнейшем детектируют с помощью противобиотиновых антител или стрептавидиновой системы (см. гл. 12). Мечение при помощи фотобиотина и аллил-УТФ дает больший уровень фона, чем применение биотин-УТФ. Присутствие во многих тканях эндогенного биотина также резко увеличивает неспецифическое мечение. Применение нерадиоактивных маркеров дает возможность изучать строение хромосом в интерфазном ядре.
Нерадиационные зонды имеют следующие преимущества: 1) стабильность; 2) высокий уровень разрешения; 3) безопасность для здоровья; 4) отсутствие проблем с обезвреживанием; 5) быстрое детектирование сигнала; 6) недорогое лабораторное оборудование. Главный их недостаток - низкая чувствительность [89, 99, 168, 270, 289, 360].

13.5. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

Весь метод ГИС распадается на четыре части - получение и мечение нуклеинового зонда, гибридизация пробы на срезе и визуализация гибридных молекул.
Специфичность реакции гибридизации очень высока, если соблюдать стандартные условия. Причем каждый из факторов может оказывать влияние на данный процесс. Мишень для гибридизации должна иметь только одну цепочку нуклеотидов. Поэтому для этих целей более подходит молекула РНК, тогда как молекула ДНК должна быть денатурирована, для того чтобы цепочки нуклеотидов в двойной цепи ДНК отделились друг от друга. Температура денатурации, выше которой связывания между парами нуклеотидов не происходит, в обычных условиях равна 90®С. Максимальная скорость гибридизации отмечается при температуре, которая на 25-30®С ниже температуры денатурации (плавления), при такой температуре гибридизация обычно и производится. Однако при колебаниях в пределах 5®С около температуры плавления скорость существенно не изменяется. Температура денатурации может быть вычислена исходя из состава нуклеотидов. Она уменьшается при повышении процента адениновых и тимидиновых оснований или при неадекватности соотношений между парами оснований.
Температура денатурации может быть уменьшена в щелочной среде, в растворах с низкой ионной силой или при увеличении концентрации в растворе полярных анионных молекул, например формамида. Применение формамида для снижения температуры реакции гибридизации позволяет лучше сохранить ткани. Каждый процент формамида в среде для гибридизации позволяет снизить температуру на 0.35®С для ДНК-РНК-связей и на 0.65®С для ДНК-ДНК-связей [89, 169, 270, 289, 360].
Реакция гибридизации зависит от скорости диффузии зонда к мишени, степени законченности формирования гибридов, стабильности образованных двойных связей. Скорость диффузии обратно пропорциональна размеру зонда. Оптимальным размером зонда считается последовательность из 200-500 нуклеотидов. Использование зондов большего или меньшего размера уменьшает интенсивность получаемого сигнала. Оптимальной концентрацией радиоактивного зонда является 0.5 нг/мкл, а для нерадиоактивного 2.0 нг/мкл.
Продолжительность гибридизации зависит от сложности зонда, его длины и концентрации в растворе. Если продолжительность реакции чрезмерно увеличить, то буферный раствор, на котором готовится среда для гибридизации, будет удалять РНК из тканей. Обычно продолжительность гибридизации соответствует нескольким часам, в ряде случаев раствор с начавшейся реакцией оставляют на ночь. Гибридизации в течение 1 ч достаточно для детектирования 100 копий мРНК на клетку. Более длинные и менее сложные зонды гибридизируются быстрее. Включение полимеров в среду для гибридизации увеличивает скорость гибридизации и количество связанной метки. Стабильность связывания зонда прямо пропорциональна его длине. Гибриды РНК-РНК более устойчивы к действию высокой температуры, чем ДНК-ДНК, а ДНК-РНК занимают промежуточное положение.
Итак, оптимальными параметрами для реакции гибридизации являются температура на 25-30®С ниже температуры плавления, концентрация формамида около 50 % и содержание солей в пределах 0.75 моль/л. Реакция гибридизации оптимизируется и с помощью определенного микроокружения. Гибридизационные зонды обычно используются в растворе, который содержит физиологический раствор, забуренный цитратным буфером, формамид, сульфат декстрана, неспецифические отрезки молекул ДНК и РНК. Для уменьшения фона непрореагировавшие зонды после гибридизации могут быть удалены с помощью обработки РНКа-зой [89].

13.5.1. Пермеабилизация

Пермеабилизация, как правило, ухудшает сохранность ультраструктур и увеличивает потерю нуклеиновых мишеней. Обработка объектов с помощью протеаз (пепсина, преназы или протеиназы К) или разбавленных растворов кислот (соляной) приводит к удалению основных белков и увеличению уровня сигнала, несмотря на некоторую потерю мишени, особенно РНК, и повреждение, структур.
Требуемый уровень депротеинизации определяется исходя из силы фиксации, типа ткани, размера зонда, используемого фермента, наличия других пермеабилизирующих процедур. Используемые протеиназы должны быть свободны от РНКазной активности. Действие протеиназ останавливается с помощью инкубации объектов в растворе глицина или посредством дофиксации, которая к тому же одновременно увеличивает проницаемость объекта.
Для увеличения проницаемости объекты можно обрабатывать Тритоном Х-100. Проницаемость увеличивается при воздействии дегидратантов, при замораживании и оттаивании.
В процессе препарирования тканей, как правило, всегда применяется та или иная форма их начального переваривания, чтобы сделать возможным проникновение зонда к мишени внутри клетки. Кроме того, необходимо освободить мишень от ассоциированных белков.

13.5.2. Процедура постгибридизации

Целью постгибридизационных процедур является удаление неспецифически связанных зондов из объектов для увеличения соотношения сигнал-шум. Поэтому условия промывания должны быть более жесткими, чем при гибридизации. Кроме того, требуется обработка с помощью нуклеаз для снижения фонового связывания меченого зонда. Обычно для этих целей применяют РНКазы, которые разрушают одноцепочечные молекулы ДНК, тогда как гибридные молекулы оставляют интактными. При использовании ДНК-зондов после гибридизации ферменты обычно не применяют.

13.5.3. Детектирование радиоактивных зондов

Вслед за постгибридизационными процедурами объекты обезвоживают, высушивают на воздухе и обрабатывают в соответствии с методикой ЭМ-АРГ (см. гл. 10 и Приложение, 13.2).

13.6. ПРОЦЕДУРА ГИБРИДИЗАЦИИ IN SITU

Для проведения ГИС необходимо сначала приготовить последовательность нуклеотидов, комплементарную исследуемому гену. В эту цепочку и встраиваются нуклеотиды, меченные биотином или тимидином.
ЭМ-гибридизация in situ может проводиться в режимах без заливки (на крио-УС фиксированных образцов), перед заливкой (преэмбеддинг), т.е. на фиксированных объектах, подвергнутых пермеабилизации, и после заливки (постэмбеддинг) [207]. В процессе подготовки образцов в большинстве случаев используется тот или иной способ фиксации. Чаще всего это ГА в различных концентрациях в смеси с ФА.

13.6.1. Преэмбеддинг

Существует несколько вариантов препарирования объектов для их исследования в ЭМ.

В качестве контроля применяют, во-первых, исследование неповрежденных (неактивированных) клеток, во-вторых, проводят инкубацию с неспецифической нуклеотидной цепочкой или с небиотинилированным зондом, в-третьих, обрабатывают клетки РНКазой или ДНКазой перед гибридизацией.
Недостатком ГИС с помощью преэмбеддинга является плохая сохранность ультраструктуры. Кроме того, зонды и частицы КЗ, связанные с антителами или авидином (стрептавидином), плохо проникают в фиксированные целые клетки [89, 270, 289, 360].

13.6.2. Постэмбеддинг

В большинстве случаев объекты заключают в водорастворимые заливочные смолы (см. гл. 4). При полимеризации акрилатов рекомендуется использовать меньшую интенсивность УФО для лучшей сохранности ДНК. УС собирают обычно на золотые или никелевые сеточки с углеродно-формваровой подложкой. Все процедуры проводят путем флотирования (плавания) сеточек УС вниз на микрокаплях.
До гибридизации УС помещают в глицин, переваривают РНКазой, нуклеиновые кислоты в них денатурируют, проводят прегибридизацию путем обработки протеазами. Затем на каплю гибридизирующей смеси помещают сеточку с подготовленными к гибридизации УС. После гибридизации сеточки подвергают действию формамида, дважды промывают в цитратном физиологическом растворе, а затем в ФБФР. Связавшиеся с мишенью биотини-лированные зонды метят противобиотиновыми антителами или стрептавидином, конъюгированным с КЗ. Неконъюгированные антитела детектируют с помощью противовидовых антител или протеина А, конъюгированных с КЗ или с другим маркером. УС обычно контрастируют с помощью УА и ЦС [207].
Некоторые авторы рекомендуют вначале УС обработать РНКазой, отмыть, проинкубировать в растворе протеазы, а затем - едкого натра для денатурации клеток и вирусной ДНК в срезах, промыть водой и высушить. Вместо едкого натра можно применять соляную кислоту, которая освобождает пуриновые основания из заключенных в смолу молекул ДНК. Можно использовать кипячение в воде или сухое нагревание до t=100®С. Затем сеточки с УС инкубируют в смеси для гибридизации и промывают в ФБФР [289]. Метод ГИС можно проводить и на ПС (см. Приложение, 13.1 и 13.3).
Методы постэмбеддинга имеют ряд недостатков: 1) длительное время экспозиции; 2) ограниченное разрешение; 3) низкая чувствительность; 4) невысокая эффективность [270, 289, 360].

13.7. СИНТЕЗ ЗОНДОВ IN SITU

Реакция НИК-трансляции может быть проведена непосредственно на акриловых УС. В реакцию вступают участки ДНК, экспонированные на поверхности УС и доступные ДНКазе-1. Для этого УС инкубируют в среде, содержащей ДНКазу-1, ДНК-полимеразу и четыре молекулы дезоксирибонуклеотйда, одна из которых - D-УТФ - биотинилирована. Локализация биотина, включенного во вновь синтезируемую цепочку ДНК, после завершения реакции НИК-трансляции детектируется с помощью КЗ, конъюгированного с антивидовыми IgG и антибиотиновыми антителами. С помощью данного метода можно выявлять компоненты ядра и ядрышка, содержащие активную форму ДНК, митохондриальную ДНК, а также ДНК вирусов [18].

13.7.1. Гибридизация с использованием радиационных зондов

ЭМ-гибридизация in situ при использовании тритиевой метки проводится путем помещения сеточки с УС на каплю смеси для гибридизации во влажной камере. Меченные тритием зонды денатурируют кипячением [89].

13.8. СПЕЦИФИЧНОСТЬ МЕТОДА

Очень важно оценить, в каких структурах распределена метка. Поэтому или до, или после гибридизации при светоолтической гибридизации in situ объекты окрашивают подходящим красителем. Это зачастую само по себе является контролем.
Иногда описанным выше методом обнаруживаются неожиданные гомологичные связи между зондом и мишенью. Для определения этих связей используют негативный контроль - реакцию с тканями, относительно которых уже известно, что молекул-мишеней нет.
Для оценки самого метода можно провести реакцию с уже хорошо охарактеризованным зондом на позитивной клеточной системе, например с использованием зонда к мРНК актина;
Если имеются антитела к продукту исследуемого гена, то можно провести сопоставление между данными ГИС и иммуно-ЭМ на серийных срезах или на одном и том же срезе.

Специфичность зонда можно проверить на блотах (Northern blot). В этом случае комплементарная зонду цепочка выступает в качестве позитивного контроля, а цепочка, полученная в результате транскрипции той же ориентации (sense probe), что и сам зонд, - в качестве негативного контроля.
Очень полезным является конкурентный контроль, когда в среду для гибридизации добавляют смесь меченого и немеченого зондов. Уровень снижения сигнала должен быть пропорционален увеличению концентрации немеченого зонда.
Для контроля самой процедуры гибридизации рекомендуется провести реакцию без добавления зонда. Результат должен быть отрицательным. Уровень сигнала снижается, если объект обработать нуклеазой до гибридизации. Степень снижения сигнала можно оттитровать, однако надо тщательно удалить из объекта все следы нуклеазы.
Контроли маркерных систем описаны в соответствующих разделах (см. гл. 10 и 12).

13.8.1. Неспецифическое связывание

Уровень неспецифического связывания определяется поглощением меченого зонда тканевыми компонентами, электростатическим взаимодействием с белками, образованием ненасыщенных двойных связей между молекулой зонда и клеточными компонентами, фоном, зависящим от используемой маркерной системы.
Для уменьшения электростатического взаимодействия между зондом, и основными протеинами объекты перед гибридизацией рекомендуется обработать 0.25%-ным раствором уксусного ангидрида, который ацетилирует клеточные белки. Ацетилирование особенно полезно при использовании длинных зондов (более 250 нуклеотидов) и зондов, меченных биотипом; оно блокирует присоединение зонда к полилизину, применяемому в процессе препарирования для прикрепления объектов.
Очень часто для уменьшения неспецифического связывания используется процедура прегибридизации. Она проводится при температуре гибридизации и длится не более 2 ч. Среда для прегибридизации включает детергент, фикол, поливинилпирролидон, гепарин, альбумин (для снижения неспецифического связывания с белками), полисахариды и нуклеиновые кислоты (обычно используется свежеденатурированная ДНК или тРНК - для блокирования мест неспецифического связывания нуклеиновых кислот), а также пирофосфат натрия (для блокирования сайтов, соединяющихся с фосфатами зонда). Очень эффективна для предупреждения взаимодействия нуклеиновых кислот и белков в процессе прегибридизации ауринтрикарбоксиловая кислота (autinthicarboxylicacid).
Для блокирования неспецифического связывания биотинилированного зонда используется преинкубация объектов с немеченой системой маркирования (например, со стрептавидином или авидином) с последующей вторичной инкубацией со свободным биотином. Однако данный метод может быть малоэффективен, поскольку эти вещества легко удаляются при высокой температуре гибридизации и в присутствии формамида и детергентов. Кроме того, такие условия могут обнажать в тканях новые биотиноподобные молекулы.

13.8.2. Интерпретация и артефакты

Соотношение размеров молекул различных зондов показывает, что с одной молекулой-мишенью может связываться несколько гибридных зондов, меченных КЗ. Следовательно, к одной молекуле ДНК или РНК может быть прикреплено несколько частиц КЗ. Пространственная конфигурация мишени в клетке и прикрепленного зонда с частицами КЗ довольно сложна [121].
В случае преэмбеддинга зонды связываются со всеми доступными локусами комплементарных последовательностей нуклеотидов на мишени, однако визуализируются лишь те частицы КЗ, которые попали в плоскость среза. При использовании постэмбеддинга гибридизация происходит только в том случае, если на срезе имеется подходящая для связывания (комплементарная) последовательность нуклеотидов мишени, при этом видны все частицы КЗ, связанные с одной молекулой зонда.
Следует учитывать, что кластерное распределение частиц КЗ на препарате представляет собой двухмерную проекцию трехмерной конфигурации нуклеиновой кислоты. Однако, поскольку нуклеиновая кислота денатурирована, эта конфигурация не всегда отражает нативное состояние. Сложность трехмерной конфигурации мишени ведет к тому, что частицы КЗ, специфически маркирующие мишень, всегда формируют агрегаты, что позволяет легко отличать их от фонового отложения единичных частиц золота. Поэтому при гибридизации in situ с помощью преэмбеддинга обнаружение кластеров частиц КЗ свидетельствует о наличии в этом месте искомых нуклеотидных цепочек [89].

13.8.3. Меры предосторожности

При проведении гибридизации in situ необходимо пользоваться тщательно вымытой и простерилизованной (после споласкивания диэтилпирокарбонатом) посудой для ингибирования активности загрязняющих РНКаз. Все материалы, используемые в опыте, также необходимо промывать 0.1%-ным диэтилпирокарбонатом. Работать надо в резиновых перчатках.
Глава 14 ПРИМЕНЕНА ТРЕЙСЕРОВ В ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Трейсеры (tracer) - это экзогенные субстанции, использующиеся для получения информации о переносе веществ в биологических объектах. Данный метод часто носит название "метод молекулярных зондов". Применение трейсеров (Тр) позволяет изучать направленность динамических процессов в клетках и тканях с помощью ЭМ. Они используются для определения порозности или проницаемости физиологических барьеров, для отслеживания движения молекул в физиологических системах (например, для визуализации эндоцитоза макромолекул), для детектирования типов межклеточных соединений и тд. [106, 208].

14.1. ВЫБОР ТРЕЙСЕРА

Выбор трейсера (Тр) должен определяться, с одной стороны, его эффективным молекулярным диаметром, а с другой - предполагаемым размером и геометрией исследуемых тканевых путей. Нужно учитывать также форму молекулы Тр, гибкость или ригидность ее. Свойства молекул различных Тр в этом отношении варьируют. Например, молекула гемоглобина очень ригидна, а молекула декстрана с множеством ветвей очень гибка и может проходить через поры меньшего размера, чем ее диаметр.
Важнейшим параметром Тр является электрический заряд молекулы, который влияет на взаимодействие между Тр и отрицательно заряженной поверхностью клеток, например, микрососудистой стенкой. Тр могут быть электронейтральными (миоглобин, нативная ПХ), заряженными отрицательно (гемипептиды, сукцинилированная ПХ, каталаза) и заряженными положительно (цитохром С, катионизированная ПХ, лактопероксидаза, миелопероксидаза).
Наконец, движение частиц Тр в тканях и, в частности, их фильтрация через стенку капилляра и особенно через базальную мембрану определяется локальным распределением зарядов на поверхности эндотелия. При этом Тр часто связывается с изучаемой поверхностью, маркируя анионные места (сайты) [113, 215, 325].
Изучение внутриклеточного транспорта наиболее часто проводится с помощью введения во внеклеточное пространство ПХ. Если ПХ введена во внеклеточное пространство неповрежденного нейрона, то часть ее поглощается осевым цилиндром и ретроградно транспортируется по аксону к телу клетки, что позволяет локализовать тела иннервирующих данную структуру нейронов. Продукт реакции не виден светооптически в терминалях, но хорошо заметен в телах нейронов в виде вторичных лизосом [106].

14.2. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ТРЕЙСЕРЫ

Вещества, используемые в качестве Тр, можно разделить на три класса: 1) небольшие неорганические молекулы в виде истинных растворов; 2) коллоиды; 3) крупные органические молекулы. Большинство Тр имеет заряд на своей поверхности, что нередко затрудняет их транспорт через тканевые каналы и усиливает тенденции к связыванию с поверхностями клеток и неклеточных структур.
В зависимости от токсичности все имеющиеся Тр можно разделить на пригодные для использования либо in vivo, либо в процессе фиксации [113, 325].
В качестве Тр могут служить следующие субстанции: естественные частицы (ферритин, гликоген), искусственные частицы (декстран, коллоидный уголь, КЗ, коллоидный лантан), ферменты (ПХ, различные гемопротеины), неорганические молекулы (нитрат лантана, рутениевый красный) и др. Их молекулярная масса варьирует от 15 тыс. до 240 тыс.
Проницаемость сосудов можно оценивать с помощью фильтрации антигенов (белков). При этом животному вводится специальный белок, который затем детектируется антителом. Ниже приведены молекулярные массы некоторых Тр:

Микропероксидаза	1900	Лактопероксидаза быка	82000
Цитохром С	12000	Миелопероксидаза человека	160000
Пероксидаза хрена	40000	Каталаза из печени коровы	240000
Бычий гемолобин	64500	Ферритин	500000

Диаметр Тр колеблется от 2 до 300 нм и более (например, микропероксидаза 2 нм, ПХ 45 нм, ферритин 11 нм, КЗ 1-40 нм, гранулы серебра 100-300 нм).

14.2.1. Частицы

Ферритин - это белок, содержащий железо. Его молекулярная масса колеблется от 46 тыс. до 75 тыс. Каждая молекула содержит 2000-3000 атомов железа. Ферритин может использоваться как в нативной, так и в катионизированной форме. Молекула нативного ферритина со средним диаметром 9.4 нм содержит до 40 % гидроокиси железа, располагающейся в центре молекулы в виде электронно-плотного ядра диаметром 55 нм. Катионизированный ферритин несет положительный заряд и поэтому связывается с отрицательно заряженными участками клеточной поверхности. Натив-ный ферритин в большинстве случаев поглощается клетками с помощью жидкофазного эндоцитоза.

14.2.2. Кристаллоиды

Рутениевый красный (РК) также может использоваться в качестве Тр. Молекула РК имеет диаметр 1.13 нм.
Лантан имеет атомный номер 57 и характеризуется значительной электронной плотностью в ТЭМ. Нитрат лантана образует трехвалентный катион, который связывается с отрицательно заряженными участками клеточной поверхности, особенно с соответствующими областями гликопротеинов. При повышении рН до 7.81 раствор гидроокиси лантана образует коллоидную суспензию, которая часто используется в качестве Тр (см. ниже).
Нитрат лантана и РК, проникая между внутримембранными частицами, метят щелевые контакты и используются в виде смесей с фиксирующими растворами (1-2 % нитрата лантана или 0.05-0.08 % РК) и как добавка к промывочным растворам. Растворы РК готовят в темноте [113, 215, 325].

14.2.3. Ферменты

Энзиматические Тр широко применяются для изучения проницаемости физиологических барьеров и переноса веществ в пределах внутри- и внеклеточного пространства. Однако при этом энзиматические Тр в используемых концентрациях не должны вызывать изменений в объеме крови, артериальном и коллоидно-осмотическом давлении.
ПХ представляет собой молекулу фермента с молекулярной массой около 40 тыс. Ее используют для изучения проницаемости физиологических барьеров. В качестве Тр можно использовать ПХ, конъюгированную с КЗ. ПХ обнаруживает значительную аффинность к гликокаликсу эндотелиальных клеток. Эффект значительно возрастает, если предварительно фиксировать ткань альдегидами (см. Приложение, 14.1). ПХ обычно вводят внутривенно. Лучше всего использовать ПХ IV типа (Sigma) или ПХ, очищенную элек-трофоретически. При исследовании с ее помощью сосудистой проницаемости на животных предпочтительны малые дозы (10 мг на 1 кг массы тела). В случае применения ПХ фирмы Reanal (Венгрия) наиболее оптимальной является доза в 20-30 мг на 100 г массы животного. При этом весь белок лучше растворить в объеме физиологического раствора (или раствора Хэнкса), не превышающем 05 мл. Время фиксации в ГА не должно превышать 15-2 ч.
Для визуализации пероксидазы в ТЭМ применяют обычные реакции для выявления ПХ с ДАБ и перекисью водорода, продукты реакции которых дополнительно осмируют с помощью ЧО. Чаще всего выявление ПХ проводят по методу Грэм и Карновски [159]. Продуктом гистохимической реакции является окисленный ДАБ, который легко детектируется в СМ, а после обработки с помощью ЧО - и в ЭМ. Этот хромоген представляет собой полимер, он гомогенен, осмиофилен, нерастворим в дегидратантах и в заливочных средах. Предложено довольно много новых хромогенов для выявления ПХ, но не все они применимы в ЭМ. Некоторые хромогены, хотя и отличаются большей чувствительностью, лишены многих из указанных качеств.
Проведение ферментативной реакции на ПХ при рН 7.6 сопровождается значительным числом неспецифических реакций, а при рН 5.6 неспецифические отложения практически отсутствуют. Оптимальным для выявления пероксидазной активности является рН 4.3, однако после фиксации в ГА этот оптимум сдвигается с 4 до 7. Введение в инкубационную среду нитрогенных лигандов, например имидазола (до 0.1 М), увеличивает ферментативную активность и ПХ (почти в 2 раза), и микропероксидазы, но не влияет на активность цитохрома С. В случае микропероксидазы хороший эффект получен при добавлении диаминопиримидина. Имеются способы выявления активности пероксидазы на залитых в эпоксидную смолу срезах [113, 215].
Продолжительность инкубации в полной инкубационной среде может достигать 2 ч (t=37®С), при этом среду меняют каждый час. Для улучшения выявления ПХ можно рекомендовать преинкубацию (30-60 мин) объектов в среде без добавления перекиси водорода.
Молекулы микропероксидазы с различной молекулярной массой диффундируют в интерстициальном пространстве очень быстро, поэтому желательно подобрать такой временной интервал от введения фермента в кровоток до взятия материала, чтобы была заметна разница в концентрации между просветом микрососудов и интерстицием. Следует учитывать, что коммерческие препараты микропероксидазы в ряде случаев могут быть слегка загрязнены, а фиксация микропероксидазы с помощью ГА вызывает образование относительно широкого спектра сополимеров с высокой молекулярной массой. Моноциты человека при инкубации с микропе-роксидазой не обнаруживают повреждений.
Для олигопептидов (микропероксидазы) оптимум рН варьирует от 12.0 (для Н8Р) до 135 (для НИР). Обычно же используют инкубационную среду с рН 7.0-7.2 и 8.6-9.0 соответственно. Для нативной ПХ оптимум рН составляет 4.3. Во время фиксации с помощью ГА рН сдвигается в нейтральную область для Н8Р и ПХ (до 7.0), но остается высоким для НИР (см. Приложение, 14.2).
Наиболее удачные модификации инкубационной среды Грэм и Карновски [159] включают замену Трис-буфера или ФБ на 0.1 М КБ (рН 7.1-7.4), который применяется также для растворения фиксатора и для промывания объектов [106J.
Микропероксидаза хорошо переносится плазмой; в отличие от нее ПХ при внутривенном введении не связывается с сывороточными протеинами.
Лактопероксидаза - это Тр с молекулярной массой 100 тыс., используемый изредка для демонстрации жидкофазного эндоцитоза.

14.2.4. Коллоидные растворы

Для изучения проницаемости используется коллоидный уголь (взвесь микрочастиц угля - черная тушь), который благодаря низкой токсичности можно вводить в больших количествах (до 0.5 мл на 100 г массы). Оптимальная доза 0.15-0.2 мл на 100 г. Частицы туши хорошо видны в ЭМ. Отрицательным свойством коллоидного угля является его способность агрегировать белки плазмы и клетки крови. Для уменьшения токсичности пробирку с тушью рекомендуется в течение 15-20 мин прогреть при температуре 50-60®С, затем охладить и подвергнуть центрифугированию при 7000-8000 об./мин в течение 20-30 мин. Пользоваться желательно лишь поверхностными слоями жидкости.
Коллоидный лантан проходит через межклеточные щели и некоторые специализированные межклеточные соединения (щелевой и промежуточный контакты и десмосомы). Однако плотные контакты в нормальном состоянии блокируют его прохождение. Сходным образом действует коллоидный никель, который хорошо маркирует плотные контакты (см. Приложение, 14.3 и 14.4). Коллоидный рутений может использоваться как Тр в тех же случаях, что и коллоидный лантан. При обработке ЧО он образует четырех-окись рутения, которая хорошо видна в ЭМ [113, 215, 325].
В последние годы в качестве Тр более широко стали применять КЗ, в частности для исследования экзо- и эндоцитоза и т.п. [235]. Для этих целей можно использовать также альбумин, конъюгиро-ванный с КЗ. Альбумин является стабилизатором частиц КЗ. Конъюгаты КЗ с белком могут использоваться при исследовании ретроградного нейронального транспорта. Для этого раствор инъецируют в осевые цилиндры или в нервную ткань.

14.3. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА

Использование Тр, особенно энзиматических, имеет ряд ограничений: 1) введенные молекулы выявляются непрямым способом, т.е. посредством многоступенчатой гистохимической реакции; 2) из-за амплификационного эффекта возникает несоответствие между выраженностью реакции и числом проникающих молекул фермента; 3) невозможна количественная оценка реакции; 4) при введении ПХ и цитохрома С в системный кровоток лабораторных животных часто возникает побочный повреждающий эффект.
ПХ, цитохром С и миоглобин обусловливают системные изменения в организме: при внутривенном введении приводят к повреждению посткапиллярных венул и открытию плотных межэндотелиальных контактов в связи с гистаминмедиированным эффектом. При введении в кровоток ПХ увеличивает проницаемость кровеносных сосудов, вызывает дегрануляцию тучных клеток, а иногда - анафилактические реакции. В ряде случаев инкубация клеток с ПХ или с цитохромом С in vitro вызывает их гибель.
Необходимо выполнять ряд предосторожностей (см.: [325], табл. Simionescu et al.) и знать природу как изучаемых тканей, так и возникающих системных осложнений. Например, системный побочный эффект ПХ зависит от используемой концентрации и от степени чистоты коммерческого препарата. Так, 10^-4 М ПХ не вызывает повышения проницаемости, а 10^-3 М вызывает. Изменения в объеме крови, артериальном и коллоидно-осмотическом давлении могут быть уменьшены с помощью подбора концентраций и объемов инъецируемых Тр или введения блокаторов гистамина. Для уменьшения повреждающего действия ПХ на эндотелий сосудов за 30 мин до введения ПХ следует внутрибрюшинно инъецировать раствор, содержащий 80 мг ацетилсалициловой кислоты в 0.2 мл стерильной воды.
Мыши довольно резистентны к стимуляции тучных клеток с помощью ПХ, крысы очень чувствительны. Выведены специальные линии крыс (Wistar-Furth), которые известны как генетически резистентные к веществам, высвобождающим гистамин. Имеются специальные особо устойчивые к ПХ линии мышей (например, СЗНеВ) [106].
В большинстве исследований время циркуляции Тр в крови не превышает 10 мин. Это обусловлено их быстрым выведением из кровотока и связыванием с белками плазмы крови. Например, при введении в кровоток микропероксидаза уже через 10 мин связывается с протеинами плазмы на 12-16 %, а через 2 ч - на 50-100 %. Микропероксидаза после введения в кровь остается в мономерном состоянии не более 10 мин, а затем связывается с белками крови.
Наличие диффузии фермента или продукта его реакции в тканях может быть проверено с помощью контрольного эксперимента, в котором фермент добавляют к фиксирующему раствору или к инкубационной среде.
Уже сделаны первые шаги по внедрению методов количественной оценки трейсерных экспериментов с помощью измерения оптической плотности различных участков УС, а также по использованию двух и более маркеров, например вначале вводят в кровоток ферритин, а затем ПХ, либо сначала - катионизированный ферритин (см. Приложение, 14.5), а потом ПХ [6, 113, 215, 325].
Глава 15 МЕТОД РЕПЛИК

В ряде случаев при исследовании биологических препаратов, которые разрушаются под действием электронного пучка или по другим причинам, оказывается целесообразным изучать не сам объект, а слепок его поверхности - реплику. Для увеличения контрастности реплики необходимо оттенять электронно-плотным веществом (обычно металлами). Одна из разновидностей данного метода - получение реплик с предварительно оттененного препарата - наиболее широко используется в биологии и позволяет наблюдать структуру оттеняемой поверхности. Метод реплик в ТЭМ имеет обычно большее разрешение (2-3 нм), чем обычный метод СЭМ. Поэтому он используется для визуализации (часто после их мечения) тонких структур на поверхности образца [9, 43, 287, 330]. Для этого метят макромолекулы на поверхности монослоя клеток (обычно после фиксации), затем препарат высушивают, напыляют и исследуют в СМ, после этого объекты растворяют и очищенную реплику анализируют в ТЭМ. Клеточный монослой можно также заморозить, лиофилизировать и реплицировать, а затем изучать реплики наружной поверхности клеток.

15.1. ИЗГОТОВЛЕНИЕ РЕПЛИК

Существуют одноступенчатый и двухступенчатый методы изготовления реплик. В первом случае исследуемый объект покрывают повторяющим рельеф поверхности слоем вещества, который после отделения образует реплику. При двухступенчатом методе с объекта первоначально делают так называемый промежуточный отпечаток, с которого затем снимают вторичную реплику. Разрешающая способность реплик, изготовленных по двухступенчатой методике, достаточно низка и составляет примерно 7.5-10 нм.
При изготовлении реплик одноступенчатым методом используют формвар или коллодий (если не требуется высокое разрешение) либо напыленные в вакууме слои углерода или кварца (если необходимо изготовить реплики с высоким разрешением).
При двухступенчатой методике промежуточный отпечаток изготавливается в виде прочной пленки, легко выдерживающей механическое отдирание. Материал конечной реплики не должен разрушаться в растворителе, предназначенном для получения промежуточного отпечатка. При изготовлении отпечатка из желатины на поверхность объекта наносят ее раствор в теплом виде слоем в 2-3 мм. Когда этот слой полностью высыхает, его толщина составляет 1 мм и он часто сам отделяется от образца.
Обычная процедура изготовления реплик следующая: на поверхность образца наносится тонкий слой 1%-ного раствора коллодия (целлоидина) в амилацетате. После высушивания поверхность покрывается еще несколькими слоями 2%-ного целлоидина. Пленку осторожно снимают (можно с помощью скотча) и высушивают. Та поверхность пленки, которая соприкасалась с образцом, напыляется платиной (обычно под острым углом) и углеродом (перпендикулярно поверхности). Пленку помещают на поверхность хлороформа напыленной стороной вверх для растворения целлоидина, затем реплику вылавливают и высушивают. Если реплики (коллодиевые или формваровые) используют без оттенения, то их разрешение и контрастность неудовлетворительны.
В ряде случаев электронно-плотный материал (металл) напыляют непосредственно на исследуемый объект. Затем наносят слой углерода для образования углеродной пленки, т.е. с предварительно оттененного препарата получают предварительно оттененную реплику. Поскольку углеродная пленка несет на себе лишь слой оттеняющего металла, то этот метод иногда называют методом "переноса теней".
Значительно реже оттенение производится поверх нанесенного слоя углерода (или окиси кремния и др.). Этот вариант иногда применяют, если угольно-металлическая пленка плохо отстает от исследуемой поверхности. Углеродная пленка отделяется легче. Реже практикуется оттенение одноступенчатой реплики с той стороны, которая была в контакте с образцом. Такое оттенение создает негативное изображение поверхности. В случае двухступенчатых реплик производится оттенение со стороны, которая была в контакте с промежуточным отпечатком [9, 43, 287, 330].

15.2. ВЕЩЕСТВА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ НАПЫЛЕНИЯ

Металлы и вещества, используемые для напыления, должны обладать следующими свойствами: 1) большой электронной плотностью; 2) небольшой величиной зерна; 3) отсутствием грануляции металла под воздействием электронного пучка; 4) химической стойкостью; 5) легкостью испарения.
В биологических исследованиях чаще всего используют платину, палладий и сплав платины с палладием. Недостатком платины является то, что она сплавляется с вольфрамом, это затрудняет ее испарение. Для уменьшения величины зерна рекомендуется осуществлять одновременное испарение платины и углерода. В качестве электродов применяют углеродные стержни диаметром 25 мм, содержащие платину. Для этой цели обычный графитовый стержень протачивают с одного конца до диаметра 2 мм. В сточенном участке просверливают отверстие длиной 2 мм и диаметром 1 мм, в которое вставляют платиновую проволоку. Электрод устанавливают так, чтобы был контакт с плоским торцом обычного угольного стержня. При пропускании тока происходит одновременное испарение углерода и платины. Состав напыленной пленки можно регулировать изменением размеров углеродного электрода и количества платины.
Иногда вместо углеродно-платиновых электродов применяют смесь платины и кварца. Для этого порошок платиновой черни смешивают с порошком кварца (платина составляет 80 % но массе), прессуют в таблетки и помещают для испарения в коническую вольфрамовую спираль. Достаточно мелкогранулярные покрытия получаются при испарении жаростойких металлов: вольфрама, ниобия, тантала [9, 43, 287, 330].

15.3. ПОЛУЧЕНИЕ ПЛЕНОК ИСПАРЕНИЕМ ВЕЩЕСТВ В ВАКУУМЕ

Если под некоторым углом к направлению пучка распыляемых частиц поместить исследуемый объект, то на его поверхности будет осаждаться слой металла различной толщины. На участках поверхности, расположенных перпендикулярно к направлению полета частиц, образуется наиболее толстый слой. В тех местах, где объект будет экранировать пучок частиц, возникают "тени". Угол между направлением распыляемых частиц и поверхностью объекга называется "углом оттенения" (рис. 34).
При выборе угла оттенения руководствуются главным образом профилем объекта и его размерами. При оттенении небольших структур существенное искажение их размеров может произойти в результате накопления оттеняющего металла на стороне объекта, обращенной к испарителю.

0x01 graphic

Рис. 34. Определение параметров реплики на основании характеристик тени. 1 - длина тени; 2 - источник напыления; а - угол оттенения.

Для того чтобы обеспечить необходимую контрастность изображения и высокую механическую прочность, реплики обычно делают из двух слоев: напыленного под некоторым углом слоя металла, обеспечивающего отображение рельефа, и несущей этот слой пленки из аморфного вещества с низкой электронной плотностью и достаточно высокой стойкостью к воздействию электронного пучка (чаще всего это углерод).

15.3.1. Испарение углерода

Углерод легко испаряется при пропускании электрического тока через два угольных электрода. В месте контакта двух графитовых стержней электрическое сопротивление максимально. Именно здесь выделяется наибольшее количество тепла, происходит интенсивный нагрев и испарение графита. Электроды прижимаются друг к другу с помощью пружины. Объект помещают на расстоянии 8-10 см от места контакта стержней (рис. 35, А и Б). Напыление углерода производится перпендикулярно к поверхности образца (обычно используют специальные графитовые стержни). При этом важно правильно подобрать величину тока и длительность напыления.
В ряде случаев испарение углерода осуществляется из специальной угольной тесьмы. Углерод, из которого образованы углеродные нити тесьмы, легко испаряется и соответственно требуется меньший электрический ток.
Можно получить углеродные пленки при плазменной полимеризации паров нафталина на поверхности объекта. Для этого пары нафталина впускают в вакуумную камеру и несколько секунд подвергают воздействию высоковольтного разряда. Последний вызывает полимеризацию газа в виде тонкой пленки на поверхности объекта (см. Приложение, 15).

15.3.2. Методы распыления других веществ

Для распыления в вакууме других веществ и прежде всего металлов разработаны следующие способы (рис. 35).
Распыление с помощью нагревания вольфрамовой проволоки. Согнутый в виде скобки небольшой кусок проволоки или полоски металла, подлежащего испарению, помещают на V-образную вольфрамовую проволоку в месте ее перегиба. После достижения необходимого вакуума нить раскаляют электрическим током, металл расплавляется и, образовав каплю, испаряется (рис. 35, В).
Металл, который реагирует с материалом нити, при нагревании вызывает ее перегорание, поэтому для его испарения приходится пользоваться специальными приемами. Например, для испарения веществ, сплавляющихся с вольфрамом, применяют вольфрамовую проволоку большого диаметра (более 1 мм).
Вольфрамовая спираль может быть изготовлена в форме конуса, для того чтобы удерживать порошок или металлические стружки. В последнем случае испаряемое вещество в виде гранул или кусочков помещают в "корзиночку", образуемую спиралью, через которую пропускают электрический ток (рис. 35, Г).
Распыление с помощью электронно-лучевой пушки. Процесс эмиссии и ускорения электронов в этом случае сходен с таковым в электронной пушке ЭМ. Ускоряемые электрическим полем электроны бомбардируют анод, представляющий собой испаряемый металл. Хотя данная процедура сложнее и дороже, чем обычный метод испарения в электрическом разряде, зато она позволяет получать реплики с наиболее высоким разрешением (рис. 35, Е).

0x01 graphic

Рис. 35. Приспособления для испарения электронно-плотных металлов и графита
в вакууме.
А и Б - графитовые электроды разной формы; В - V-образная вольфрамовая проволока; Г - вольфрамовая спираль; Д - вольфрамовая ванночка (вид сбоку и сверху); Е - электронная пушка (схема): вольфрамовая спираль-катод (1), закрученная вокруг графитового электрода (2) с вставленным в него платиновым стержнем (3); Ж - испарение металлической проволоки (4), закрученной вокруг графитового стержня (5).

Катодное распыление. Инертный газ, например аргон, ионизируется в присутствии электрического поля высокого напряжения, и положительные ионы используются для бомбардировки металлической мишени. Для фокусировки пучка применяют примитивные электромагнитные линзы. Под действием ионов аргона из металлической мишени выбиваются частицы металла, которые оседают на поверхности образца, образуя металлическую пленку. Данные установки не выделяют большого количества тепла и соответственно не повреждают образец. Они обычно используются при исследованиях, требующих высокого разрешения [9, 43, 287, 330].

15.3.3. Процессы, происходящие во время напыления

Атомы металлов, падающие на подложку, склонны к агрегированию. Величина агрегатов зависит от природы атомов и поверхности подложки. Явление декорирования подложек представляет собой результат вторичного перераспределения атомов металла после их осаждения на напыляемой поверхности и зависит в основном от заряда поверхности. Загрязняющие вакуум молекулы (пары масел, резиновых уплотнений и др.) также будут центрами агрегирования.
Атом, который осаждается на поверхности, становится центром нуклеации последующих. Если интенсивность напыления повышается, то число центров возрастает, следовательно, покрытие будет более мелкогранулярным. Уменьшение расстояния между образцом и мишенью приводит вследствие этого к снижению гранулярности образующейся пленки. Однако в этом случае объект нагревается значительно больше.

15.3.4. Измерение толщины пленок

Толщину реплик можно определить экспериментально с помощью интерферометра или электронного денситометра. Толщину образующейся пленки распыляемого вещества (Г) можно вычислить по следующей формуле:

где W - масса распыляемого вещества в г, ? - угол наклона напыления, R - расстояние между препаратом и распыляемым веществом, ? - плотность вещества, k - коэффициент (обычно принимается равным 1). Толщина пленки контролируется визуально или с помощью специальных "толщиномеров". В первом случае рядом с пластинкой, на которую напыляется углерод или другое вещество, помещают белую фарфоровую пластинку или стекло (с кусочком белой бумаги под ним). На них наносят небольшую каплю диффузионного масла. Масло предотвращает образование в этом месте углеродной или металлической пленки и формирует область белого фона, которую можно сравнить с расположенной рядом углеродной или металлической пленкой. Разница в окраске позволяет судить о толщине пленки. В тот момент, когда пластинка приобретает легкий рыжевато-коричневый цвет, толщина пленки составляет 4-7 нм. Появление видимой контрастности между покрытым маслом участком и остальной поверхностью пленки соответствует ее толщине, равной приблизительно 10 нм. Светло-серый цвет пленки свидетельствует о толщине в 5 нм [9, 43, 287, 330].

15.3.5. Процедура получения реплик

В большинстве случаев сухие объекты помещают в вакуумную камеру, вакуум доводят до 10^-4 Па. Платину напыляют под углом 45®. Затем под углом 90® напыляют углерод. Далее объекты извлекают, лезвием бритвы разрезают поверхность реплики на квадраты 2 х 2 см и снимают на воду (см. гл. 7). Если реплика не снимается, то надо объект обработать плавиковой кислотой. Иногда достаточно использовать липкую ленту, которую наклеивают на реплику. Затем липкую ленту растворяют хлороформом. Небольшие квадратики реплик проводят через нескольких смен хлороформа и помещают в чистый органический растворитель. После этого реплику переносят на несколько часов на поверхность раствора гипохлори-та натрия, а затем 50%-ной хромовой кислоты. Эти растворители, как правило, удаляют объект. Иногда требуется обработка реплик дополнительными растворителями или ферментами. Полностью очищенные реплики промывают в четырех сменах бидистиллированной воды, монтируют на сеточки и высушивают [9, 43, 287, 330].

15.3.6. Анализ изображений

Анализировать реплики следует при больших увеличениях ЭМ. Измерив длину (L) тени и зная угол оттенения (?), можно определить высоту поверхностной структуры или толщину объекта:

Для сферической или цилиндрической частицы радиус (R) определяется по формуле:

Для небольших углов оттенения можно использовать следующую формулу:

где D - диаметр частицы.

15.3.7. Ротационное оттенение объектов

При обычном оттенении объект и испаритель неподвижны по отношению друг к другу, при ротационном - объект во время испарения вращается. Последний способ используется для оттенения небольших макромолекул. При этом объект оттеняется со всех сторон, что позволяет выявить наибольшее количество деталей.

15.4. РЕПЛИКИ МАКРОМОЛЕКУЛ

Приготовление реплик макромолекул лучше всего осуществлять на свежерасщепленной слюде с помощью напыления вольфрама, ниобия, тантала и др. Для этого вначале проводят диализ раствора макромолекул против раствора летучих веществ (ацетат аммония, гидроокись аммония, уксусная кислота и др.), затем разводят его до оптимальной концентрации. Полученный раствор распыляют на пластинку слюды так, чтобы верхний конец пластинки смачивался сильнее (для создания градиента плотности фракций). Затем пластинку помещают в вакуумную установку, напыляют металлом под острым углом (около 10) и углеродом перпендикулярно поверхности слюды при постоянном вращении объекта. Для снятия реплики используют раствор нитроцеллюлозы, который наносят на препарат, подсушивают и снимают. Полученные реплики разрезают на более мелкие части, которые помещают на сеточки. Слой нитроцеллюлозы затем удаляют растворителем [9, 43, 100, 287, 330].
Глава 16 ЗАМОРАЖИВАНИЕ-СКАЛЫВАНИЕ-ТРАВЛЕНИЕ

Метод замораживания-скалывания-травления включает три обязательные процедуры: 1) быстрое замораживание; 2) раскалывание в замороженном состоянии; 3) изготовление реплик (как правило, углеродно-металлических) со сколотых поверхностей. В связи с тем что не всегда удается достигнуть нужных скоростей замораживания, в непрецизионных экспериментах объект префиксируют в альдегиде [21, 32, 152, 187, 347].

16.1. ЭТАПЫ ПРЕПАРИРОВАНИЯ

Раскалывание объектов может осуществляться в различных условиях: 1) в вакууме, в том числе в сверхвысоком; 2) под сжиженным азотом; 3) в атмосфере сухого газа [32]. Вскрытие поверхностей осуществляется двумя путями: разрывом и скалыванием с помощью ножа. В первом случае формируются две комплементарные поверхности. Этот способ оказался полезен для исследования монослойных культур и суспензий однородных по размеру сферических частиц (рис. 36).

0x01 graphic

Рис. 36. Скалывание замороженного монослоя культуральных клеток, выращенных на миллипоровом фильтре, с помощью сандвич-метода.
1 - клетки; 2 - миллипоровый фильтр; 3 - пленка поливинилового спирта; 4 - золотой держатель; 5 - пластинка слюды.

Раскалывание объекта ножом получило наибольшее распространение, поскольку имеет ряд преимуществ по сравнению с разрывом. Среднее направление скола задается направлением движения ножа, поверхность скола может быть сформирована в любом месте объекта. Качество получаемых при этом реплик в большинстве случаев выше, чем при разрыве, особенно при использовании специальной микротомной техники.
Когда суспензия клеток подвергается замораживанию-скалыванию обычным способом, скол идет случайным образом, что не , позволяет проводить количественный анализ структурных изменений биологических мембран, в частности распределение внутри-мембранных частиц (ВМЧ). Эти ограничения можно преодолеть, если сформировать монослой клеток на положительно заряженной поверхности. Поскольку последняя является достаточно плоской, то получаемые реплики имеют слабо выраженный рельеф и более удобны для анализа.
Разработан достаточно надежный метод скалывания монослойных клеточных культур (рис. 36). Клетки выращивают на миллипоровом фильтре. Кусочек фильтра помещают на золотой держатель, покрытый тонким слоем поливинилового спирта, клетками наружу. Сверху наливают еще один слой поливинилового спирта, на который кладут пластинку свежеотщепленной слюды. Полученную систему замораживают в тающем азоте и помещают в аппарат для замораживания-скалывания (Balzers BAF 400Т). Нож подводят под слюду и поднимают, что приводит к разрыву объекта. Причем линия скола, как правило, проходит по клеточному монослою. Далее следует обычная процедура репликации [347].
Вместе с тем нож при своем движении может касаться поверхности формирующегося скола и вызывать изменения его структуры как в результате чисто механического воздействия, так и разогрева. Быстрое разрушение кромки ножа, ведущее к увеличению количества артефактов, накладывает определенные ограничения на число повторных сколов с поверхности замороженного объекта, поэтому сейчас предпочитают конструкции с двумя лезвиями. Стружки, образующиеся в результате повторных скалываний, также ухудшают качество формирующейся поверхности, загрязняя ее. К сожалению, метод раскалывания ножом позволяет исследовать лишь одну поверхность, а в ряде случаев для адекватной интерпретации необходимы комплементарные поверхности.
При использовании установок, оснащенных микротомами, замороженный объект переносят под защитой холодового экрана в вакуумную камеру и монтируют на предварительно охлажденный предметный столик. Скол производится в условиях высокого вакуума с помощью металлического ножа, смонтированного на микротоме, который имеет приспособления как для механической, так и для термической подачи. Резание (скалывание) осуществляется при любой температуре образца вплоть до -183®С. Реплику наносят на плоскость разлома либо немедленно после последнего скалывания, либо через определенный период времени, необходимый для травления. Такого рода конструкция реализуется в большинстве существующих в настоящее время аппаратов. Разница заключается лишь в некоторых деталях конструкции, например в наличии возвратно-поступательного движения ножа или двух ножей (для предварительного и окончательного скалывания).
К примеру, в рабочей камере модели BAF-301 на охлажденном столике помещается замороженный образец и под контролем микроскопа с помощью микротома осуществляется скол объекта. Охлажденный нож микротома совершает при скалывании круговое движение. После этого производится травление сколотой поверхности, глубина которого подбирается эмпирически. Подробнее с различными конструкциями фирменных и лабораторных установок для замораживания-скалывания можно ознакомиться в специально посвященных этому вопросу монографиях и обзорных статьях [21, 32, 75, 152, 187, 347].
Оттенение поверхности скола осуществляется или сразу после ее обнажения (метод замораживания-скалывания), или после проведения некоторых дополнительных операций. Наиболее распространенной из этих операций является сублимация (см. гл. 18) льда с поверхности скола, называемая "травлением". Скорость травления зависит от температуры образца и при -110, -100, -90, -80 и -70®С составляет соответственно 0.2, 1.5, 10, 50 и 250 нм/с при вакууме порядка Зх10^-5 Па. Давление в вакуумной камере должно быть ниже давления насыщающих паров воды. Достигнуть таких условий можно с помощью низкотемпературных вымораживающих ловушек, располагающихся в непосредственной близости от поверхности скола. Эффективность ловушек повышается по мере приближения этих приспособлений к объекту и с понижением их собственной температуры. В установках фирмы "Balzers", снабженных замораживающим микротомом Мура, в качестве ловушки используется нож микротома, который имеет температуру около -185®С и может быть приближен к поверхности скола на расстояние до нескольких микрометров.
Заключительным этапом, общим для всех модификаций метода замораживания-скалывания-травления, является изготовление реплики. Визуализация деталей поверхности скола осуществляется путем их оттенения тяжелым металлом (см. гл. 15). Слой металла обычно чрезвычайно тонок и механически непрочен. Перпендикулярно к поверхности скола напыляют слой углерода или другого материала, обладающего достаточной прочностью и малой электронной плотностью. Второй слой закрепляет первый, информационный слой и придает всей реплике механическую прочность (см.гл.15). Разрешающая способность метода замораживания-скалывания-травления составляет примерно 2 нм [21, 32, 75, 152, 187,347].

16.1.1. Очистка реплик

После изготовления реплики объект размораживают и извлекают из вакуумной камеры. Реплику очищают от объекта путем его растворения в подходящем растворителе. Для этого используют различные окислители (чаще всего 5%-ный гипохлорит натрия, кислоты, например H₂SO₄и хромовую кислоту, щелочи и некоторые другие вещества). Есть специальные фирменные реактивы для этих целей, например "Хлорокс". При их отсутствии применимы хлорсодержащие бытовые отбеливатели. Главное в этой процедуре - хорошее растворение тканей и максимальная сохранность реплики.
Лучшие результаты дает последовательное отмывание реплики в ряде различных растворителей. Если ткань содержит много жировой клетчатки, то на первом этапе отмывания удобно использовать смесь спирта и эфира, смесь хлороформа и метанола (2 : 1) или диметилформальдёгид.
После вскрытия вакуумной камеры объект с держателем помещают в тот раствор, из которого объекты были взяты для замораживания. Ткань и реплика обычно отделяются от держателя и плавают на поверхности раствора. С помощью платиновой петли объект проводят с 2-минутными интервалами через 30, 20, 10 и 5%-ный растворы глицерина и отмывают (он плавает на поверхности) в воде. Объекты можно затем (или сразу же после взятия из камеры) погрузить в хромпик или раствор гипо-хлорита. После трех смен воды объект помещают в 2%-ный раствор гипохлорита натрия (или в 20%-ный отбеливатель) на 30 мин. Нельзя пользоваться концентрированным раствором, поскольку образующиеся пузырьки газа разрушают реплики. Далее реплики очищают в трех сменах неразбавленного отбеливателя или гипохлорита (по 20 мин) и проводят через ряд растворов с уменьшающейся концентраций окислителя вплоть до воды. После нескольких смен воды реплики обрабатывают хромовой кислотой при увеличивающихся ее концентрациях (10, 20 и 30%-ный растворы, по 10 мин в каждом) и тремя порциями концентрированной хромовой кислоты (по 20 мин). Далее реплики отмывают в 6-10 сменах воды (по 1-5 мин) для удаления остатков хромовой кислоты. Чистые реплики вылавливают на опорные сеточки, так же как это принято делать с УС (см. гл. 7).
Удовлетворительная реплика должна обладать следующими свойствами: 1) мелкогранулярность (разрешение по точкам лучше 3 нм) и стабильность оттеняющего материала; 2) достаточная контрастность реплик; 3) хорошее совпадение комплементарных поверхностей мембран; 4) рандомизированный характер распределения ВМЧ на гладких сколах мембраны с мелкогранулярной текстурой поверхности (отсутствие "волн" и других артефактов). Бугристость поверхности реплики в месте прохождения ножа свидетельствует о загрязнении ее парами воды. Качество изображения реплики, получаемой при неблагоприятном угле оттенения, может быть улучшено путем наклона сеточки с репликой в ТЭМ. В этом случае следует использовать гониометрическую приставку [21, 32, 75, 152, 187, 347].

16.2. МЕМБРАННЫЕ ПОВЕРХНОСТИ

В соответствии с современной номенклатурой выявляемые при сколах мембран поверхности именуются PF (protoplasmic face) и EF (extracellular face). В результате вакуумного травления можно выявить две истинные поверхности: экстрацеллюлярную и про-топлазматическую. В соответствии с действующей номенклатурой, поверхность любой биологической мембраны, обращенная к цитоплазме, обозначается символами PS (protoplasmic surface), комплементарная ей поверхность (extracellular surface) обозначается ES. Для оценки получаемых изображений можно использовать математические методы анализа [32,197].

16.3. СОЧЕТАНИЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ-СКАЛЫВАНИЯ С ДРУГИМИ МЕТОДАМИ АНАЛИЗА

16.3.1. Иммуноцитохимический анализ и использование лектинов

Традиционные метки (ферритин, гемоцианин и др.) при использовании замораживания-скалывания оказались непригодными, поскольку их очень трудно идентифицировать на репликах и отличить от ВМЧ. Кроме того, если ферритин не оттенен, то на реплике он практически не виден. Наибольшее применение получило КЗ [62, 102].
Мечение тканевых и клеточных компонентов во время замораживания-скалывания может быть проведено на следующих этапах: 1) перед замораживанием; 2) сразу после скалывания (перед напылением платиной); 3) сразу после напыления платиной; 4) после окончания процедуры репликации.
В первом случае изолированные клетки метят лектинами или антителами, конъюгированными с КЗ или ферритином. В принципе возможно проведение двух и трехэтапного мечения. Затем после замораживания и скалывания проводится глубокое травление, что обусловливает обнажение Е-поверхности плазмалеммы с адгезированным на ней маркером ниже плоскости скола. Далее осуществляется репликация. Чтобы уберечь частицы КЗ от оттенения платиной, можно использовать метод "мечения-заморажива-ния" (lable-fracture). После обработки клеток или тканей лиганда-ми, связанными с КЗ, проводят замораживание-раскалывание-оттенение. Объект не растворяют, а интенсивно и многократно промывают водой. Анализируют в этом случае только EF-поверхность реплики. При этом метка наружной поверхности плазма-леммы "просвечивает" сквозь реплику. В принципе можно также выявить метку сквозь реплику Р-поверхности скола вместе с телом всей клетки. Однако это удается в крайне редких случаях. Исследования с использованием стереопар показали, что частицы золота находятся на наружной стороне мембраны. Эта методика имеет существенные ограничения, поскольку спектр ее применения ограничивается субклеточными фракциями, клеточными культурами, взвесями или апикальными плазмалеммами клеток, выстилающих полые органы.
Мечение можно проводить после вскрытия клеток с помощью гипотонического раствора или другими способами (см. гл. 17), что дает возможность метить внутренние структуры, а затем исследовать отношение метки к интегральным структурам мембран. Для мечения внутриклеточных структур перед замораживанием-скалыванием клетки разрывают с помощью осмотического шока. Для иммуномечения мембран, остающихся на реплике после промывания в воде (метод "мечение после скалывания"), реплики инкубируют с первыми антителами, затем промывают и инкубируют с комплексом вторых антител с КЗ, вновь промывают и высушивают. Иммуномечение цитоскелетных белков клетки осуществляют обычно после их обработки детергентами, например раствором Тритона Х-100 [32, 75, 152, 319].
Во втором случае объекты метят после замораживания-скалывания и оттаивания, которое проводят в присутствии фиксатора. В дальнейшем возможны два пути препарирования: 1) заливка объектов и получение УС (перпендикулярно сколу) или 2) высушивание и напыление с последующим изготовлением реплики [319].
В третьем случае возможны два варианта препарирования. В первом варианте объекты замораживают, скалывают и оттеняют платиной. После оттаивания реплики не очищают от объекта, а постфиксируют и заключают в заливочную среду. Толстые УС делают параллельно оттененному сколу. Для просмотра толстых УС используют высоковольтный ТЭМ. Данный метод получил название УС-реплика. Мечение обнажающихся во время скола белков осуществляется после оттаивания образца. В качестве маркера используют КЗ.
Если объекты вначале замораживают, скалывают и реплицируют, затем оттаивают и инкубируют с лигандом, оттененные реплики очищают и анализируют, то после оттаивания возникает прямой контакт гидрофобной зоны монослоя липидов с жидкостью. Это приводит к сворачиванию монослоя. Поэтому ВМЧ, как правило, не выявляются. В некоторой степени этот недостаток был устранен путем сочетания следующих процедур: замораживания, скалывания, оттенения платиной, оттаивания и инкубации с меченым лигандом. Далее используют лиофилизацию или высушивание в критической точке (ВКТ) и напыление углеродной пленки. После растворения тканей и очистки реплики просматривают в ТЭМ. Этот метод позволяет лигандам связываться с ВМЧ. Таким образом, во втором варианте вместо заливки после мечения проводят высушивание, напыление реплики углеродом и травление объекта.
Наконец, мечение клеток можно осуществлять после репликации. В этом случае реплики с клетками обрабатывают мечеными иммунореагентами, которые проникают между клетками и связываются с молекулами на Е-поверхности плазмалеммы. Далее можно клетки заключить в заливочную среду и получить УС, параллельные сколу, а можно реплику просто отмыть в воде и сразу же исследовать в ТЭМ. Иногда изготавливают крио-УС после замораживания-скалывания (без репликации и оттаивания) с последующей их обработкой мечеными иммунореагентами или лектинами [21, 32, 75, 152, 319].

16.3.2. Выявление липидов

Для выявления 3?-гидроксистеролов и анионных фосфолипидов используют филипин, томатин, дигитонин. Установлено, что филипин, связываясь с 3?-гидроксисодержащими стеролами, наиболее распространенным среди которых является холестерин, образует молекулярные комплексы в соотношении 1:1. Эквимолярные отношения с холестерином характерны также для дигитонина и томатина [32, 319]. В результате обработки этими веществами формируются типичные деформации (дефекты) мембраны, которые хорошо выявляются в ЭМ; они представляют собой агрегацию единичных молекулярных дефектов. Фиксация альдегидами, как правило, не ингибирует латерального перемещения единичных комплексов филипин-холестерин и др. [32, 319].
Итак, при агрегации филипин-стероловых комплексов на мембранах образуются филипин-стероловые деформации, которые на комплементарных поверхностях имеют вид округлых выступов или ямок диаметром около 25 нм. На УС в этих случаях выявляется характерная картина "завитков". Число филипин-стероловых деформаций поддается количественной оценке.
Механизмы образования деформаций не полностью выяснены. Деформации мембраны связывают с изменением ее поверхностного натяжения с той стороны, где образуются агрегированные филипин-стероловые комплексы. Выступы и углубления наблюдаются на одной и той же мембране, что свидетельствует об асимметричном распределении в ней липидов. Образование комплексов снижается в присутствии сфингомиелина, но возрастает с увеличением концентрации филипина. Повышение осмотического давления в среде ингибирует этот процесс [32, 319].
Высокоспециализированные мембраны меньше деформируются под действием филипина. Это связано, по мнению ряда исследователей, с присутствием большого числа интегральных протеинов (т.е. ВМЧ) или с жесткой стабилизацией липидного бислоя примембранными фибриллярными структурами (см. Приложение, 16).
Дигитотин и томатин при связывании с мембранными стеролами образуют длинные слегка вогнутые (на EF-поверхности) или выпуклые (на PF) округлые желобки или гребни шириной 40-60 нм. Эти складки интенсивно переплетены друг с другом, при продолжительном инкубировании они могут замыкаться и отделяться от мембраны с формированием дискретных внемембранных трубочек. После воздействия сапонинов, как правило, превалируют поперечные сколы мембран, а тангенциальные встречаются значительно реже. Выявляемые дефекты в случае использования сапонинов чрезвычайно вариабельны, необходима предварительная или одновременная фиксация, так как сапонины больше, чем филипин, повреждают мембраны клетки.
Механизмы проникновения филипина и сапонинов в клетки различаются. Сапонины проникают в клетку через поврежденные участки плазматических мембран (обнаружение сапониновых дефектов на внутриклеточных мембранах сопряжено, как правило, с сильным повреждением плазматической мембраны), а филипин связывается вначале со стеролами плазматической мембраны и, по-видимому, затем свободные молекулы филипина диффундируют в клетку (в этом случае значительных повреждений плазматической мембраны может не быть).
Обработку филипином и сапонинами производят перед замораживанием-скалыванием. Филипин практически нерастворим в воде, поэтому перед добавлением фиксатора или буфера его необходимо растворить в небольшом объеме диметилсульфоксида или диметилформальдегида, при этом довольно легко достигнуть концентрации 50-200 мкг/мл. Чаще всего используют 0.3 М раствор филипина, приготовленный на 0.1 М какодилатном буфере. Сапонины обычно применяются в тех же концентрациях. Инкубация производится в темноте при комнатной температуре и при постоянном помешивании.
Следует помнить, что как филипин, так и сапонины проникают в ткани только на небольшую глубину. Наиболее подходящими объектами для анализа распределения мембранных стеролов являются клеточные суспензии или монослойные клеточные образования, например однослойные эпителии. Можно использовать срезы, сделанные на вибратоме. Лучшие результаты получаются в случае продолжительности инкубации 3-24 ч.
Другими маркерами холестерина являются стрептолизин и F-гемолизин, образующие на мембранах дефекты в виде выступающих колец или дугообразных структур диаметром 30-50 нм. К сожалению, агрегация ВМЧ при этих обработках серьезно лимитирует их применение. Из всех описанных маркеров наиболее эффективен и широко распространен филипин. Он меньше всех разрушает мембраны. Образуемые деформации относительно невелики, дискретны и легко поддаются подсчету.
Пептидный антибиотик полимиксин В селективно связывается с отрицательно заряженными группами липидов. Даже в низких концентрациях он соединяется с мембранами большинства грамотрицательных бактерий. Обработка этим антибиотиком ничем принципиально не отличается от таковой в случае филипина и сапонина. Перед фиксацией клетки инкубируют при температуре 20-30®С в забуференном растворе полимиксина В. Затем их замораживают и скалывают. Концентрация антибиотика варьирует от 1 до 300 мкг/мл, а продолжительность инкубации - от 1 до 60 мин. Препарат медленно и равномерно проникает в ткани. На PF-поверхности скола возникают деформации в виде гладких возвышений. Размеры и форма деформаций во многом сходны с тем, что выявляется после филипина. Некоторые мембраны также обнаруживают асимметрию в распределении дефектов [32, 319].

16.3.3. Криоавторадиография

Новым направлением в развитии метода замораживания-скалывания-травления стало его сочетание с АРГ. Эта комбинация позволила соединить преимущества обоих методов и в настоящее время используется в ряде лабораторий. Разработаны специальные установки для проведения такого рода исследований [32, 75, 152, 338].
Существует несколько приемов нанесения фотоэмульсии на напыленную поверхность. Лучшим способом является покрытие сколов эмульсией при низкой температуре. Поскольку при обычном способе получения монослоя фотоэмульсия высыхает, а высохший монослой не прикрепляется к поверхности объекта, то к эмульсии добавляют глицерин. Он медленно испаряется в вакууме и не дает высохнуть фотоэмульсии. Непосредственно перед покрытием скола эмульсией на него или на монослой эмульсии, что проще, наносят небольшое количество (около 1 мкл) 4-пропанола или бутанола. Монослоем эмульсии с каплей пропанола покрывают сколотую поверхность, имеющую температуру -130®С. Через несколько минут жидкость испаряется и монослой плотно прилегает к сколу. Затем объекты помещают в сосуд Дьюара на плавающей подставке и экспонируют при -100®С в течение 6-12 недель. После оттаивания проявляют и закрепляют автограф. Зерна серебра на реплике можно стабилизировать, напыляя добавочный слой углерода. Эта процедура необходима лишь в том случае, если в последующем применяют сильные окислители, такие как хромпик. Следует иметь в виду, что нанесение второго слоя углерода требует повторного вакуумирования, а это может существенно повреждать реплики [32, 111].
Для анализа монослойных клеточных культур разработан метод, сочетающий крио-ЭМ с АРГ. После инкубации с мечеными зондами монослой клеток замораживают, скалывают и подвергают травлению. После этого меченые мембраны или монослои клеток высушивают и покрывают фотоэмульсией при комнатной температуре. Мембраны клеток можно вначале метить с помощью АРГ. Далее объекты подвергают замораживанию-скалыванию и отмывают в воде. Реплики, снятые на сеточки, покрывают фотоэмульсией и проявляют обычным путем [32].

16.4. АРТЕФАКТЫ

В соответствии с последовательностью этапов препарирования образцов для замораживания-скалывания-травления вероятные артефакты можно разделить на следующие большие группы: 1) связанные с подготовкой образцов к замораживанию; 2) обусловленные процессом замораживания; 3) возникающие во время процессов раскалывания и травления; 4) возникающие в результате процессов оттенения; 5) обусловленные способами очистки реплик; 6) формирующиеся во время просмотра препаратов в ТЭМ (подробно об артефактах данного метода см.: [32]).

Глава 17 СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

17.1. МАКРОМОЛЕКУЛЫ

Для визуализации пространственной организации макромоле-кулярных комплексов на поверхности клеток часто используется метод репликации гидратированных клеток, клеточных компонентов и изолированных молекул после замораживания-высушивания или замораживания-травления [232, 280].
При исследовании методом оттенения нуклеиновых кислот можно наносить их на гидрофильную подложку (например, свежий скол слюды) с помощью пульверизатора. Нуклеиновую кислоту растворяют в буфере, составленном из легко сублимирующих компонентов, например в аммониево-ацетатном, и с помощью пульверизатора наносят на поверхность слюды. Концентрация раствора, его количество и расстояние до него подбирают опытным путем. Оттенение обычно производится платиной или сплавом платины с палладием. Затем наносят тонкий слой углерода. Полученные реплики отделяются от поверхности слюды в воде. Таким же образом можно получать реплики с белковых кристаллов, рибосом, фагов и вирусов (см. Приложение, 17.1 и 17.2).
Молекулы нуклеиновых кислот суспензируют в стабилизирующем растворе - гиперфазе (содержит ацетат аммония, ЭДТА, цитохром С и 0.1-0.5 мкг нуклеиновой кислоты на 100 мкл общего объема раствора). Гиперфаза должна свободно стекать вниз по сверхчистому предметному стеклу либо ее наслаивают на поверхность воды или разведенного раствора (гипофаза). Поверхность гипофазы обычно покрывают порошком талька или графита в виде монослойной пленки. Макромолекулы, распластываясь по ги-пофазе, оттесняют частицы талька. Сеточкой с подложкой аккуратно прикасаются к чистым областям (именно они содержат нуклеиновую кислоту), так чтобы молекула кислоты адсорбировалась на подложке. Объекты обычно контрастируют в растворе, представляющем собой смесь 0.05 М УА и 0.05 М НСl в 95%-ном этаноле. После промывания в воде сеточку помещают на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Сеточки с объектами (макромолекулами вверх) оттеняют при вращении в условиях высокого вакуума с помощью испарения металла (см. Приложение, 17.1 и 17.2). Молекулы ДНК можно контрастировать раствором ФВК на 70%-ном этаноле, а затем оттенять металлом при вращении. Наконец, ДНК можно негативно контрастировать в нейтральной ФВК, после чего просто адсорбировать на тонкую углеродную подложку - она в этом случае видна в ТЭМ.
Гораздо реже используют двухступенчатый метод. Сеточку с формваровой подложкой смачивают в 1-2 мл ацетона в течение 1-2 мин. Прежде чем ацетон испарится, на размягченную поверхность формвара помещают исследуемые объекты и добавляют еще одну каплю ацетона. Пленку не менее 5 мин сушат под лампой, после чего объект снимают с пленки, на которой остается отпечаток. Качество отпечатка и чистоту его поверхности проверяют с помощью СМ. Замеченные остатки объекта можно удалить мягкой кисточкой. Отпечаток оттеняют металлом, а затем укрепляют с помощью напыления углеродом. Формвар растворяют с помощью хлороформа. Для удаления загрязнений реплику можно обработать в растворе, содержащем 1.5 г KMnO₄ и 1.5 г K₂CrO₇ в 15 мл концентрированной серной кислоты. Реплику затем промывают в разбавленной соляной кислоте.
Для исследования сложных трехмерно организованных белковых молекул используется метод сверхбыстрого замораживания раствора этих молекул и глубокого травления с последующей их репликацией [128, 140, 232].
При исследовании вирусов и макромолекул часто необходимо использовать сверхтонкую (1 нм) углеродную подложку. Для этой цели вначале готовят дырчатую подложку (микросеточку) из формвара, на нее в вакууме напыляют слой углерода толщиной 20 нм. Микросеточку покрывают пластиковой подложкой (3 %-ный коллодий). На пластиковую подложку в вакууме напыляют очень тонкий (1 нм) слой углерода. Сеточку помещают в вакуумный пост и отжигают при температуре 420-430®С в условиях высокого вакуума. При этом и формвар, и коллодий удаляются, и сверхтонкая углеродная пленка оказывается лежащей на дырчатой углеродной подложке (микросеточке) [288, 311].
С помощью ЭМ можно визуализировать процесс взаимодействия белков и нуклеиновых кислот [213, 229]. Углеродную Подложку травят в тлеющем электрическом разряде для получения положительного заряда на поверхности. Положительный заряд на поверхности угольной подложки обеспечивает надежную связь с отрицательно заряженными молекулами ДНК, которые в растворе быстро прикрепляются к подложке, не изменяя своей трехмерной структуры [3, 36, 272, 294].

17.2. ИССЛЕДОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК

Особенностью прокариотов является тот факт, что их ДНК не содержит достаточного количества связанных белков, а имеющиеся быстро теряются в начальный момент фиксации с помощью ГА. Поэтому ГА практически не фиксирует ДНК прокариотов. Для лучшей сохранности ультраструктур рекомендуется обязательная обработка прокариотов с помощью кислых растворов ЧО и УА, в большей степени стабилизирующих их ДНК (см. Приложение, 17.9 и 17.10) [9].
Для фиксации комочков клеток из культур микроорганизмов, выращенных на твердых средах, или из осадка, полученного центрифугированием из жидких сред, применяют 1.5%-ный раствор KMnO₄, приготовленный на вероналацетатном буфере. Значение рН раствора устанавливают в зависимости от объекта (например, кишечную палочку фиксируют при рН 7.2-7.6, дрожжевые клетки дают лучшие результаты при рН 4.5, фиксация продолжается в течение 0.5-1 ч). Растительные объекты препарируют практически так же, как и животные. Однако иногда их фиксируют 1%-ным раствором перманганата калия [9].

17.2.1. Тотальные препараты

Ряд биологических объектов можно исследовать в ТЭМ тотально: вирусы, бактериальные клетки и их споры, фаги, макромолекулы нуклеиновых кислот, кристаллы белков и других биополимеров. При нанесении суспензий из этих объектов на сеточки с подложками необходимо избегать их загрязнения. С поверхности колонии бактерий, культивируемых на твердой питательной среде, микробиологической петлей снимают верхний слой клеток, который переносят в подходящий буферный раствор, где клетки суспензируют. Полученную суспензию наносят на сеточки с пленкой. Споры актиномицетов можно получить с помощью капли воды, стекающей по поверхности воздушного мицелия и тд.
Можно нанести исследуемый объект на сеточку с подложкой и держать во влажной камере несколько минут. В течение этого времени некоторая часть веществ, клеток или макромолекул оседает на пленку и прочно к ней прилипает. Затем сеточку промывают водой, переносят на фильтровальную бумагу и высушивают. Если эту процедуру проводить при низкой температуре, то количество адсорбированных частиц увеличивается [9].
При изучении вирусов кусочки зараженной ткани тщательно растирают, выделившуюся жидкость переносят в небольшое количество раствора. Полученную суспензию наносят на сеточку с подложкой. Однако во взвеси могут быть обрывки ткани.

17.3. МЕТОДЫ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ

Возможны следующие способы очистки объектов от питательной среды: центрифугирование, диализ, фильтрация в агаре.
В первом случае осадок после центрифугирования суспензируют в дистиллированной воде, в физиологическом или буферном растворах. Если однократная очистка окажется недостаточной, то следует ту же процедуру повторить еще раз. Для предохранения объекта от разрушения его фиксируют в ФА или ЧО.
Метод капельного диализа состоит в том, что на коллодиевую подложку, плавающую на поверхности воды, наносят капли суспензий исследуемых объектов: бактерий, вирусов, фагов. Чашку Петри закрывают и ставят в термостат при температуре 26-30®С. Подложка в этом случае применяется в качестве диализирующей мембраны. Срок диализа - от 3 до 24 ч (в зависимости от состава среды, температуры и толщины диализирующей пленки). Очищенный от среды объект остается на коллодиевой пленке. По окончании диализа к нижней стороне пленки под местами локализации капель прикрепляют опорные сеточки.
Во избежание морфологических изменений, связанных со старением, автолизом, потерей жгутиков и другими аналогичными процессами, объекты рекомендуется фиксировать, для чего открытые чашки Петри с каплями на пленках помещают под стеклянный колпак на 15-20 мин, например в пары 40%-ного нагретого формалина.
Можно вначале разместить на подложке опорные сеточки, накрыть их фильтровальной бумагой и дать ей намокнуть, затем снять подложку с поверхности воды, а после высушивания на подложку над сеточками поместить каплю объекта; весь "бутерброд" фильтровальной бумагой вниз надо положить на поверхность диализирующей жидкости. При этом диализ идет через подложку, сеточку и фильтровальную бумагу. По окончании диализа бумагу с сеточками снимают с поверхности воды и подсушивают. Препараты, если необходимо, оттеняют металлом на этой же бумаге либо контрастируют другими методами. Метод прост, обеспечивает стерильность и удобен для маркировки препаратов (записи можно делать на той же фильтровальной бумаге).
Для очистки объектов путем фильтрации на поверхность 3%-ного агара наносят 2-3 капли исследуемого объекта в обычной для него среде и стеклянным шпателем осторожно распределяют их по поверхности агара. Чашку Петри закрывают, чтобы предотвратить испарение влаги, и оставляют на 10-20 мин для фильтрации суспензирующей среды в толщу агара. Затем на поверхность агара пипеткой наливают 0.2%-ный раствор коллодия в амилацетате и быстро и равномерно распределяют его по поверхности. После испарения растворителя образуется коллодиевая пленка, покрывающая объект. Кусочек агара с пленкой вырезают и переносят на поверхность воды, где пленка, к нижней поверхности которой прилипла часть объекта, легко отделяется от агара. На пленку помещают сеточки и снимают их вместе с пленкой с поверхности воды с помощью фильтровальной бумаги. Однако к пленке прилипает не все разнообразие частиц, находящихся в данном препарате, а только случайные частицы. Недостатком является и то обстоятельство, что исследуемый объект длительное время находится в непосредственном соприкосновении с водой, что может вызвать его разрушение.
С целью ликвидации указанных недостатков процедуру можно проводить в иной последовательности. Гбтовят 1.5-3.0%-ный агар с примесью солей, входящих в суспензирующую жидкость. После того как агар застынет, его поверхность промывают очищенным петролейным эфиром, чтобы удалить жировые пятна и другие загрязнения, и подсушивают вентилятором до полного удаления влаги, после чего на подготовленную таким образом поверхность наносят 0.2-0.4%-ный раствор коллодия в амилацетате и быстро и равномерно распределяют его по поверхности агара. Чашки переворачивают на бумагу и сушат в таком положении в течение 6 ч. На полученную пленку, покрывающую агар, помещают 2-4 капли суспензии исследуемого объекта и стерильным шпателем распределяют их по поверхности пленки, стараясь ее не повредить. Быстро закрывают чашку и выдерживают 10-20 мин. Скорость фильтрации зависит от органических компонентов фильтруемой суспензии. В частности, белки быстрее закупоривают поры агара. После фильтрации препарат фиксируют парами формалина в течение 7-10 мин, затем из агара вырезают маленький блок (нельзя использовать влажные участки) и переносят в 2%-ный раствор азотнокислого лантана пленкой вверх. На поверхности жидкости пленка легко отделяется от агарового блока и всплывает. Под пленку подводят опорные сеточки, вылавливают и высушивают на фильтровальной бумаге.
Можно микроорганизмы выращивать на коллодиевой пленке. После получения коллодиевой пленки на поверхности агара, как описано выше, на нее пастеровской пипеткой наносят бактериальную суспензию или суспензию бактерий, зараженных фагом. Высота капель должна быть не более 1 мм, а диаметр 1-2 мм. Затем чашку Петри выдерживают в термостате при соответствующей температуре в течение требуемого промежутка времени. Когда рост колоний достигает желаемой стадии, подлежащий изучению участок агара вырезают и переносят в чашку с водой - пленка легко отделяется от агара и всплывает.
Вместо агара можно применять жидкую питательную среду. Чашку Петри заполняют стерильной водой, на поверхности которой получают коллодиевую пленку. Воду из-под пленки удаляют и заменяют ее слоем питательной среды толщиной 4-5 мм. На пленку наносят суспензию бактерий и выращивают их до определенной стадии в термостате. Затем питательную среду дважды промывают водой. Выбранные участки пленки укрепляют на опорных стеках.
Для уменьшения количества загрязнений подложку с сеточками снимают с поверхности воды с помощью фильтровальной бумаги и помещают на агар или питательную среду. Этот же способ удобен для изучения фаголизиса и действия различных химических агентов на бактериальные клетки. Для этого фаги или химические вещества добавляют в питательную среду.
При работе с клеточными фракциями или микроорганизмами нельзя допускать, чтобы толщина осадка превышала 05 мм. После фиксации в ГА лучше отмыть и ресуспензировать осадок в теплом (t=45®С) агаре или агарозе на буфере. Застывшие объекты можно нарезать и препарировать как кусочки ткани [9, 287].

17.4. МЕТОД ПСЕВДОРЕПЛИК

Данный метод является одним из способов подготовки препаратов для ТЭМ. Сеточкой с подложкой осторожно прикасаются к поверхности бактериальной колонии или к стерильному пятну на месте лизиса бактерий фагом, при этом бактерии или фаговые частицы прилипают к пленке.
Можно на поверхность образца вылить 0.2%-ный раствор коллодия, который после испарения дает тонкую коллодиевую пленку. Кусочки агара, покрытые пленкой, вырезают и переносят на воду. Пленка легко отделяется от агара и всплывает на поверхность воды. К ее нижней поверхности прилипают бактерии или фаги. На поверхность пленки помещают сеточки, затем пленку с сеточками покрывают куском фильтровальной бумаги, снимают с поверхности воды и высушивают.
Для исследования ограниченных участков колонии можно с помощью стеклянного капилляра вырезать нужные участки агара и тонкой иглой протолкнуть их к другому концу капилляра. Участок агара с объектом не должен выходить за пределы капилляра более чем на 1 мм. Этим концом прикасаются к коллодиевой пленке, к которой прилипают микрочастицы образца. Следует, однако, учитывать, что к подложке может прилипнуть только определенная часть объекта. Соответственно, информация об объекте будет неполной. Кроме того, на сеточке обычно много загрязнений [9, 287].

17.5. ИССЛЕДОВАНИЯ ОСАДКОВ, МАЗКОВ И КЛЕТОЧНЫХ МОНОСЛОЕВ

Предложены различные устройства для осаждения взвешенных эукариотных клеток с помощью центрифугирования непосредственно на предметное стекло либо осаждения и концентрирования их на миллипоровых фильтрах, которые потом готовят для исследования в ТЭМ или СЭМ. Например, взвесь клеток накапывают на стекло, которое погружают в контейнер с раствором ГА. Затем на мазок накапывают раствор ЧО, инкубируют во влажной камере, обезвоживают и пропитывают в заливочной среде. Заполняют капсулы доверху смолой, помещают туда бумажные маркеры, переворачивают, накрывают капсулами мазки, полимеризуют в термостате. После затвердевания проводят локальный подогрев места, где приклеена капсула, что позволяет пальцем легко отделить капсулу с объектом от стекла (см. с. 54, рис. 3). Образовавшиеся монослои можно использовать для дальнейших манипуляций: маркировать поверхности лектинами и антителами, подвергать замораживанию-скалыванию, репликации и т.д. Целые клетки могут быть выращены на подложке и в дальнейшем исследованы с помощью высоковольтной ТЭМ (ВТЭМ) или СЭМ [3].
Для исследования осадков биологических жидкостей можно рекомендовать следующий метод. На стекло при t=60®С наливают 10%-ный раствор желатины и остужают, его. Лезвием бритвы на слой желатины наносят квадратную решетку. На поверхность желатины помещают большую каплю биологической жидкости (моча, слюна и др.) и выдерживают во влажной камере. На осадок осторожно наслаивают 1%-ный раствор ГА (этот этап можно исключить, а вместо него зафиксировать объект в парах ЧО). Далее препарат подвергают ВКТ (можно высушить на воздухе) и просматривают сначала в СМ, а затем в СЭМ. Вместо желатины можно использовать 0.1%-ный раствор полилизина.
Клетки могут осаждаться на миллипоровый фильтр. Нефиксированные клетки прочно прилипают к фильтру через 20 мин инкубации при t=37®С. Далее клетки окрашивают, подвергают ВКТ, исследуют в СМ, а затем напыляют металлом и изучают в СЭМ. Сам фильтр не мешает светооптическому исследованию.
Для прикрепления клеток к субстрату можно использовать следующие виды взаимодействий: 1) электростатические, например между отрицательно заряженными протеинами и положительно заряженной подложкой (угольная пленка); 2) ковалентные, например между трансмембранными протеинами и покрытой ГА подложкой; 3) другие типы взаимодействий, например между трансмембранными гликопротеинами и покрытой конканавалином А подложкой (рис. 37 и 38) [271].
Чаще всего покровные стекла, используемые для осаждения (при центрифугировании) изолированных частиц, рекомендуется обрабатывать поли-Ь-лизином (погрузить в 0.025%-ный раствор полилизина на деминерализированной воде на 10 мин, трижды промыть в той же воде и высушить на воздухе).
Нередко возникает необходимость выбрать для исследования в СЭМ структуры (клетки), имеющие особые тинкториальные свойства. Для этого вначале окрашенный препарат (мазок) просматривают в СМ. После окрашивания препарат нельзя высушивать на воздухе - он должен быть покрыт слоем жидкости. Препарат помещают на рабочий столик прибора для измерения микротвердости, например ПМТ-3, затем вместо объектива к интересующему объекту через слой воды подводят индентор (алмазную пирамидку) и вдавливают его в выбранный микроучасток подложки рядом с клеткой. Далее препарат обезвоживают и подвергают ВКТ [63]. При анализе суспензий биологических объектов в ТЭМ с по мощью УС вначале на парафильм помещают маленькую каплю расплавленного агара (t=50®С), до застывания в центр ее микропипеткой инъецируют густую взвесь изолированных частиц, и всю систему быстро охлаждают на льду (5 мин). Далее следует обычная процедура фиксации и препарирования [282]. Можно погрузить тонкую стеклянную палочку в раствор агара, охладить и застывший слой агара использовать в качестве корпуса шприца, а палочку - в качестве поршня для накачивания внутрь получившейся капсулы взвеси микрочастиц. Края капсулы запаивают путем погружения в расплавленный агар и последующего охлаждения [183].

0x01 graphic

Рис. 37. Метод мечения протоплазматической поверхности плазмалеммы. А - прикасание к поверхности культивируемых клеток (1) пластинкой (2) с нанесенным на нее адгезивным покрытием (например, полилизин); Б - при отделении пластинки приклеившаяся к ней плазмалемма (3) отрывается от клетки; В - ме-чение структур на протоплазматической поверхности плазмалеммы с помощью лиганда (4); Г - оттенение платиной и напыление углеродом (направление показано стрелками); Д - снятие реплики на поверхность жидкости (5); Е - вылавливание реплики на сеточку (6).

0x01 graphic

Рис. 38. Метод приготовления реплики с поверхности изолированных клеток. А - клетки (1), осажденные на поверхности стекла (2) или культивируемые на ней; Б - напыление слоя (3) металла и углерода на поверхность клеток; В - снятие реплики (4) на поверхность воды.

Если исследуют цитологические отпечатки на отмытой рентгеновской пленке, то их фиксируют в ГА и окрашивают, например по Папаниколау [38]. При заключении отпечатков, для того чтобы избежать раздавливания клеток, между пленкой и покровным стеклом помещают тонкие полоски той же пленки. Подлежащие исследованию клетки отмечают на обратной стороне рентгеновской пленки. Покровные стекла отделяют при обработке ксилолом. Далее объекты по 5 мин последовательно обрабатывают смесью этанола и ксилола, 100%-ным этанолом, смесью этанола и изоамилацетата, 100%-ным изоамилацетатом и подвергают ВКТ. После исследования в СЭМ объекты погружают в растворы этанола нисходящей концентрации, выдерживают 20 ч в ФБ и готовят для ТЭМ. Нужный участок маркируют с помощью стереомикроскопа [191, 206].
В случае исследования в ТЭМ монослоя клеток на стекле (или пластике) его заливают с помощью капсул, заполненных заливочной смолой и перевернутых на нужный участок монослоя. Стекло легко отделяется от застывшей заливочной смолы, если его локально охладить сухим льдом или жидким азотом, особенно если это сделать сразу же после нагревания препарата в кипящей воде. Удаление объектов облегчается, если стекло до начала культивирования клеток покрыть коллагеном. Для получения УС, перпендикулярных монослою, объект рекомендуется перезалить в нужном положении. Если клетки выращивают на пластике, который легко режется (метакрилаты, силиконовая резина, пластинки из эпоксидной пластмассы), то клетки можно не отделять.
Клетки, растущие на фальконовском пластике, легко отделяются от субстрата с помощью окиси пропилена. Однако растворитель не должен контактировать с пластиком более 60 с, поскольку это ведет к переносу пластификатора из пластмассы в клетки и может блокировать последующую полимеризацию заливочной смолы.

17.5.1. Культура ткани

Выращивание клеток на подложке, например формваровой, позволяет после префиксации, постфиксации с помощью 40, гистологического окрашивания, обезвоживания и ВКТ исследовать одну и ту же клетку в СМ, ТЭМ, СЭМ и с помощью РМА. Однако при этом надо быть уверенным в отсутствии токсического воздействия подложки на растущие клетки.
Исследователь, работающий с тканевыми культурами, должен помнить, что пластиковые чашки растворяются в ацетоне, а иногда и в этаноле. Полипропиленовая посуда резистентна к этим воздействиям. При добавлении жидкости в культуральные чашки ее надо медленно и аккуратно наслаивать, для того чтобы избежать повреждения монослоя.
Для культивирования клеток с последующим ЭМ-анализом предложена пленка из меламиновой пластмассы (гексаметилолме-ламиновый эфир), поверхность которой содержит свободные аминогруппы, способные реагировать с альдегидами так же, как они реагируют с протеинами. Это позволяет плотно сшивать клетки с подложкой и использовать ее для подготовки объектов как для СМ, так и для ТЭМ и СЭМ (см. Приложение, 17.8). Подложка из меламина устойчива к стерилизации в пламени, она гладкая и гомогенная, выдерживает дегидратацию и ВКТ [360].
Культивируемые на пластике клетки можно окрашивать гистологическими красителями in situ, без изготовления ПС. Для этого после префиксации, постфиксации и обработки en bloc с помощью УА разрезать монослой на квадраты, окрасить в течение 5 с в све-жеотфильтрованном растворе, содержащем 1 % метиленового синего, 1 % азура II и 0.5 % буры, обезводить в этаноле, а затем на дно пластиковой чашки направить струю окиси пропилена так, чтобы квадратные кусочки всплыли на поверхность жидкости. В дальнейшем объекты заключают в эпоксидную смолу с помощью метода плоскопараллельной заливки [210, 226].
Мазки или отпечатки тканей можно зафиксировать (не следует забывать об обработке с помощью ЧО), окрасить гистологическим красителем, заключить в бальзам, изучить под СМ. Затем можно покровное стекло снять с помощью ксилола, подготовить объекты для СЭМ, исследовать, а затем заключить в смолу для изучения в ТЭМ (см. Приложение, 17.3 и 17.7). Применение стандартных концентраций ГА и ФА уменьшает окрашиваемость образцов обычными гистологическими красителями, поэтому, если желательно одновременное исследование в СМ, нужно использовать разбавленные фиксаторы [206].
При изучении культивируемых клеток применяют метод переворачивания капсул со смолой на объект. Иногда после полимеризации заливочной смолы стекло или пластик, на котором росли клетки, отделяют с помощью погружения в жидкий азот. Пластинку с объектами разрезают на мелкие квадраты (4x4 мм), помещают в плоские формы, заполненные смолой, и полимеризуют [226].
Если необходимо применить сочетанное СМ- и СЭМ-исследо-вание, то вначале культуру ткани, окрашенную после фиксации гематоксилином, под слоем жидкости исследуют в СМ. Затем с помощью прибора для измерения микротвердости на подложку наносят вдавление рядом с исследуемой клеткой, объекты обезвоживают, подвергают ВКТ и исследуют в СЭМ. Вдавление легко идентифицируется в СЭМ- Маркировка клеток возможна и после их высушивания [3, 37, 294].

17.6. СОЧЕТАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ СМ И ЭМ НА ОДНОМ ОБЪЕКТЕ

В последние годы при проведении диагностических и экспериментальных исследований все чаще возникает потребность в привлечении для уточнения диагноза и расшифровки патогенеза заболеваний методов высокого разрешения: ТЭМ и СЭМ, замораживания-скалывания, молекулярных зондов, иммуно-ЭМ и т.д. Вместе с тем большинство использующихся в настоящее время способов взятия и подготовки материала для патогистологичес-кого исследования исключает возможность привлечения в последующем для анализа ЭМ-методов высокого разрешения.
Поэтому разработан алгоритм взятия и препарирования материала, позволяющий по мере необходимости привлекать методы высокого разрешения для уточнения диагноза [3]. В зависимости от планируемого в дальнейшем (для уточнения диагноза) использования базового морфологического метода высокого разрешения выделяют следующие препаровочные группы объектов: 1) материал, где основными (базовыми) станут методы ТЭМ, замораживания-скалывания, иммуно-ЭМ; 2) материал, где базовым станет метод СЭМ нативных и экстрагированных препаратов; 3) материал, где основным станет метод коррозионных препаратов. В каждой из групп схема подготовки материала имеет определенные особенности. В то же время выделение групп по методическому принципу подчеркивает лишь, что наиболее воспроизводимые результаты будут получаться по базовому методу, хотя в той же группе возможно использование и других морфологических методов высокого разрешения с той лишь разницей, что воспроизводимость результатов будет хуже.
В то же время при планировании морфологических исследований необходимо четко представлять определенные ограничения в сочетаемости методов высокого разрешения. Так, при использовании метода СЭМ коррозионных препаратов становится невозможным применение на тех же объектах метода замораживания-скалывания-травления и т.п. Например, кусочки, сосуды (или другие полости) которых заполнены застывшей инъекционной массой, могут использоваться для светооптического исследования. Для этого во время обезвоживания после 100%-ного этанола или ацетона блоки выдерживают в течение 2 сут в трех сменах хлороформа для удаления инъекционной массы (метакрилатов) и вновь помещают в 100%-ный этанол (ацетон). Если перед введением инъекционной массы сосуды перфузировались фиксатором на базе ГА или ФА, то такие объекты пригодны и для исследования в ТЭМ [3].
Подготовку и выбор тканей из маленьких биопсийных проб лучше осуществлять с помощью стереомикроскопа. Например, когда разрезают биопсию почки на образцы для светооптического, иммуногистохимического и ТЭМ-исследования, необходимо, чтобы клубочки присутствовали во всех объектах.

17.6.1. Топическая ЭМ

В настоящее время УС изготавливают после точной идентификации окружающих структур. Для точной локализации исследуемых структур разработаны специальные методические приемы, которые можно обозначить термином "топическая ЭМ". После обычной фиксации в ГА или ФА, постфиксации в ЧО и дегидратации серийные срезы толщиной 30 мкм режут на вибратоме и заливают в аралдит в специальных прозрачных коробочках небольшой толщины. Такие плоскопараллельные пластинки со срезами удобны для светооптического анализа и прицельного выделения нужного кусочка для ЭМ. Разработаны методы точного, стандартизированного иссечения объектов из плоских препаратов с последующим прецизионным монтированием их на капсуле с за-полимеризованной смолой [37]. Очень важно строго локализовать изучаемые в ТЭМ клетки по отношению к окружающим структурам. Перед началом съемки на ЭМ (или в конце ее) фотографируется целый УС: Затем один из углов УС устанавливается в центр поля зрения, что отмечается в качестве начала оси координат. В дальнейшем для каждой фотографируемой структуры отмечаются ее координаты.
Можно медленно (в процессе полимеризации) раздавливать заключенные в заливочную смолу образцы между стеклами, получая тотальные препараты с последующим изготовлением УС.

17.6.2. ТЭМ после СМ

Одной из задач, стоящих перед исследователями при сочетании СМ и ЭМ, является выделение индивидуальных клеток при светооптическом анализе с целью их последующей идентификации в ЭМ. Известен ряд решений этой задачи. Например, живые клетки, выращенные на различных субстратах, изучают в СМ и маркируют для последующей ТЭМ с помощью рельефных меток, наносимых на субстрат механическими инструментами. Существуют методы маркирования светооптических препаратов с целью идентификации клеток, выбранных для сагиттальной ультратомии [37]. Выпускаются комбинированные оптические и ТЭМ-микро-скопы, которые позволяют исследовать тот же самый срез с помощью СМ и ТЭМ.
Если начальным этапом субмикроскопического анализа является исследование ПС, то после просмотра ПС на него в нужном месте накладывают заполненную незаполимеризованной смолой капсулу (в перевернутом виде, смолой вниз). ПС с капсулой помещают в термостат для полимеризации. После отделения капсулы с ПС от стекла ее распиливают, и полученные половинки исследуют отдельно. Иногда поступают иначе: на ПС делают царапину, разделяющую две его части, которые нужно анализировать отдельно. На каждую из частей опрокидывают по капсуле со смолой и выдерживают их в термостате. Обе полученные капсулы можно использовать для приготовления УС (рис. 39). После полимеризации капсулы с заполимеризованными образцами легко отделяются от стекла с помощью термического шока (стекла последовательно помещаются в кипящую воду и в жидкий азот) [3, 37, 251, 294].
Разработана эффективная методика перезаключения целлоидиновых и парафиновых срезов для ТЭМ (см. Приложение, 17.4): срезы, заключенные в целлоидин, отделяют от стекла и заливают в эпоксидную смолу [288].
Возможен также подход, основанный на комбинированном им-муноцитохимическом исследовании одного и того же участка путем перезаливки ПС и получения УС. Для этого эпоксидный ПС инкубируют в насыщенном растворе этоксида натрия (см. Приложение, 6.6.5) или 10%-ной перекиси водорода в течение 1-10 мин, затем проводят реакцию иммуномечения и серебряного усиления. После окрашивания срезы заключают в смесь глицерина и 0.01 М раствор ФБ и фотографируют в СМ. Затем удаляют покровные стекла, срезы обезвоживают и заливают в каплю заливочной среды. После полимеризации в течение 12 ч при t=60®С заключенные в смолу срезы отделяют от стекла. Материал вторично заливают в эпоксидную смолу и изготавливают УС перпендикулярно плоскости ПС (см. Приложение, 17.5).

0x01 graphic

Рис. 39. Способ перезаливки двух структур (1 и 2) из ПС (3) в два блока с помощью двух заполненных смолой капсул (4 - проекции этих капсул).

17.6.3. СМ после ТЭМ

С другой стороны, при бомбардировке толстых УС электронным пучком в ВТЭМ (см. ниже) происходит сублимация эпоксидной смолы и их толщина уменьшается. Далее эти же срезы без всякой обработки или после окрашивания могут использоваться для СМ-исследований.

17.6.4. СЭМ после CM

Во многих современных СЭМ имеются приставки, в которых вначале объект изучают под СМ и метят для СЭМ- или ТЭМ-ана-лиза. Для последовательного светооптического и СЭМ-исследова-ния тканевых объектов можно использовать парафиновую заливку или заключение в эпоксидные либо полиэфирные смолы. Особенно удобно заключать их в полиэфирную восковую смесь. После изготовления микросрезов объекты обрабатывают 100%-ным этанолом, подвергают ВКТ и исследуют в СЭМ [272]. После заключения объектов в целлоидин среду из блоков можно удалить с помощью ацетона. Если применялся терпинеол, то его растворяют изопропиловым спиртом (4 смены по 48 ч). Разработаны удобные для патологоанатомов методы подготовки залитых в парафин блоков для СЭМ.
В ряде случаев для сочетания СМ и СЭМ клетки помещают на субстраты, на поверхности которых (еще до СМ) уже имеются маркеры. Нанесение метки на субстрат может быть осуществлено механическим способом или тушью в процессе изучения объекта в СМ [63, 64, 294]. В качестве метки может использоваться ЭМ-сеточка. Ее "тень" будет служить своеобразной системой координат. Так, для последовательного исследования изолированных клеток в СМ и СЭМ на покровное стекло приклеивают опорную сеточку. Стекло обрабатывают 0.1%-ным раствором поли-L-лизина на ФБФР (рН 7.2) и высушивают. Затем на него наносят взвесь отмытых клеток и оставляют на 14 ч при t=4®С во влажной камере для осаждения и прикрепления клеток к стеклу. Далее следует ВКТ. Перекладины сеточки позволяют при СМ-исследовании точно локализовать клетку и найти ее в СЭМ [283] (см. Приложение, 17.3 и 17.7).

17.6.5. ТЭМ после СЭМ

Если необходимо подготовить объекты для ТЭМ после СЭМ-исследования, то их выдерживают (до 12 ч) последовательно в двух сменах пропиленоксида, а затем заливают в эпоксидную смолу и получают УС [3, 37, 294]. Однако при этом следует помнить, что хорошее изображение мембран можно получить только в том случае, если применялась постфиксация в ЧО. Поэтому мы рекомендуем при подготовке объектов для СЭМ всегда использовать постфиксацию с помощью ЧО.
Наконец, возможно параллельное препарирование объектов для ТЭМ и СЭМ. Так, после выделения изолированных клеток (например, из крови) их фиксируют в ГА или ФА, постфиксируют в ЧО, обезвоживают в дегидратанте (например, в ацетоне) и готовят для ТЭМ (смолу заливают непосредственно в центрифужные пробирки) или для СЭМ (из ацетона взвесь раскапывают на тщательно обезжиренные кусочки фольги). В процессе заливки для
ТЭМ перед каждой сменой жидкости объекты центрифугируют и ресуспензируют в новой порции рабочей жидкости (см. Приложение, 17.5).

17.6.6. СЭМ после ТЭМ

Материал, залитый в эпоксидные смолы, может быть использован для анализа в СЭМ. Для этого смолу удаляют 3%-ным раствором NaOH на 100%-ном этаноле в течение 48-60 ч в зависимости от размера объектов (не более 1-7 мм) [196]. Эпон легко удаляется также с помощью насыщенного (обязательно фильтровать перед использованием) раствора NaOH в этаноле. Ранее считалось, что раствор должен созревать в течение 3-4 сут, однако специальные исследования не обнаружили изменения экстрагирующей силы раствора в процессе созревания [108], который уже через 4 ч готов для использования. Экстрагирование эпоксидной смолы можно проводить дозированно, блокируя процесс путем трехкратного промывания объекта с помощью 100%-ного этанола. Скорость обнажения структур, например залитых в Эпон 812, составляет 33 мкм/ч. Перед ВКТ этанол в объектах лучше градуально заменить изоамилацетатом (см. Приложение, 17.6).

17.7. ВЫСОКОВОЛЬТНАЯ ЭМ

Первый электронный микроскоп с ускоряющим напряжением 1000 кВ был построен в г. Тулузе (Франция). Несколько коммерческих инструментов такого типа было создано в конце 60-х годов фирмой Хитачи (Япония). В последние годы стали использоваться ТЭМ с ускоряющим напряжением 200-400 кВ. Эти микроскопы дешевле и не требуют специальных помещений. С их помощью можно просматривать срезы толщиной до 1 мкм. Разрешающая способность ВТЭМ достигает 0.11 нм.
ВТЭМ позволяет проводить микроскопию живых объектов. Разработана специальная камера, в которой во влажной атмосфере могут изучаться бактерии и другие мелкие биологические объекты. Анализ толстых срезов и целых клеток с получением стереопар позволяет построить трехмерные изображения структурных элементов клеток и тканей. На базе ВТЭМ разработаны томографические системы [149] для исследования субклеточных компонентов.
Одним из существенных недостатков ВТЭМ является низкая контрастность изображений. Этот недостаток удается преодолеть за счет введения в объект электронно-плотных красителей [331].

17.7.1. Подготовка объектов для ВТЭМ

Если исследуют фиксированные клетки, то их прикрепляют к субстрату с помощью протамина сульфата или полилизина. В ряде случаев клетки просто выращивают на данном субстрате. Однако, поскольку медные сеточки оказывают токсическое действие на клетки, последние следует выращивать на подложке, которая прикреплена к стеклу. В большинстве случаев в качестве субстрата для культивирования клеток с последующим ВТЭМ-анализом применяют формваровую подложку, покрытую углеродом. После фиксации и обезвоживания клеток подложку снимают со стекла. Надо стараться, чтобы искомая клетка и центр сеточки совпали. Для этого обычно используют стереомикроскоп [90].
Одним из основных артефактов при изучении целых клеток во ВТЭМ является их растрескивание. Это связано со сжатием клеток, вызываемым обезвоживанием и высушиванием - твердые субстраты, такие, как стекло, не сжимаются, что приводит к растрескиванию клеток. Формвар тоже не сжимается, однако его тонкая пленка может деформироваться, а это позволяет клеткам оставаться целыми и не растрескиваться. То же самое происходит, если используются органические субстраты: желатина, коллагеновый гель, белковый гель и т.д. В этом случае субстрат трескается сам, но клетки сохраняют свою целостность. Фиксацию культивируемых на подложке клеток осуществляют обычным способом, префиксацию желательно проводить при t=37®С. При ВКТ целых клеток для предотвращения деформаций они должны быть предварительно обработаны таниновой кислотой (ТК) или УА. Для уменьшения сжатия можно также использовать лиофилизацию. Создание проводящего покрытия и контрастирование осуществляют обычным способом [90, 147]. Более качественные результаты получаются, если используют лиофилизацию вместо ВКТ.
Следует учитывать, что морфология клеток заметно изменяется при взаимодействии с субстратом [90]. Последний должен не только обеспечивать прикрепление клеток, но и быть устойчивым к процедурам препарирования. Пластмассовые субстраты очень часто коробятся во время ВКТ и при воздействии органических растворителей. Для ТЭМ-исследований субстрат должен быть электронно-прозрачным.
Для ВТЭМ могут применяться пластиковые срезы толщиной 0.25-1.0 мкм, которые легко приготовить из залитых в смолу тканей. Наиболее оптимальной является смесь эпона с аралдитом, так как она более проницаема для красителей. Для получения УС не толще 0.25 мкм можно использовать алмазный нож, а для более толстых лучше применять стеклянные ножи. Срезы расправляются под воздействием паров ксилола. Ленты срезов желательно монтировать на бленды, покрытые формваровыми подложками, которые приготовлены из 05%-ного раствора формвара. Срезы лучше вначале отконтрастировать, а затем покрыть стабилизирующим слоем угля [296].
Можно из срезов удалить смолу, а затем подвергнуть их ВКТ. Для этих целей в качестве заливочной среды используют полиэти-ленгликоль, который легко извлекается из срезов водой. Однако получить хорошие срезы с помощью данного метода достаточно трудно. Объекты нередко заливают в полимер метилметакрилата, который обычно растворен в дихлорметане. После испарения растворителя при комнатной температуре получается довольно твердый пластик, позволяющий легко получитьУС. Пластмасса затем экстрагируется из срезов тем же растворителем. Этот метод сохраняет ультраструктуру объектов значительно лучше [158].
Для анализа в ВТЭМ можно использовать толстые крио-УС, которые после оттаивания подвергают ВКТ. Использование криос-резов имеет преимущества при иммуноцитохимическом анализе. Однако фиксация в этом случае должна быть мягкой, что дает возможность более точно локализовать антигенные детерминанты. На толстых УС, исследуемых в ВТЭМ, антигенных детерминант значительно больше, чем на обычных срезах.
Контрастирование объектов для ВТЭМ не имеет каких-либо принципиальных особенностей. Хорошие результаты достигаются при использовании в качестве контрастера 7.5%-ного раствора уранил-магнезиумацетата на воде в течение 2-4 ч при t=50®С и дальнейшем контрастировании с помощью ЦС в течение 20 мин.
В целом можно сказать, что весь арсенал методов для ТЭМ используют также и в ВТЭМ. Сочетание селективного окрашивания и ВТЭМ позволяет исследовать весьма толстые срезы (до 10 мкм) и получать информацию об их трехмерной организации. Окрашивание толстых УС для ВТЭМ требует гораздо больше времени, чем в случае УС. После контрастирования сеточки с толстыми УС для ВТЭМ желательно напылить углем с двух сторон для большей стабильности срезов под электронным пучком [220].
Глава 18 СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ НАТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Подготовка объектов для СЭМ нативных препаратов включает отмывание крови (при изучении сосудов), фиксацию препаратов, обезвоживание, высушивание, монтирование, формирование электропроводящего покрытия. Термином "нативные препараты" в СЭМ принято обозначать объекты (как свежие, так и фиксированные), поверхности которых не подвергались специальным физическим и химическим воздействиям (травлению или детергент-ному, ультразвуковому и химическому экстрагированию) [29, 30, 65, 303]. Мы рекомендуем во всех случаях при подготовке объектов для СЭМ использовать постфиксацию в ЧО. Это позволяет впоследствии получать удовлетворительные ТЭМ-изображения с тех же самых объектов (см. гл. 17, а также Приложение, 3.72, и 18.2).

18.1. ПОСМЕРТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

При исследовании секционного материала необходимо учитывать посмертные изменения. Так, рельеф поверхности эндотелия крупных артерий изменяется уже через 30 мин после смерти. В дальнейшем нарушения нарастают вплоть до появления к концу первых суток дефектов в эндотелиальном пласте. Процесс этот зависит от условий хранения трупного материала и от способа обезболивания. Ткани, взятые под эфирным и под нембуталовым наркозом, различаются по своей структуре [2, 23]. Требования к отмыванию и фиксации для СЭМ нативных препаратов были сформулированы ранее (см. раздел 1.35.1.1).
Для изучения в СЭМ внутренней поверхности микрососудов (и других полостей) желательно пользоваться перфузионной фиксацией. Замораживание и скалывание (срезание) таких объектов (см. ниже) позволяет вскрывать мелкие внутриорганные полости (например, просвет микрососуда) и обнажать отмытую люминаль-ную поверхность (например, эндотелия).

18.1.1. Иссечение объектов

Если осуществляется продольный разрез фиксированного сегмента аорты с последующим его прикалыванием к плоской поверхности, то в зонах входов в межреберные артерии возникают артефакты, в частности, образуются веретенообразные эндотелиоциты. Чтобы избежать этих изменений, рекомендуется делать два продольных боковых разреза и не подвергать образцы распластыванию. Если все же имеется необходимость в развертывании сосуда, то в процессе прикрепления нельзя растягивать сосуд, так как это приводит к появлению мельчайших складок. Еще более нежелательно расправление кровеносных сосудов до фиксации [23].
В отличие от крупных сосудов обнажение поверхности эндотелия микроциркуляторного русла сопряжено с большими трудностями. Наиболее простой способ - разрезание длительно фиксированных образцов лезвием бритвы. Однако поверхность сосуда в этом случае оказываетеся в глубине препарата. Кроме того, разрезание сопровождается образованием повреждений на линии разреза. Для получения ровного края и лучшего обнажения поверхности микрососудов предложен метод замораживания-раскалывания под жидким азотом. Как правило, для уменьшения кристаллизационных повреждений применяют криопротекторы. Замороженные объекты после раскалывания или срезания рекомендуется полировать с помощью мелкой наждачной бумаги [23]. Для стандартизации рельефа подлежащей изучению поверхности после пропитывания в криопротекторе (например, растворах ДМСО возрастающей концентрации) и замораживания сколотые поверхности объектов шлифуют пленкой, покрытой мелкими (0.3 мкм) частицами оксида алюминия и помещенной на охлажденную до t=-190®С медную пластинку [98]. Можно также исследовать серийные срезы (например, парафиновые), из которых удалена среда заключения. Для вскрытия и визуализации лимфатических сосудов применяют перекись водорода и микродиссекцию с последующей химической диссоциацией [320] (см. Приложение, 18.3) или вакуумную инъекцию [291].

18.2. ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И ВЫСУШИВАНИЕ

Обезвоживание принципиально не отличается от описанного ранее (см. гл. 3). Наиболее критическим этапом метода СЭМ нативных препаратов является высушивание.

18.2.1. Высушивание из жидкого состояния

В первые годы применения СЭМ в биологических исследованиях этот метод использовался повсеместно. Данный метод имеет, однако, очень серьезный недостаток. В процессе испарения жидкости, в которую погружен биологический объект, граница раздела фаз "жидкость-воздух" проходит через объект, поэтому он подвергается значительному механическому натяжению. Микроскопическая структура типа микроворсинки диаметром 1 х ю 5 см при высушивании на воздухе испытывает давление вдоль оси, равное примерно 28 атм [5, 65]. Даже при замене воды органическим растворителем с более низким поверхностным натяжением (ацетон, этанол и др.) действие последнего на объект при его высушивании на воздухе оказывается достаточным, чтобы обусловить, во-первых, сжатие объекта до 40 % от его первоначального объема, во-вторых, сглаживание рельефа клеточной поверхности в результате "полегания" и "слипания" различных поверхностных образований (микроворсинок, ресничек и т. п.), в-третьих, формирование ложных морфологических структур, имитирующих истинные прижизненные образования клеточной поверхности [23, 65].
В связи с опасностью возникновения указанных артефактных изменений высушиванию на воздухе в настоящее время подвергают лишь "твердые" биологические объекты (минерализованные ткани и др.). Однако до сих пор некоторые исследователи, несмотря на высокую артефактогенность, используют метод высушивания на воздухе (из жидкости). Так, предложено увеличивать механическую прочность клеток к высушиванию на воздухе путем инфильтрации тканей в сополимеризующейся смеси ГА и карбогидразида. Это не только улучшает выявление микрорельефа, но и позволяет получать УС. Данный метод имеет преимущества в иммуноцитохимии, катодолюминесценции, РМА [165]. Отмывать клетки в этом случае рекомендуется с помощью этанола. Неплохие результаты дает высушивание объектов из гексаметилдисилазана (коммерческое название Peldri II) и из тетраметилсилана [130].
Мы убеждены, что данный способ можно использовать только в том случае, если не ставится задача изучения микрорельефа поверхностей. Поэтому большей частью для высушивания тканевых объектов повсеместно используют методы, позволяющие избежать деформирующего действия поверхностного натяжения. Такими методами являются высушивание методом перехода критической точки (ВКТ) и высушивание из твердого состояния (сублимация).

18.2.2. Высушивание путем перехода критической точки

Наиболее широкое распространение получил метод ВКТ [65], который основан на переводе жидкости, содержащейся в объекте, в газообразное состояние сразу по всему объему объекта. Для этого жидкость с погруженным объектом помещают в замкнутый сосуд и подвергают нагреванию до температуры выше критической, после чего жидкость переходит в газообразное состояние и весь объект оказывается в газовой среде (высушенным). Таким образом можно избежать деформирующего действия сил поверхностного натяжения, стремящихся сократить поверхность раздела жидкость-газ, которая при высушивании на воздухе проходит как раз по поверхности образца, подлежащего исследованию в СЭМ.
Подвергать ВКТ обводненные объекты нецелесообразно, так как для воды характерны очень высокие значения критической температуры и давления. Поэтому воду в объекте необходимо заместить переходной жидкостью, обладающей значительно более низкими критическими параметрами. В качестве таковой используют сжиженные газы: углекислоту, фреон 13, закись азота и др. (табл. 5). Указанные жидкости плохо смешиваются с водой и прямо заместить ее не удается. В связи с этим фиксированный обводненный образец вначале подвергают обезвоживанию с помощью дегидратанта, который в свою очередь может замещаться промежуточной жидкостью, например амилацетатом, если переходная жидкость не смешивается с дегидратантом. В большинстве исследований в качестве переходной жидкости применяется углекислота. Наличие следов воды или этанола в углекислоте при ВКТ может привести к слипанию фибриллярных структур. Кроме того, углекислота не должна содержать примесей масла.

Таблица 5. Физические свойства веществ, используемых для ВКТ

Вещество	Критическая температура,®С	Критическое давление, атм
CO₂	31.1	72.8
N₂0	36.5	71.4
Фреон-13	28.9	38.2

В большинстве исследований в качестве дегидратанта (см. гл. 4) используют этанол, ацетон, этиленгликоль, 2,2-диметокси-пропан, а промежуточными жидкостями являются амилацетат, этанол, ацетон. Замещение воды с помощью этиленгликоля вызывает самые незначительные изменения в объеме объекта. Этанол менее токсичен и летуч, чем ацетон, удаляет меньше липидов, не так сильно изменяет объем объектов, легче смешивается с амилацетатом.
ВКТ осуществляют с помощью специальных аппаратов различной степени сложности - от полностью автоматизированных до полукустарных. Практически процедура ВКТ заключается в следующем. Объект, погруженный в промежуточную жидкость или в дегидратант, вносят в предварительно охлажденную (до 10-15®С или ниже) прочную металлическую камеру, в которую затем впускают газообразную переходную жидкость из баллона. Если это углекислота, то она поступает в охлажденную камеру под давлением около 60 атм и из-за разницы температур между баллоном и камерой происходит очень быстрое перетекание углекислого газа в камеру с мгновенным переходом в жидкое состояние внутри нее.
Однако чаще с помощью сифона в камеру напускают сразу жидкую углекислоту со дна баллона.
Для того чтобы избавиться от дегидратанта или промежуточной жидкости, проводят частичное "стравливание" переходной жидкости через выпускной клапан при сохранении поступления в камеру свежих порций переходной жидкости. Поступление ее в камеру в этот момент можно перекрыть, но в таком случае надо внимательно следить через окошко, чтобы уровень жидкости не опустился ниже поверхности образца.
Затем камеру вновь наполняют переходной жидкостью (жидкой углекислотой). Эту процедуру повторяют несколько раз, контролируя запах газа, выходящего из камеры. Тщательное и полное удаление промежуточной жидкости или дегидратанта является очень важным моментом для ВКТ. Поэтому, если их запах не исчез, процедуру надо повторить еще раз. При использовании дегидратанта или промежуточной жидкости, не имеющих запаха, количество стравливаний заведомо увеличивают. Если дегидратант или промежуточная жидкость удалены не полностью, то критическая температура смеси не будет соответствовать критической температуре чистой переходной жидкости и при переходе в газообразное состояние может произойти конденсация промежуточной жидкости или дегидратанта. Существует некий минимум содержания дегидратанта или промежуточной жидкости в переходной жидкости, ниже которого конденсация не происходит. Для смеси ацетона с жидкой углекислотой содержание ацетона не должно превышать 0.41 %, в смеси фреона-113 с фреоном-13 объемное содержание первого не должно быть выше 2.4 %. Это показывает, что при использовании комбинаций амилацетата с углекислотой или ацетона с углекислотой число необходимых "стравливаний" должно быть значительно большим, чем при комбинации фреона-113 с фреоном-13, причем фреон-113 как промежуточная жидкость имеет преимущество, поскольку при его использовании такое тщательное замещение не требуется [23, 65].
Большинство людей способны ощущать запах амилацетата в воздухе при концентрации 1 часть на несколько миллионов. Поэтому в случае амилацетата по запаху можно легко определить конец процедуры замещения ("промывания"). Однако амилацетат диффундирует гораздо медленнее, чем этанол. Поэтому при замене им этанола минимальное время замещения должно быть более 15 мин в каждой (3 : 1, 1 : 1, 1 : 3) смеси. Последнюю порцию амилацетата, из которой образцы переносят непосредственно в камеру установки ВКТ, рекомендуется (вместе с объектами) охладить до t=0®С. Ацетон, хотя и имеет характерный запах, однако в очень малых концентрациях определяется с трудом. Практически момент окончания "промывания" можно определять следующим образом: у выпускного клапана надо подержать фильтровальную бумагу и если после испарения сухой углекислоты она не будет влажной, то "промывание" закончено.
При использовании баллона с сифоном следует помнить, что в процессе замещения дегидратанта (или промежуточной жидкости) на переходную жидкость при закрывании выпускного клапана (при открытом напускном) и нагревании камеры жидкая переходная жидкость (например, углекислота) может быстро вытесняться обратно в баллон. В таком случае объекты высушиваются из жидкого состояния, что приводит к нарушению рельефа поверхности.
После полного удаления промежуточной жидкости (или дегидратанта) камеру, заполненную переходной жидкостью, герметизируют и нагревают до температуры, превышающей критическую. С подъемом температуры возрастает и давление в камере. По достижении критической температуры плотности жидкости в камере и насыщающего пара над ней становятся равными и граница между ними пропадает. Если температура поддерживается выше критической, то это состояние сохраняется, и газ может быть выпущен из камеры, причем объект останется сухим [65].
Очень важным моментом является степень заполнения камеры с помощью переходной жидкости. В случае частичного заполнения камеры жидкость при нагревании будет кипеть. А каждый пузырь, представляя собой границу раздела фаз, несет опасность повреждения объекта под воздействием поверхностного натяжения. При полном заполнении камеры во время нагревания давление будет возрастать быстрее и превысит критическое раньше, чем это произойдет с температурой. Поэтому желательно с помощью выпускного клапана поддерживать достигнутый уровень чуть выше критического давления, до тех пор пока температура тоже не превысит критическую. В этот момент камера содержит только газ, который можно выпускать. Следует избегать перегрева камеры для предотвращения растрескивания объекта [23, 65]. После высушивания выпуск газа из камеры должен производиться медленно. Быстрый выпуск может вызвать адиабатическое снижение температуры до субкритической и реконденсацию газа. О конденсации газа можно судить по запотеванию окошка. То же самое наблюдается и в момент, когда давление падает до уровня критического, если недостаточно полно удалена промежуточная жидкость (или дегидратант). Чем медленнее выпускается газ (при условии термо-статирования камеры), тем качественнее процесс высушивания. Быстрый выпуск газа может вызвать образование в объекте трещин и разрывов. При ВКТ образцы лучше держать исследуемой поверхностью вниз - она будет меньше загрязняться. Однако из-за сильного движения жидкости может происходить срывание некоторых частиц с исследуемой поверхности.
Очень ответственным является момент достижения критической температуры переходной жидкости. Если промежуточная жидкость или дегидратант удалены не полностью, то в момент достижения критической температуры при нагревании содержимое в камере мутнеет, а при выпуске газа в момент прохождения критического давления стекло камеры запотевает. Все это свидетельствует о неправильном режиме высушивания. В таком случае объект рекомендуется выбросить, поскольку рельеф поверхности будет искажен артефактным воздействием сил поверхностного натяжения.
В большинстве лабораторий используют следующую схему препарирования: вначале объекты обезвоживают в этаноле или ацетоне, затем погружают в амилацетат и помещают в маленькие перфорированные контейнеры. Последние очень быстро переносят в нижнюю половину камеры аппарата для ВКТ, которую немедленно закрывают крышкой, плотно прижимаемой к отверстию камеры. В этот момент нельзя допускать конденсации паров воды на внутренней поверхности охлажденной камеры и высыхания объектов (поэтому желательно на дно камеры налить немного дегидра-танта или промежуточной жидкости). В этот момент оба клапана камеры должны быть закрыты. После закрывания крышки надо быстро открыть впускной клапан, при этом жидкая углекислота под давлением проникает в камеру. Прибор должен показывать давление внутри камеры от 50 до 60 атм. Если показатель ниже, то либо имеется течь, либо баллон с углекислотой пустой [5].
Заполненную жидкой углекислотой камеру оставляют на 5-10 мин, для того чтобы амилацетат диффундировал в жидкую углекислоту. Выпускной клапан открывают, и смесь углекислоты и амилацетата выпускают в атмосферу. Процесс испарения необходимо контролировать через окошечко в крышке и не допускать обнажения поверхности объектов - они должны быть покрыты слоем жидкой углекислоты. Затем выпускной клапан закрывают, открывают впускной клапан. Камеру, которая вновь заполнилась жидкой углекислотой, опять оставляют на 5-10 мин. Весь процесс "промывания" повторяют несколько раз, до тех пор пока амилацетат не будет удален полностью. Для того чтобы диффузия амилацетата в углекислоту проходила быстрее, рекомендуется использовать магнитную мешалку [65].
После полного удаления амилацетата все клапаны закрывают, камеру нагревают до 39-42®С. Повышение температуры должно происходить медленно - не более 2®С/мин. Поскольку объем камеры стабилен, происходит переход углекислоты в критическое состояние, что можно заметить по потокам газа через окошко в крышке. Давление при этом достигает почти 90 атм. Если в камере перед нагреванием не осталось ни одного пузырька газа, то давление может быть и больше. Если при нагревании камеры не увеличивается давление, то это значит, что в камере находится не жидкость, а газ либо имеется течь. После достижения соответствующей температуры выпускной клапан чуть-чуть открывают (скорость выпуска не более 1-2 мл/с) и стравливают углекислый газ. Необходимо иметь возможность подогревать выпускной вентиль, в противном случае на нем может быстро нарастать сухой лед, мешающий градуальному выпуску газа [65].
Метод ВКТ не свободен от недостатков. В процессе обезвоживания и последующего ВКТ объект претерпевает существенные изменения в объеме. При низких концентрациях дегидратанта объект набухает, а затем прогрессивно сжимается. После завершения ВКТ сжатие может достигать значительных величин (до 60 % от первоначального объема), что иногда приводит к повреждению клеток. Метод ВКТ не только дает высокую степень усадки (до 60 % объема), но и ведет при неумелом использовании к возникновению разрывов и трещин в объектах, особенно неоднородных по своему составу. Например, в конфлюэнтных слоях клеток на пластиковой и особенно на стеклянной подложке растрескивание обнаруживается практически всегда. Для уменьшения усадки предложено после осмирования обрабатывать препараты 1-2%-ным раствором таниновой кислоты (ТК). Степень усадки можно снизить с 58 до 5 % путем добавления в фиксатор бычьей сыворотки и инкубации объектов перед высушиванием в растворах ТК и УА [23].
Перед удалением объекта из камеры надо подготовить эксикатор с влагопоглощающим веществом и быстро перенести туда образец. При ВКТ лучше использовать аппараты с окном в крышке, для того чтобы осуществлять визуальный контроль за процессом ВКТ. Баллон должен быть с трубкой, доходящей до дна, для извлечения жидкой углекислоты. В резерве необходимо иметь еще один полный баллон с углекислотой.
Если для заполнения камеры с объектами используется метод конденсации, то, поскольку стоящий на полу баллон с углекислотой имеет меньшую температуру, чем воздух в комнате, перед началом высушивания его рекомендуется немного подогреть (осторожно - высокое давление!) - температура камеры обязательно должна быть ниже, чем температура баллона. Для предупреждения конденсации влаги на стенках охлажденной камеры и образце рекомендуется всю процедуру проводить в специальной комнате с очень сухой атмосферой. При работе с аппаратом ВКТ надо быть очень осторожным. Желательно саму камеру поместить за специальный прочный прозрачный экран. Нельзя прямо заглядывать в окошко камеры, лучше делать это посредством металлического (а не стеклянного) зеркала. Нежелательно уходить от аппарата, до тех пор пока камера полностью не нагреется. При резком повышении давления, если температура камеры не достигла 40®С, рекомендуется посредством выпускного клапана сбросить уровень давления до 95-100 атм [5, 14, 23, 65].

18.2.3. Лиофильная сушка (высушивание из твердого состояния)

Метод высушивания из твердого состояния (лиофилизация) может быть реализован в процессе замораживания-высушивания или при заливке в вещество (например, камфен) с высокой теплотой сублимации с последующим вакуумированием. К сожалению, до сих пор методики лиофилизации страдают плохой воспроизводимостью, что связано с тем, что при низкой температуре (ниже -100®С) лед возгоняется очень медленно и в этом случае можно I работать с очень тонкими объектами, а при t > -100®С возникает неконтролируемый рост кристаллов льда.
Сублимация молекул воды из твердой фазы происходит в том случае, если их парциальное давление на замороженной поверхности превышает таковое в прилежащей атмосфере. Если вакуум достаточно высок, а объект окружен сухой атмосферой, то скорость сублимации определяется температурой объекта. Например, при t=0®С скорость сублимации равна 8.3•10^-2 г/(см²•с), а при t=-100®С она более чем в 100 тыс. раз меньше. Давление паров насыщения воды при t=-60®С составляет 8 х 10^-3Торр, а при t=-80®С уменьшается до 4х10^-4 Торр [65].
Сублимация льда в поверхностной зоне образца ведет к образованию слоя сухого материала, который тормозит дальнейшую сублимацию. Скорость сублимации экспоненциально уменьшается с увеличением толщины сухого слоя образца. Кроме того, при низкой температуре из объектов невозможно удалить связанную воду. Эта фракция воды удаляется только при повышении температуры. Поэтому для биологических образцов время лиофилизации в 20-100 раз превышает время сублимации чистой воды. В процессе лиофилизации желательно не допустить рекристаллизации воды. Критической в этом плане является t=-80®С. Быстрее подвергаются лиофилизации крио-УС, у которых очень высокая удельная поверхность [5, 14, 23, 65].
На практике в большинстве случаев сублимацию проводят в температурном интервале между -60 и -100®С. Чтобы не загрязнить поверхность объекта, высушивание обычно начинают при наиболее низкой температуре, на которую способен данный аппарат в течение нескольких часов, а затем медленно поднимают температуру до -60®С и ждут, пока объект не высохнет. Локальное низкое давление паров воды в вакуумной камере поддерживают с помощью ловушки с пятиокисью фосфора или с помощью охлаждения металлических поверхностей, окружающих образец, жидким азотом. На них же происходит конденсация загрязняющих камеру углеводородных паров. Монослой клеток при температуре от -65 до -70®С высушивается за 72 ч.
Часто выгоднее применить более сложный режим сублимации. Например, 6 сут объекты сушат при t=-150®С, 2 сут - при t=-100®С, затем температуру медленно поднимают до -70®С. После того как вакуум стабилизируется на уровне 1.5 х 10^-6, столик с объектами можно нагреть. Процесс высушивания легко контролировать посредством измерения вакуума. Если в объекте остаются следы воды, то небольшое повышение температуры немедленно приводит к ухудшению вакуума. Лиофилизацию для СЭМ можно осуществить с помощью простейших установок, используя замораживание объекта в последней порции дегидратанта [219].
Иногда применяют очень простой метод замораживания-высушивания: обезвоживание в этаноле, пропитывание 100%-ным t-бутанолом (при температуре от 27 до 30®С), замораживание в холодильнике, перенос в вакуумную камеру и сублимация. Поскольку бутанол растворяется в вакуумном масле, между камерой и насосом надо поставить ловушку, вымораживающую бутанол [84]. Можно осуществлять сублимацию после замораживания в абсолютном этаноле (t=-80®С, давление 1-2 Торр) [14, 23, 65, 205]. Для этих же целей рекомендуют ацетонитрил. В этом случае после обезвоживания в ацетоне при возрастающей его концентрации объекты переносят в ацетонитрил. Сосуд с объектами помещают на термоизоляционную прокладку в вакуумную камеру с достаточно мощным вакуумным насосом. При откачивании воздуха ацетонитрил замерзает и сублимируется [3].
Одним из методов выбора может служить замораживание и лиофилизация после дегидратации во фреоне TF, который является неполярным растворителем, замерзает при t=-35®С, не кристаллизуется при замораживании, легко сублимируется в вакууме. Для этого объект после фиксации обезвоживают в этаноле, который замещается фреоном TF при интенсивном перемешивании в ряду смесей фреона с этанолом (3 : 2 - 15 мин, 4 : 1 - 15 мин, в двух порциях 100%-ного фреона - по 15 мин). Затем берут алюминиевый стакан массой не менее 90 г и охлаждают в резервуаре, заполненном жидким азотом. Объект с помощью пинцета переносят в алюминиевый стакан под слой жидкого азота. Стакан помещают в вакуумную камеру, из которой откачивают воздух. После испарения азота объект объемом 1 мм³ становится сухим через 90 мин [216]. Наконец, для высушивания из твердого состояния применима и заливка в камфен с последующей его сублимацией в вакууме [65].
Метод лиофилизации является практически единственным методом контроля за адекватностью результатов, полученных с помощью ВКТ. Лиофилизация вызывает значительно меньшее сжатие объектов, чем ВКТ, однако во время сублимации могут происходить агрегирование внутриклеточных структур и утолщение их мембран, а также разрывы ткани, вызванные рекристаллизацией воды или дегидратанта. Кроме того, во время низкотемпературной заливки наблюдаются сжатие и перераспределение структурных элементов. При сублимации воды возможно выпадение на поверхности клеток аморфного осадка [23].
После высушивания сухие и гигроскопичные кусочки должны храниться в эксикаторе над пятиокисью фосфора или силикагелем либо в вакуумной камере или в атмосфере инертного газа (еще раз отметим, что силикагель при обводнении изменяет голубой цвет на желтый). После лиофилизации объекты можно подвергнуть низкотемпературной заливке. Очень часто для стабилизации высушенных объектов их обрабатывают в парах фиксирующего вещества.

18.3. МОНТИРОВАНИЕ

Прикрепление высушенных объектов к предметному столику можно осуществлять с помощью любого клея с низкой упругостью паров растворителя. Важно лишь, чтобы края препарата не отставали от столика. Соприкосновение препаратов с недостаточно подсохшим клеем может привести к пропитыванию объектов растворителем и полеганию рельефных образований. Возникающая при этом картина сходна с наблюдаемой при высушивании объекта на воздухе [5, 6].
Приклеивать осмированные объекты лучше с помощью электропроводящего клея, что, однако, не обязательно, если они не покрыты электроводящим слоем. В таком случае рекомендуется перед напылением сделать токопроводящие мостики с поверхности объекта из проволоки или из густого клея. После того как высушенные образцы приклеены к столику-подложке, а клеящее вещество высохло, их рекомендуется обдуть абсолютно сухим чистым воздухом, чтобы удалить пыль, налипшие крошки и тд.

18.3.1. Создание электропроводящего покрытия

Токопроводящие покрытия наносят одним из следующих способов: 1) осаждением на изучаемую поверхность металлов из растворов или паров; 2) обработкой поверхности антистатиками; 3) термическим распылением металлов; 4) ионным распылением металлов. Чем ниже ускоряющее напряжение микроскопа, тем меньшую толщину токопроводящего покрытия образцов нужно использовать [105, 293].
Осмирование поверхности осуществляется следующим образом: объект погружают на 10 мин в 1%-ный раствор гамма-тио-карбогидразида, промывают в воде, 20 мин обрабатывают 1%-ным раствором ЧО и подвергают дегидратации. Высущенные объекты можно дополнительно осмировать в сосуде с кристаллами ЧО в течение 24-48 ч, после чего их 1-2 ч выдерживают на воздухе для удаления избытка ЧО, затем препараты помещают над парами гидрата гидразина на 12-24 ч. Процедуру можно повторить 2-3 раза. В этом случае для приклеивания объектов необходим электропроводящий клей [48] (см. Приложение, 18.1).
Импрегнация солями металлов и обработка антистатиком в ряде случаев позволяют анализировать объект без напыления слоя металлов. Если объект зафиксировать в смеси, содержащей 2 % ГА и 2 % таниновой кислоты (ТК), а затем обработать ЧО, то можно получить отчетливое изображение без напыления даже при увеличении 10 тыс. и ускоряющем напряжении 25 кВ. ТК можно применять и непосредственно перед осмированием. Повторные обработки с помощью ТК и ЧО увеличивают электропроводность объекта, но могут загрязнять его поверхность. Существуют и другие способы металлизации поверхности препаратов [23, 48].
Для создания электропроводящего покрытия объекты перед лиофилизацией 10-60 мин обрабатывают тщательно отфильтрованным 5%-ным водным раствором антистатика. Если будет использован метод ВКТ, то лучше применять 10%-ный раствор антистатика в этаноле или изоамилацетате. После ВКТ рекомендуется напылить тонкий (0.3 нм) слой золота [23, 48, 65].
Большинство исследователей предпочитают методы распыления металлов: чаще ионное и реже термическое. Проводящая пленка из благородных металлов существенно увеличивает эмиссию электронов. Покрытие из других металлов этим свойством не обладает и быстро окисляется на воздухе. К недостаткам ионного распыления следует отнести значительное нагревание объектов. Имеются указания на образование на поверхности во время ионного напыления мелких ямочек. Возможно, это связано с разжижением липидов цитолеммы при нагревании. В качестве компромиссного варианта можно рекомендовать дробное ионное напыление. Из-за указанных недостатков некоторые исследователи рекомендуют пользоваться методом вакуумного термического распыления угля или металлов в условиях многоосевого вращения образцов [23].
При распылении сплава золота и палладия размеры гранул покрытия оказываются меньше, чем в случае чистого золота. Если образец осмирован, то его толщина в 5-15 нм является достаточной, если же нет, то толщина должна быть увеличена. Поверхность образцов можно напылять хромом. Катодное распыление металлов из-за сильного нагревания часто вызывает появление многочисленных трещин на поверхности образца. Возможно также загрязнение поверхности объекта вакуумными маслами и ее травление [105]. Для высокоразрешающей СЭМ лучше напылять объекты платиной, вольфрамом или ниобием. Во время термического напыления лучшие результаты достигаются при вращении объекта. Так, для достижения большего разрешения в СЭМ рекомендуется проводить напыление с помощью платины и углерода в аппарате Бальцерс (Balzers, Лихтенштейн) при вращении образца. В ряде случаев объект располагается под определенным углом к источнику распыления [150, 280].
На кремниевых подложках клетки заряжаются значительно слабее, чем на поверхности стекла или углерода. Поэтому толщина покрытия металлом может быть снижена до 2 нм. В некоторых случаях, когда изолированные клетки или частицы помещают на хорошо проводящую поверхность, добавочного их напыления не требуется [23, 65].

18.4. ПРОСМОТР ПРЕПАРАТОВ

Просмотр образцов в СЭМ может оказаться источником артефактов. Например, длительный просмотр одного и того же участка препарата в ряде случаев приводит к появлению отверстий типа кратеров и "выжиганию" объектов. Столик микроскопа необходимо тщательно протирать.
Использование поворотного устройства позволяет видеть и обратную сторону рельефных образований. Так, изменяя угол наклона объектного столика по отношению к электронному пучку от О до 90® и поворачивая столик на 360®, можно изучать клетки с обеих сторон. Применение встроенного в колонну микроскопа микроманипулятора дает возможность обнажать скрытые участки тканей. Для получения стереопар и последующей реконструкции трехмерного изображения один и тот же участок препарата фотографируют дважды с изменением угла наклона объекта по отношению к электронному пучку: снимок делают сначала в одном ракурсе, а затем объект поворачивают на 8-10®. Поле зрения должно оставаться тем же. Микроворсинки и микрореснички объекта должны "торчать" и быть отделенными друг от друга, что можно проверить с помощью получения стереопары [4, 5, 14, 23, 181].

18.5. МАРКИРОВАНИЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ

Наряду с общепринятым методом СЭМ нативных препаратов в ряде случаев используется метод маркировки межклеточных контактов с помощью импрегнации азотнокислым серебром. Им-прегнированные препараты можно проявлять обычными фотографическими проявителями. При импрегнации межклеточных границ восстановленные частицы серебра дают более высокую эмиссию электронов. Поэтому серебряные линии выглядят ярче окружающих тканей. При правильной обработке их толщина не должна превышать 30-40 нм. Импрегнация может проводиться как до фиксации, так и после нее. Следует иметь в виду, что при дофиксационной импрегнации могут повреждаться препараты. В большинстве современных работ сосуды импрегнируют после фиксации. Однако надо учитывать, что длительная фиксация значительно ухудшает качество препарата [5, 23].
Имеется обратная зависимость между длительностью фиксации и качеством импрегнации: с увеличением времени инкубации в фиксаторе линии серебра становятся более тонкими, затем прерывистыми и, наконец, совсем пропадают. Наряду с этим постепенно "проявляются" аргирофильные субэндотелиальные волокна, маскирующие межэндотелиальные границы. Так, например, фиксация в 2-3%-ном растворе ГА, продолжающаяся более 5-10 мин, практически исключает возможность качественной импрегнации. Однако очень часто провести импрегнацию сосуда через короткое время после фиксации не представляется возможным по тем или иным причинам (например, в патологоанатомической практике в связи с необходимостью продолжения вскрытия после иссечения сосуда).
Импрегнировать можно не только нитратом серебра, но и про-теинатом серебра. Однако если вначале зафиксировать, а затем обработать объекты протеинатом серебра, то импрегнации границ клеток не происходит. Обработка метенамином серебра не изменяет рельефа поверхности образца, что позволяет использовать наблюдения одновременно как в обратно рассеянных, так и во вторичных электронах. Импрегнированные пленочные препараты можно освободить от целлоидина и просмотреть в СЭМ - серебряные линии видны очень хорошо. [23, 31].
Разработан метод отсроченной импрегнации межклеточных границ эндотелия. Для этого фиксированный (не более 5 мин) сегмент сосуда помещают в изотонический раствор хлорида натрия, после чего проводят импрегнацию сосуда. Подобная инкубация сосуда в растворе хлористого натрия в пределах суток практически не влияет на качество препарата [31] (см. Приложение, 18.4 и 18.5).
Механизм избирательного отложения серебра в области межклеточных контактов неясен. Соответственно неизвестны и причины ухудшения качества импрегнации при длительной альдегидной фиксации материала. В настоящее время наиболее распространена следующая точка зрения: ионы серебра взаимодействуют с электроотрицательными участками клеток, которые сконцентрированы преимущественно в области межклеточных контактов. Отрицательный заряд в этих зонах обусловлен в свою очередь высокой концентрацией ионов хлора. По всей видимости, при длительной фиксации происходит "блокировка" активных центров связывания серебра в области межклеточных контактов, а инкубация в растворе хлорида натрия создает динамическое равновесие между находящимися в области контактов и в растворе ионами натрия и хлора [23, 31].
Глава 19 МЕТОДЫ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ ДИССОЦИАЦИИ
По отношению к тканям, клеткам и субклеточным структурам необходимо различать естественные (свободные), граничащие с жидкостью или газовой средой, и искусственные (закрытые, несвободные) поверхности [65]. Под последними понимают клеточные и тканевые поверхности, обнажающиеся только после специальной обработки тканей, т.е. их невозможно увидеть при стандартных методах подготовки объектов для СЭМ [45].
Для обнажений свободных тканевых поверхностей используют различные способы отмывания и перфузии полостных и трубчатых образований [23]. Другим подходом, позволяющим визуализировать рельеф полостей в глубине тканей, является применение коррозионных препаратов или их слепков [19] (см. гл. 20).
В ряду методов визуализации несвободных поверхностей особое место занимают подходы, основанные на принципах физико-химической диссоциации (ФХД) и избирательного экстрагирования тканевых компонентов. Общим для данной группы методов является использование таких процедур препарирования биологических образцов, при которых избирательно удаляются те или иные компоненты тканей или целенаправленно сохраняются определенные структурные элементы на фоне удаления всех других. Естественно, что все эти методы не должны изменять интактную трехмерную организацию и структуру поверхности обнажаемых тканевых структур.

19.1. КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ФХД

По принципу действия, положенному в основу препарирования тканей при их ФХД, мы выделяем следующие основные группы методов: 1) механофизическая диссоциация (разрыв, раскол, стирание, сдирание, трение, ультразвук, замораживание-скалывание, воздействие оксигенированной плазмой, повышение температуры, например автоклавирование для растворения коллагена, и т.д.); 2) химическая диссоциация (воздействие кислотами, щелонами, ферментами, комплексонами, например ЭДТА, и т.д.); 3) физико-химическая диссоциация (воздействие неионогенными детергентами, осмотическое воздействие и др.); 4) сочетанные методы воздействия [42].
С другой стороны, в основу классификации рассматриваемых методов подготовки образцов для СЭМ могут быть положены характер и особенности структур, визуализируемых в процессе препарирования: 1) методы визуализации внутриклеточных структур; 2) методы визуализации несвободных клеточных поверхностей; 3) методы визуализации поверхности неклеточных структур. При этом конечный этап подготовки образцов после реализации большинства указанных методов включает их высушивание, создание электропроводного покрытия и монтирование на столики. Все эти процедуры мало отличаются от тех, которые используются для сканирующей электронной микроскопии свободных поверхностей [23].

19.2. МЕТОДЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР

Строение субклеточных структур можно исследовать как с помощью платиново-углеродных реплик, так и посредством СЭМ высокого разрешения. Для этих целей используют замораживание-скалывание-высушивание [257] и(или) удаление эпоксидной смолы или парафина из объектов с последующим высушиванием [265]. Применяются методы замораживания-скалывания-фиксации-высушивания [166] и гипотонического вскрытия живых клеток с помощью разбавленного забуференного раствора с последующей фиксацией и высушиванием [189]. После раскалывания можно в замороженном состоянии осуществлять полировку полученной поверхности скола [46, 47, 344].

19.2.1. Вскрытие клеток

Для изучения внутренних структур клеток наиболее часто используют их вскрытие с помощью осмотического шока. Так, для исследования внутренней поверхности плазмалеммы монослой клеток, прочно прикрепленный к субстрату, промывают буфером и погружают в гипотонический раствор - клетки лизируются или отекают. Их смывают с субстрата. Оставшуюся на субстрате плаз-малемму префиксируют и метят, с нее изготавливают реплику.
Если разрушить мембрану клеток (например, с помощью разведенного раствора NaOH в течение 20 мин) и струей жидкости удалить содержимое клеток, то доступными для изучения становятся протоплазматическая поверхность плазмалеммы и примем-бранный цитоскелет. Для упрочения примембранного цитоскелета при препарировании клеточных монослоев посредством струи жидкости следует подложку с оставшимися клеточными мембранами проинкубировать в 0.01 М ФБ (рН 7.6, 20 мин) [22]. Наконец, если провести замораживание-скалывание, то можно исследовать Е-поверхность плазмалеммы [251, 271] (см. Приложение, 19.1).
Нефиксированные клетки, выращиваемые на покровном стекле, промывают в буфере (лучше цитратном) и накрывают вторым покровным стеклом, обработанным раствором полилизина (концентрация 1 мг/мл). При этом очень быстро происходит прочное сцепление клеток и покровного стекла. Разделение стекол приводит к разрыву клеток и обнажению их внутренней структуры, с которой можно получить реплику. После разъединения стекла с клетками помещают в фиксатор, обезвоживают и подвергают ВКТ.
Однако если клетку просто вскрыть, то компоненты цитоплазматического матрикса, растворенные в воде, будут маскировать внутриклеточные структуры. Существуют следующие способы экстракции мешающих наблюдению внутриклеточных компонентов и обнажения анализируемых структур: 1) мацерация разбавленными растворами 40; 2) экстрагирование неионогенными детергентами, например такими, как Тритон Х-100 и др.
Доказано, что разбавленные (0.1%-ные) растворы ЧО разрушают и экстрагируют белки из цитозоля [212, 344]. Такое действие сходно с эффектом гипохлоритов, окисляющих ткани при мацерации. Сохраняются липиды, липопротеиды, нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды. С помощью ограничения скорости и глубины осмиевой мацерации или замены ее водным промыванием можно сохранить цитоскелет. Метод осмиевой мацерации основан на том, что разбавленный раствор ЧО вызывает декомпозицию "сшитых" фиксацией цитоплазматических протеинов и удаление их с поверхности органелл. Внутримембранные белки предохраняются от мацерирующего действия раствора ЧО окружающими липидами. Однако мацерирующий эффект разбавленных растворов ЧО имеет свои пределы. Так, если ткани фиксировать 2%-ным (и более концентрированным) раствором альдегида достаточно продолжительное время (свыше 30 мин), то цитоплазматический матрикс при последующем препаровании растворяется очень медленно [345].
Наиболее широко в настоящее время применяется следующая схема препарирования: после кратковременной (в течение нескольких минут) перфузионной фиксации разбавленным раствором ГА и(или) ФА небольшие кусочки объектов пропитывают раствором диметилсульфоксида, замораживают, раскалывают, отмывают, постфиксируют в ЧО, в течение 3-4 сут мацерируют в 0.1%-ном растворе ЧО и готовят для СЭМ; для ускорения мацерации применяют периодическое воздействие микроволн через 1-се-кундные интервалы в течение 30-60 мин. Матрикс при этом удаляется быстрее, а температура не поднимается [195]. Данный метод дает возможность одновременно с анализом структур в СЭМ проводить и гистохимические реакции [195, 313, 345] (см. Приложение, 19.2).
Для обнажения внутриклеточных структур применяют абразивную механическую обработку объектов с помощью пленки, покрытой мелкими частицами оксида алюминия и помещенной на охлажденную жидким азотом медную пластинку. В этом случае после фиксации в ЧО объекты пропитывают криопротекторами, замораживают, шлифуют, подвергают мацерации, высушивают и анализируют в СЭМ.
Другим способом обнажения субклеточных структур и вскрытия нефиксированных клеток, выращиваемых на покровном стекле, является механический разрыв. Клетки промывают в цитоскелетстабилизирующем буфере и накрывают обработанным полилизином покровным стеклом так, чтобы оно контактировало с апикальными частями клеток. Через некоторое время стекла разъединяют (при этом отрывается апикальная часть плазмалеммы) и помещаются в фиксатор. Разорванные клетки затем обезвоживают и подвергают ВКТ. Из-за того что разрыв производится перед фиксацией, возможна денатурация белков. Этот метод особенно полезен для мечения цитоплазматических компонентов.
Фиксированные клетки можно вскрывать микродиссектором. Данная методика осуществляется с помощью липкой ленты. Клетки, прикрепленные к покровному стеклу или сеточке, фиксируют и подвергают ВКТ. Затем их прижимают к липкой ленте, которую сразу отдирают. При этом удаляется небольшая часть апикальной плазмалеммы, реже - почти вся клетка, что позволяет визуализировать внутреннюю поверхность базальной плазмалеммы с прикрепленными окаймленными везикулами и цитоскелетом.
Наконец, клетки могут быть подвергнуты быстрому замораживанию-скалыванию-оттаиванию в присутствии цитоскелетстабилизирующего буфера или фиксатора. Одной из возникающих проблем является кристаллизация воды. Криопротекторы в свою очередь оказывают токсическое действие на живые клетки.
Альтернативный подход к визуализации внутриклеточных структур представляет собой ионное травление Срезанной поверхности ткани, залитой в смолу [200]. Метод базируется на факте большей устойчивости мембранных структур клеток к действию оксигенированной плазмы по сравнению с цитоплазматическим матриксом. Под действием плазмы на срезе формируется псевдорельеф, отражающий реальные внутриклеточные структуры, но содержащий множество артефактов. Прибор перед использованием должен быть тщательно высушен, а температура плазмы не должна превышать 100®С [199]. В качестве газовой среды предпочтительнее использовать гелий или аргон. Ионное травление дает удовлетворительные результаты только для мембранных структур, хроматин и белковые структуры разрушаются.
Выявление фибриллярных внутриклеточных структур производится с помощью неионогенных детергентов [22].

19.2.2. Детергентно-экстрагированные препараты

Термином "неионные детергенты" (НД) обозначают поверхностно-активные вещества, способные осуществлять солюбилизацию компонентов цитолеммы. НД солибилизируют фосфолипиды из мультиламеллярной метафазы путем образования смешанных мицелл, которые могут включать мембранные липиды и белки. Это приводит к растворению и элиминации мембранных компонентов клетки [50].
При детергентном экстрагировании удаляются мембраны и другие компоненты клеток. Остаются только ядерная оболочка (точнее, прилежащий к ней слой гетерохроматина) и компоненты цитоскелета, с которыми ассоциированы белки и рибосомы. Как правило, экстрагированию подвергаются живые клетки. Поскольку фибриллярные формы компонентов цитоскелета в живых клетках находятся в динамическом равновесии с молекулярными формами, детергентное экстрагирование проводится в присутствии специальных цитоскелетсохраняющих буферных растворов, повышающих стабильность микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных филаментов (см. Приложение, 19.3). Для стабилизации микрофиламентов к раствору ГА добавляют таниновую кислоту (ТК) [44, 237, 342].
В данном разделе мы не анализируем процесс детергентного экстрагирования в присутствии фиксаторов из-за его чрезвычайной сложности и плохой воспроизводимости [93].
В большинстве исследований в качестве НД применяется Тритон Х-100. Контакт живой клетки с его раствором в течение не-, скольких секунд приводит к удалению липидов, содержащихся в клеточных мембранах. При этом клетка теряет цитолемму. Ее содержимое непосредственно контактирует с окружающим раствором, структурно незакрепленные растворимые белки со свободными концами вымываются. Предварительная фиксация клеток в ГА или других альдегидах делает цитолемму нерастворимой в растворе Тритона Х-100.
Метод детергентного экстрагирования целых клеток в сочетании с негативным контрастированием применяется для исследования цитоскелета. Комбинированная обработка клеток НД с последующим их ВКТ и использование ТЭМ, в том числе ВТЭМ, позволяют визуализировать трехмерную структуру цитоскелета. Сочетание детергентного экстрагирования со сверхбыстрым замораживанием, травлением и круговым напылением объектов позволяет исследовать цитоскелет на макромолекулярном уровне [22, 92].
ГА даже высокой степени очистки приводит к укорочению актиновых филаментов и их искривлению. Обработка ЧО и перман-ганатом калия разрушает актиновые филаменты. Микрофиламен-ты разрушаются во время постфиксации и при дегидратации. ЧО повреждает микрофиламенты, если ее концентрация превышает 0.05 %. Диаметр актиновых микрофиламентов увеличивается, если их защитить от разрушения с помощью ТК [104]. Однако показано, что система микрофиламентов легче обнаруживается при использовании ГА с низкой (0.1 %) концентрацией. Добавление ТК в префиксатор предохраняет микрофиламенты от разрушения. Защитным эффектом обладает смесь ферроцианида калия с 40.
Префиксация с помощью ГА-лизиновой смеси (2,5 % ГА, 50 ммоль/л лизинхлорида, 100 ммоль/л ФБ, рН 7.4, t=23®С, 45 мин) сохраняет цитоскелетные элементы после травления Тритоном Х-100. Лучшая визуализация микрофиламентов достигается при использовании гипотонического фиксатора.
Для стабилизации микрофиламентов и микротрубочек используют различные цитоскелетстабилизирующие буферы (ЦСБ) (см. Приложение, 19.3.2). В случае, когда величина рН приближается к нейтральным значениям, а ионная сила растворов соответствует физиологической или несколько меньше, наиболее важным действующим фактором в стабилизирующем растворе является концентрация ЭГТА, которая контролирует содержание свободных ионов кальция во время детергентного экстрагирования. Высокая концентрация ЭГТА (до 10 ммоль/л) предохраняет структурные компоненты цитоскелета от разрушения [22, 69, 92].
При экстракции в присутствии ПЭГ (молекулярная масса 20 000-40 000) сохраняются, практически все цитоскелетные структурные. В то же время экстракция в растворе, содержащем глицерин, приводит к разрушению сети микрофиламентов в активном крае и в кортикальном слое клетки, что делает доступной для изучения центральную часть клетки. Это позволяет создать условия избирательного удаления микрофиламентов, микротрубочек и промежуточных филаментов.
Наиболее часто для стабилизации цитоскелетных элементов употребляется ПИПЕС-буфер. ПЭГ (молекулярная масса 20 000) стабилизирует мембраны против действия детергента Бридж-58 (Brij-58). Условия, в которых стабилизируются микротрубочки, обусловливают стабилизацию и других компонентов цитоскелета.
Для уменьшения экстракции фибриллярных структур рекомендуется применять гомобифункциональные эфиры N-гидроксисукцинимида. Чем длиннее молекула бифункционального сшивателя белка, тем лучше стабилизирующий эффект вещества [237].
Среди факторов, которые определяют структуру и состав детергентно-экстрагированных клеток, следует отметить, во-первых, химическую природу детергента и состав растворителя (например, удаление кальция для стабилизации фибриллярных структур), во-вторых, обработку клеток бифункциональными сшивателями белков до и во время экстрагирования [237].
При использовании раствора Тритона Х-100, приготовленного на обычных буферах (ФБ, раствор Хэнкса, ФБФР и др.) без добавления тубулопротектантов, сохраняются лишь микрофиламенты, промежуточные филаменты и миозиновые фибриллы. Для сохранения промежуточных филаментов применяется последовательная обработка буферными растворами с низкой и высокой ионной силой. Можно добавить в буферный раствор с высокой ионной силой 05 % Тритона Х-100. Если же надо сохранить микротрубочки, то в раствор вводят 1 мкг/мл таксола (подробнее см.: [22]). При последовательном воздействии растворов с низкой и высокой ионной силой цитоскелет имеет тенденцию к отделению от подлежащего субстрата. Для сохранения Ф-актинсодержащих белков клетки после детергентного экстрагирования обрабатывают раствором саркозила, приготовленного на ЦСБ. Перед этим микрофиламенты дополнительно укрепляют погружением на 2-3 мин в раствор фаллоидина (10 мкг/мл). Микрофиламенты диаметром 2-3 нм удаляются как при воздействии саркозила, так и при попеременной обработке буферными растворами разной ионной силы. Для избирательной экстракции микротрубочек используют не содержащие ЭГТА растворы с добавлением 0.5 ммоль/л кальция, либо исключают из раствора тубулопротектанты.
Часто для анализа фибриллярных белков после детергентного экстрагирования используют специфическое маркирование. Так, микрофиламенты метят тяжелым меромиозином или раствором его субфрагмента S1 на ЦСБ. В процессе декорирования может происходить разрушение микротрубочек из нефиксированного цитоскелета. Однако, если обработка проводится быстро, существенных изменений в организации цитоскелета не наблюдается. Описаны методы специфического маркирования миозина с помощью антител. Разработаны методы идентификации других фибриллярных внутриклеточных белков [22].
Концентрация Тритона Х-100 варьирует в разных прописях от 0.1 до 2 % (чаще всего 0.5-1 %), время воздействия колеблется от 20 с до 15 мин. Естественно, что сравнение результатов, полученных разными исследователями, затруднено. Чем меньше концентрация Тритона и время экстракции, тем больше фибриллярных элементов цитоскелета сохраняется на препаратах. Не рекомендуется проводить экстракцию дольше 5 мин. Раствор Тритона Х-100 при концентрации 0.1-1 % быстро растворяет все липидсодержащие мембраны в клетках, хотя крупные цитоплазматические липидные капли не растворяются. При отсутствии добавок раствор Тритона Х-100 растворяет и белки. 8 последнее время стали использовать значительно меньшие концентрации детергентов [237].
Детергент Бридж-58 (Brij-58) действует на мембраны мягче и в меньшей степени растворяет белки. После воздействия его 0.2%-ного раствора в течение 5 мин экстрагируется меньше белков, чем при действии 0.1%-ного раствора Тритона Х-100 в течение 1 мин. Для выявления цитоскелета применяются и другие НД, например из группы сапонинов (0.1 %). Последний мало повреждает мембраны, но способствует вымыванию из клетки растворенных белков, формирует отверстия в плазмалемме.
Дальнейший ход препарирования в случае использования СЭМ не имеет существенных отличий: фиксация (фиксатор лучше готовить на ЦСБ), обезвоживание, ВКТ. Наиболее удачным методом напыления является катодное распыление золота, которое не повреждает элементы цитоскелета. Хорошие результаты получаются при использовании осмирования с помощью тиокарбогидразида. Из-за высокой гигроскопичности препаратов цитоскелета рекомендуется хранить их под вакуумом, либо в эксикаторе с силикагелем.
Подготовка образцов для ТЭМ после детергентного экстрагирования включает фиксацию, обезвоживание, высушивание и круговое напыление платиной под углом 30-45®. Ткань удаляют раствором гипохлорита (подробнее см. гл. 15).
Другой способ подготовки объектов включает в себя быстрое замораживание фиксированных или нефиксированных образцов, глубокое травление, напыление платиной при вращении объекта. Изготовленные реплики изучают в ТЭМ. После замораживания-высушивания объект можно исследовать в СЭМ высокого разрешения [342]. При ультраструктурном анализе цитоскелета метод лиофилизации дает лучшие результаты, чем ВКТ.
Для напыления рекомендуется использовать спуттерное напыление вольфрамом или ниобием с толщиной покрытия 1-3 нм [150]. Обработка препаратов с помощью 1%-ного раствора УА перед замораживанием увеличивает стабильность и контрастность клеток [22].
Таким образом, анализ внутриклеточных структур после детергентного экстрагирования может осуществляться как в ТЭМ с помощью реплик, так и в СЭМ высокого разрешения. Однако при исследованиях в СЭМ поверхности объектов быстро загрязняются. Реплики более стабильны и загрязняются в меньшей степени. Исследование объектов в СЭМ высокого разрешения довольно дорого. Реплики дешевле, а ТЭМ доступнее. СЭМ-анализ имеет преимущества при проведении иммуномечения, поскольку при изготовлении реплик возможна утеря частиц маркера, особенно КЗ. Однако СЭМ-анализ позволяет исследовать объекты с очень сложным рельефом поверхности, которые недоступны для получения реплик. Наилучшее разрешение цитоскелета достигается при использовании метода инвертированного контраста при СТЭМ, что позволяет выявлять как адгезированные на фибриллах металлические частицы, например гранулы КЗ, так и электронно-плотный материал в ядрах и цитоплазме [91].

19.3. МЕТОДЫ ОБНАЖЕНИЯ НЕСВОБОДНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ

Один из первых способов обнажения несвободных клеточных поверхностей заключался в обработке тканей раствором борной кислоты (см. Приложение, 19.4). После обработки борной кислотой фиксированные в ЧО образцы становятся хрупкими и при механическом воздействии (растирании) раскалываются по межклеточным контактам. Однако этот эффект отсутствует после фиксации в ГА и ФА, которые прочно "сшивают" клетки друг с другом. В то же время было замечено, что если ткани фиксировать в растворе ЧО более 12 ч, то они также могут быть разделены на клетки с помощью механического воздействия, однако поверхность клеток при этом значительно повреждается [358].
Значительным продвижением в развитии методов визуализации в СЭМ несвободных клеточных поверхностей стала разработка [144] метода мацерации фиксированных тканей с помощью воздействия горячего раствора НСl и с последующей ферментативной обработкой (чаще всего коллагеназой). К настоящему времени предложено довольно много модификаций метода, однако во всех сохранен главный принцип - комбинация горячей 8 М НСl с ферментативной обработкой (коллагеназой [143], трипсином [145], гиалуронидазой [266], эластазой [86] и др.).
Хотя пролонгированное воздействие горячей НСl и повреждает клетки, однако указанные режимы (8 М HCl, t=60®С) являются наиболее оптимальными [86]. Следует отметить, что при данной температуре кислота действует очень быстро и сильно, разрушая некоторые мягкие элементы тканей и клеток. Поэтому время обработки должно быть подобрано конкретно для каждой ткани и даже ее участка. Техника "НСl + коллагеназа" наиболее эффективна для удаления соединительнотканных элементов, главным образом коллагена. Механизм гидролиза коллагена соляной кислотой еще не совсем ясен, но можно полагать, что это происходит за счет кислотного гидролиза нескольких пептидных связей в молекуле коллагена. Нефиксированные образцы мацерируются быстрее, несколько медленнее идет мацерация тканей, фиксированных в формалине, еще медленнее - в ГА [143].
Серьезным ограничением метода остается проблема неполного удаления внеклеточного материала. Именно для этого препараты после воздействия НСl дополнительно обрабатывают одним из ферментов. Обнаружено, что неочищенная коллагеназа действует эффективнее, чем очищенная [143]. Использование эластазы улучшает качество препаратов и позволяет сократить время обработки в НСl [86]. Как и коллагеназ II типа, эластаза хорошо разрушает коллагеновые фибриллы, разрывая поперечные сшивки в молекуле коллагена и переводя полимер коллагена в мономерное состояние. Кроме того, она удаляет базальные мембраны. Предпочтительнее использовать очищенную эластазу из поджелудочной железы быка, которая наиболее стабильна при рН 4.0-12. Эластаза, имея малую молекулярную массу, глубоко проникает в сплетения соединительной ткани.
Для стабилизации препаратов во время мацерации в НСl применяется предварительное введение в сосуды инъекционной массы [55]. Можно вначале в микрососуды ввести ГА, затем инъекционную массу (см.: [19]), а после полимеризации провести коррозию в 10%-ном (реже в 20%-ном) растворе NaOH (2 ч, t=40®С) и в 8 М HCl (1 ч, t=40®С). Во многом аналогичный подход (сочетание целлоидиновой техники отделения эндотелия с воздействием коллагеназой) позволяет визуализировать базальнуго поверхность эндотелиоцитов [61]. В ряде случаев для визуализации и мечения базальной поверхности культивируемых клеток их монослой заключают в желатину при t=30®С, которую затем охлаждают, поднимают с подлежащего субстрата и переворачивают. Далее следует префиксация, мечение КЗ, высушивание и напыление.
Для обнажения скрытых клеточных поверхностей используется также ультразвуковое излучение [112], часто в сочетании с последующей диссоциацией соляной кислотой [321]. Кроме того, делались попытки применять ферменты и некоторые другие вещества и в случае нефиксированных объектов [264], однако быстро развивающиеся аутолитические повреждения существенно искажают результаты [353]. Наконец, предложено обрабатывать ультразвуком фиксированные объекты [339]. Для удаления рыхлой волокнистой соединительной ткани используется длительное воздействие раствором ЧО [322].
Новые возможности открыла методика пролонгированной полиферментативной диссекции длительно фиксированных тканей [210]. Сущность метода состоит в том, что образцы продолжительное время (более 8 недель) фиксируют в 10%-ном растворе ГА. Это в какой-то мере предохраняет в последующем клетки от переваривания ферментами. Вслед за тщательным отмыванием в воде препараты сутками инкубируют в различных ферментах (трипсин, пепсин, протеазы, проназы и т.д.). Указанная процедура оказалась эффективной для лизиса базальных мембран. Конечно, как и в других случаях, возможно образование артефактов: мелких пузырьков и дырочек в плазмалемме, число которых с увеличением времени воздействия возрастает [211, 212].
Перспективным для обнажения несвободных поверхностей клеток оказался метод спиртощелочной диссоциации. Первоначально эта техника была предложена для разделения мышечных клеток миокарда [8]. В дальнейшем она стала широко применяться при изучении клеточного состава сосудистой стенки [60, 277]. Для этих целей после микродиссекции фиксированные в альдегидах образцы обрабатывают раствором этоксида калия (равные объемы 30%-ного раствора КОН и 96%-ного этанола, t=37®С). Отщепление тех или иных клеток контролируют в супернатанте светооптически [59]. Обычно полная диссоциация происходит за 1.5-2 ч [277]. В последние годы для обнажения несвободных клеточных поверхностей применяют 5 М раствор КОН (t=60®С) в комбинации с методом коррозионных препаратов [203]. Для визуализации в СЭМ клеток костной ткани образцы костей декальцинируют в растворе ЭДТА и подвергают коррозии в растворе КОН [217].

19.4. МЕТОДЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ НЕКЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР

Наиболее удобным для визуализации в СЭМ неклеточным материалом оказался эластический каркас тканей. Химической основой всех методов визуализации эластина стала его значительная химическая инертность - он слабо реагирует не только с фиксаторами, но со многими другими веществами [335]. Например, при действии 0.1 М NaOH эластин разрушается очень медленно, тогда как коллаген быстро диссоциирует [312]. Возникший на этой основе метод выделения эластических структур основан на применении 0.1 М раствора NaOH при температуре 60-70®С и оказался для этих целей, судя по сохранности аминокислотного состава, одним из лучших [42] (см. Приложение, 19.6).
Метод мацерации в горячей щелочи позволяет удалять почти все неэластические компоненты тканей, хотя проэластин и незрелый эластин также могут разрушаться [335]. С помощью данной методики быстрее и проще всего диссоциируют нефиксированные образцы. Фиксация альдегидами пролонгирует процедуру, хотя при использовании формалина диссоциация идет быстрее, чем в случае применения ГА [363]. Для фиксации эластина предложено обрабатывать ткани отбеливателем [355].
Длительность воздействия горячей щелочи является наиболее сложным и неопределенным моментом методики. Так, показано, что через 2 ч мацерации ткани при t=75®С сохраняется часть коллагена, покрывающего в сосудах внутреннюю эластическую мембрану, а после 3-4-часового воздействия начинает растворяться сам эластин. Последний процесс резко ускоряется при повышении температуры до 100®С [123]. В то же время обнаружено, что масса эластического остова после удаления (например, в стенке сосуда) коллагена и гладких мышечных клеток остается стабильной в течение 7 ч. Не изменяются и размеры фенестр во внутренней эластической мембране [335]. Варьирование времени и условий препарирования может приводить к тому, что, например, поры во внутренней эластической мембране увеличиваются в размерах, число их возрастает, они могут остаться прикрытыми мембраной, либо иметь вид ямок [67]. Фиксация объектов в ФА в течение 20 мин и корродирование их в 2.5 М растворе NaOH (t=25®С) в течение 48 ч приводят к удалению клеток и обнажению соединительнотканных структур [275].
Для анализа эластических структур предпочтительнее метод замораживания-высушивания, поскольку ВКТ сопровождается значительным сжатием материала, которое для эластических волокон может превышать 60 %. Более того, эластин не фиксируется в ГА и поэтому после удаления других тканевых компонентов он изменяет свою пространственную организацию [362]. В то же время следует помнить, что сжатие объектов одинаково во всех трех измерениях и, следовательно, существенного влияния на пространственную упаковку эластического каркаса оно не оказывает.
Для уменьшения сжатия объектов при дегидратации тканей можно использовать обработку препаратов 05%-ным растворов УА в течение 60 мин [23].
Существует несколько модификаций метода, например концентрацию щелочи повышают до 05 М, используют обработку ультразвуком и автоклавирование (для лучшего удаления коллагена), а время реакции сокращают до 30 мин [122]. При данном режиме препарирования диаметр эластических фибрилл оказался сопоставимым с размерами интактных фибрилл, определяемыми в просвечивающем ЭМ, а рельеф поверхности соответствовал картинам, полученным другими методами. Использовалась также мацерация с помощью гуанидина и раствора NaOH [174]. Перспективным для паренхиматозных органов оказалось сочетание методов коррозионных препаратов и горячей щелочной диссоциации. К примеру, после заполнения сосудов латексом или другой инъекционной массой и фиксации в ГА их мацерируют в 0.1 М NaOH, а затем в 8 М НСl и вновь в NaOH [316, 363]. Латекс в этом случае выполняет роль каркаса, препятствующего спадению эластических структур.
При использовании данного метода следует учитывать возможность появления ряда артефактов. Если в нормальных условиях нитевидные эластические волокна анастомозируют со смежными и не имеют свободных окончаний, то их появление может свидетельствовать от артефакте препарирования. Артефактом является также складчатость эластического каркаса артерий [121, 256].
Обработка объектов горячим раствором щелочи позволяет сохранить эластин лишь в нефиксированной ткани, в случае фиксации в ГА эластин разрушается. Однако после этого, особенно при длительной экстракции, более устойчивыми к обработке горячей щелочью становятся коллагеновые фибриллы. Очень важным является контроль специфичности диссоциации. Для этих целей чаще всего используют ТЭМ и ПС. Применяются также контрастирование эластина с помощью ТК и обработка диссоциированных препаратов эластазой [297, 323, 362].
Указанные недостатки и определенная нестабильность метода горячей щелочной мацерации заставили исследователей искать другие пути визуализации эластических структур. Было предложено использовать для этой цели раствор горячей (t=60®С) концентрированной (87 %) муравьиной кислоты [366]. Данный метод позволяет мацерировать фиксированные объекты, что дает возможность осуществлять перфузионную фиксацию сосудов, сохраняя прижизненную пространственную архитектонику эластина (см. Приложение, 195). Преимуществом указанной методики является длительность процедуры: интегрированность эластической ткани в муравьиной кислоте сохраняется до 400 ч, что очень важно для определения оптимальных сроков, поскольку меньше опасность быстрого повреждения эластина. Для улучшения сохранности соединительнотканных структур после химического экстрагирования муравьиной кислотой препараты желательно обработать ТК [356]. В качестве корродирующего вещества используется также 15%-ный раствор азотной кислоты [343].
Для более точного топического изучения пространственной организации диссоциированных тканей объекты заключают в ПЭГ. После отвердения их разрезают в нужном направлении и месте и полируют, затем ПЭГ растворяют в воде, а объект готовят для исследования в СЭМ [362].
Техника химической диссоциации тканей быстро совершенствуется. Разработана методика избирательного удаления из тканей компонентов, мешающих СЭМ-анализу, с сохранением клеток, коллагена и эластина или только коллагена. Для того чтобы в ткани сохранился коллаген, используется обработка фиксированных в ГА объектов в 10%-ном растворе NaOH (4 сут, t=20®С) с последующей обработкой ТК и ЧО. Для удаления клеток из ткани и сохранения эластина и коллагена применяется обработка объектов 0.25-1%-ным раствором отбеливателя (5 ч, t,= 20®С), а затем окрашивание 1%-ным основным фуксином и 1%-ным метиленовым синим (по 5 мин). Для сохранения клеток применяется последовательная обработка кислотой (80%-ная НСl, 30 мин, t=60 РС) и эластазой (1 мг/мл эластазы в 0.5 М какодилатном буфере, рН 7.4, 3 ч, t=20®С) [362]. Варьирование режимов и способов экстрагирования позволяет дифференцировать различные внеклеточные структуры [131].
В настоящее время наиболее распространенным и эффективным способом обнажения базальных мембран является метод ацеллюлярного препарирования, основанный на одновременной обработке тканей ЭДТА, Тритоном Х-100 и дезоксихолатом натрия [110] (см. Приложение, 19.7).
Глава 20 СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ КОРРОЗИОННЫХ АНАТОМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Сущность метода СЭМ коррозионных препаратов (СЭМКП) состоит в заполнении полостей организма затвердевающими веществами, коррозировании биологических тканей и просмотре получаемых слепков в СЭМ [19, 20] (см. Приложение, 20).

20.1. МЕТОД СЭМКП СОСУДИСТОГО РУСЛА

20.1.1. Подготовка сосудистого русла

Заполнение кровеносных и лимфатических сосудов смолой, как правило, проводится после предварительного отмывания их от содержимого. Однако в ряде случаев, особенно при работе с аутопсийным материалом, предпочтительно вводить смолу в неотмытое сосудистое русло. Это обусловлено резко возрастающей чувствительностью переживающих эндотелиоцитов к повреждающему действию инициальной перфузии. Аутопсийный материал можно использовать, если он сохранялся при температуре 0-4®С не более суток.
Канюлирование сосуда удобно проводить полиэтиленовой канюлей, которую легко изготовить из полиэтиленового катетера путем его нагревания и последующего моделирования. Канюля обычно надевается на толстую инъекционную иглу и легко присоединяется к системе для перфузии или шприцу. В качестве промывающего раствора можно использовать физиологический раствор, растворы Тироде и Хэнкса, а также многие другие растворы внеклеточного типа. Низкое онкотическое давление подобных растворов при перфузии длительностью более 2 мин приводит к интерстициальному отеку, который мало зависит от величины перфузионного давления. Для предупреждения отека в указанные растворы рекомендуют добавлять 2-3 % декстрана, 2-5 % поливинилпирролидона или другого высокомолекулярного кровезамещающего вещества. Можно использовать коммерческие кровезамещающие растворы [10, 19].
Применяется прединъекционная фиксация разбавленными растворами фиксаторов (например, 2%-ный ФА). Для мягкой фиксации эндотелиальной выстилки кровеносных сосудов иногда вместо промывающего раствора используют 0.5%-ный раствор ГА на 0.1 М ФБ (рН 7.4). Одним из условий полного и качественного отмывания сосудистого русла является добавление в растворы гепарина (около 10 ЕД/мл). Перфузионное давление не должно превышать физиологическое, характерное для изучаемого органа.
Отмывание кровеносного русла считается полным, если цвет вытекаемой жидкости соответствует цвету перфузата. Орган при этом приобретает белесый оттенок. Однако из-за опасности развития интерстициального отека не рекомендуется проводить перфузию дольше 10 мин. Степень отмывания также можно контролировать путем экспресс-подсчета эритроцитов в оттекающем перфузате [10, 19].

20.1.2. Заполнение кровеносного русла инъекционной массой

Немедленно после отмывания, избегая попадания в систему пузырьков воздуха, в сосуды вводят подготовленную инъекционную массу (ИМ). Для введения смол имеется ряд приспособлений. Самое простое из них - это шприц, соединенный с манометром. Важным моментом в инъекции является контроль за величиной инъекционного давления. Однако в ряде случаев для контроля уровня давления достаточно пользоваться так называемым критерием сухого носа. Он основан на том, что в случае превышения физиологического давления из носа животного начинает выделяться пенистая жидкость. Инъекционное давление можно повышать только до момента начала транссудации в полости носа, после чего повышение давления немедленно прекращают. Естественно, что данный критерий нельзя применять при инъецировании изолированных органов и трупного материала. Инъекция заканчивается после полного заполнения сосудистого русла смолой, о чем чаще всего судят по появлению непрерывного потока ИМ из венозной системы.
Обычно инъецирование проводят через аорту под начальным давлением 200 мм рт.ст. (что на уровне почечной артерии составляет 90 мм рт.ст.), до тех пор пока не появятся первые 3-4 мл ИМ из полой вены на уровне сердца. В этот момент давление снижают до 20 мм рт.ст., а полую зену зажимают. Большинство исследователей предпочитают введение ИМ осуществлять с помощью шприца при надавливании поршня пальцами. Давление в проксимальных частях системы измерять нет смысла, поскольку оно не отражает реальной ситуации на уровне микроциркуляторного русла [10, 19].
В ходе инъекции полнота заполнения микроциркуляторного русла контролируется по заполнению (изменению цвета в случае цветной ИМ) микрососудов носа, склер, кончиков ушей животного или исследуемого органа. Полноту заполнения кровеносных капилляров, т.е. переход ИМ в венулы, удобнее всего наблюдать под бинокулярной лупой на выведенном сегменте брыжейки. Однако строгой корреляции между полнотой инъекции различных органов нет. Так, например, при хорошем заполнении печени легкие могут быть инъецированы плохо, и наоборот. Все это требует экспериментального подбора критериев заполнения кровеносного русла для каждого исследуемого органа.
Для предотвращения вытекания смолы из сосудистого русла после окончания инъекции лучше всего перевязать как артериальные, так и венозные сосуды, а при инъекции лимфоносного русла - лимфатические сосуды.
Некоторые ИМ вызывают спазм сосудов. Для его предупреждения рекомендуется добавлять в отмывочные растворы различные сосудорасширяющие вещества, например, 1х10^-7 г/мл папаверина, 0.5-1.0 % новокаина и др. Хорошо предупреждает сосудистый спазм добавление в промывающий раствор дроперидола (0.15 мг на 1 кг массы) и ионов магния. Спектр вазодилятаторов довольно широк, и необходимо подбирать препараты в зависимости от конкретного органа и цели эксперимента. Предварительная перфузия органа нагретым до 50-55®С промывающим раствором решает проблему спазма, но не является физиологической (см. гл. 2).
Предложен метод медленной инъекции смолы в условиях охлаждения. Для этого после отмывания крови орган охлаждают до 0®С и в течение 10 мин под небольшим давлением медленно вводят ИМ. Метод дает более полноценное заполнение сосудистой сети.
Для большинства органов разработаны модификации метода СЭМКП с целью наилучшего заполнения микроциркуляторного русла. Быстрое окрашивание легких при наиболее низком из возможных инъекционном давлении - первичный критерий для успешного получения коррозионных препаратов. В мышцах лучшее заполнение кровеносного русла достигается без промывания солевым раствором. Сама по себе инъекция ИМ в сосуды приводит к сокращению скелетной и сердечной мышц [10, 19].
Для заполнения кровеносного русла матки в левую маточную артерию и в левую вену вводят гибкие полиэтиленовые канюли. Правые сосуды плотно перевязывают на уровне матки. Матка должна оставаться влажной. Для уменьшения нарушений микроциркуляторного русла желательно избегать механических воздействий на нее. Нельзя допускать подсыхания поверхности органа - это ведет к нарушению микроциркуляции.
Очень важна стандартизация инъекционной техники. Лучшие результаты получены при инъекции, которая выполнена как можно быстрее после смерти. Например, в случае инъецирования удаленной во время операции человеческой матки нежелательно допускать ее охлаждения. Рекомендуется поддерживать t=37®С как самого органа, так и инъекционной массы. Наличие миом и других опухолевых структур затрудняет инъецирование. Промывание физиологическим раствором приводит к ухудшению результатов инъекции, поскольку из-за отека интерстиция происходит сдавливание кровеносных микрососудов. Установлено, что кровь можно вытеснять непосредственно с помощью ИМ с гораздо лучшими результатами. Нежелательно, чтобы время между наступлением смерти и началом инъекции превышало 12 ч [10, 19].
Для выявления мест разрывов микрососудов иссеченный орган можно проперфузировать разведенным раствором гематоксилина или другого красителя. Участки окрашивания межуточного вещества указывают на локализацию разрывов в стенке сосудов.
Направление потока крови в получаемых коррозионных препаратах можно определить с помощью инъекции микросфер. Сосудистое русло нефиксированных тканей и органов лучше заполняется смолой, однако в объектах, заполненных после фиксации, поверхность слепков содержит больше деталей.
При заполнении сосудистой системы через венозную сеть плотность получаемых слепков значительно выше, чем в случае заполнения сосудов через артерии [10, 19].

20.1.3. Инъекционные массы

Качество препаратов, воспроизводимость результатов и появление артефактов во многом определяются свойствами используемой ИМ. Можно сформулировать основные требования, которым должна отвечать идеальная ИМ: 1) гидрофобность; 2) низкая (5-10 сП) вязкость в мономерном состоянии и возможность ее увеличения до 500 сП; 3) возможность ее окрашивания без существенного изменения вязкости; 4) высокая скорость полимеризации при комнатной температуре, произвольно изменяемая в пределах 5-40 мин и более; 5) минимальная (до 1-2 %) усадка в процессе полимеризации; 6) резистентность получаемых слепков к действию кислот и щелочей; 7)устойчивость слепков под электронным пучком в вакууме; 8) биологическая инертность и нетоксичность; 9) возможность варьирования ригидностью полимера (от хрупкого до пластичного состояния); 10) электропроводность.
В зависимости от цели исследования в качестве ИМ можно использовать полиэфирные смолы (ПН-8, ПН-9 и др.), силиконовые резины, различного рода латексы, предполимеры метилметак-рилата (ММА), другие смолы акрилового ряда (ТГМ-3, норакрил и др.). Однако все они обладают теми или иными недостатками. В качестве ИМ используются ненасыщенные полиэфирные смолы (например, трилон, который полимеризуется при t=32®С, усадка не более 2 %). Предложена новая пластмасса Термокол [136].
Латексы имеют вязкость около 25 сП, они коагулируют при изменении рН. Например, сдвиг рН с 8.0 до 7.4 вызывает коагуляцию некоторых латексов. Из-за наличия в латексах частиц диаметром 0.1 мкм они довольно плохо выявляют внутреннюю поверхность сосудов. Успешно используется также полидиметилсилокса-новый каучук с вулканизатором - тетраэтоксиланом и катализатором холодного отвердения - октоаттом олова. На 10 мл каучука добавляют 0.3 мл тетраэтоксисилана и 0.1 мл окоата олова. Смесь перемешивают 1-2 мин. Время отвердения 20-25 мин при t=20®С.
Прекрасные результаты дает использование коммерческих смол: Батсон-17 (Batson-17) и особенно Меркокс-С (Мегсох-С). Среди отечественных ИМ наиболее удобны предполимер ММА, латексы, ТГМ-3. Сравнение различных пластмасс показало, что ММА дает усадку 20 %, а Меркокс - до 6 %. Из-за своей меньшей гидрофобности ММА рекомендуется для репликации влажных структур. ММА более резистентен по отношению к кислотам и щелочам, чем Меркокс. ММА стабилен при нагревании до t=44®С, а Меркокс - только до 33®С. Поэтому Меркокс не рекомендуется сильно нагревать. Обычно на 5 мл смолы Меркокс добавляют 0.1 мл ускорителя. Сосудистые сети типа "чудесных" (с двумя последовательными капиллярными сплетениями) хорошо наливаются, если в Меркокс добавить 20-30 % ММА. Инъекцию желательно осуществлять под умеренным давлением со скоростью 10 мл/мин.
ИМ Батсон-17 составляют из 25 мл мономера, 7.5 мл катализатора, 0.5 мл промотора (ускорителя) и 12 мл наполнителя. Для лучшей полимеризации коррозионный препарат рекомендуется нагреть до t=80®С. Обычная смола Батсон-17 имеет вязкость 261 сП, что слишком много для микрососудов скелетных мышц. Из-за высокой вязкости и невозможности контролировать инъекционное давление возникает много течей. Усадка у смолы Батсон не превышает 1 %. В ряде случаев используется другое соотношение компонентов: 20 мл мономера; 4 мл катализатора; 0.3 мл ускорителя; эту смесь затем перемешивают с 20 мл чистого ММА. Готовая смесь затвердевает через 1 ч.
Коммерческие метакрилаты, к которым добавлен гидрохинон в качестве стабилизатора, можно хранить при комнатной температуре. Очищенные метакрилаты легко полимеризуются при комнатной температуре, поэтому их надо хранить в холодильнике в темноте.
Для приготовления предполимера ММА коммерческий мономер очищают от гидрохинона путем 6-кратного встряхивания в делительной воронке смеси одинаковых объемов мономера и 3%-ного раствора КОН. Далее мономер отмывают от щелочи водой до исчезновения щелочной реакции и высушивают над прокаленным хлористым кальцием.
Если в качестве ИМ используют некоммерческий латекс, то перед началом инъекции его необходимо тщательно профильтровать 2-3 раза через 5-6 слоев марли [10, 19].

20.1.3.1. Очистка метилметакрилата

ММА наливают в делительную воронку, заполняя им 1/3 сосуда. Затем туда прибавляют такой же объем 5%-ного раствора соды или 3%-ного раствора КОН. Смесь несколько раз энергично встряхивают и оставляют в делительной воронке для отстаивания (при наличии в ММА стабилизатора - гидрохинона - раствор соды, скапливающийся внизу, приобретает желто-коричневый цвет). Раствор соды сливают. Добавляют новую порцию соды и повторяют весь процесс несколько раз, до тех пор пока отстаивающийся раствор не будет прозрачным и бесцветным. После этого ММА точно так же многократно промывают водой для удаления щелочи до нейтральной реакции последней порции воды.
Отмытый ММА содержит до 1 % воды, которую надо удалить. Для этого ММА фильтруют через сухую фильтровальную бумагу в склянку, содержащую несколько кусочков прокаленного кальция, склянку закупоривают, ММА оставляют на 1-2 сут для извлечения воды и снова фильтруют. Можно удалять воду и путем фильтрования через плотный бумажный фильтр с насыпанным в него прокаленным хлористым кальцием или сернокислым натрием. На дно сосуда также надо насыпать немного прокаленного хлористого кальция.
Для хранения очищенного ММА лучше использовать бутылки с двойными пробками и держать их в холодильнике. Прежде чем открыть взятую из холодильника бутыль, ее надо нагреть до комнатной температуры. Непосредственно перед употреблением можно снова профильтровать метакрилат через хлористый кальций. Очистка ММА может быть проведена и другими более современными способами в оснащенной химической лаборатории [10, 19].

20.1.3.2. Приготовление предполимера ММА

После очистки к ММА добавляют 1 % сухой перекиси бензоила (ПБ) и смесь нагревают на водяной бане до 87®С. Как только вязкость ММА достигает вязкости 15-20%-ного глицерина, пред-полимер быстро охлаждают. Чем выше температура хранения пре-полимера, тем быстрее повышается его вязкость. При нулевой температуре этот процесс растягивается на 1-2 мес. Поэтому готовое вещество хранится в холодильнике при t < 0®С. Вязкость предполимера ММА может быть уменьшена путем разбавления мономером или другими акрилатами, например гидроксипропил-метакрилатом.
Предполимеризация ММА может быть осуществлена и другим способом. ММА нагревают до вскипания (т.е. до 140-160®С). Для этого нужное количество метакрилата наливают в широкодонную колбу (столб жидкости не должен превышать 1-2 см) и нагревают на плитке. При этом происходит частичная полимеризация мономера, удаляются растворенные в нем газы и следы воды, которые создают серьезные помехи для перехода мономера в полимер. После вскипания колбу немедленно охлаждают в ледяной воде. Пред-полимер должен легко стекать каплями с опущенной в него и извлеченной стеклянной палочки. Перед инъекцией в нагретый после взятия из холодильника предполимер добавляют 1.5 % ПБ или двухлорной ПБ и оставляют на 10-12 ч до полного ее растворения. Для более быстрого растворения инициатор растирают стеклянной палочкой.
Согласно другой прописи в мономер добавляют 1 % ПБ и облучают УФ-светом с длиной волны 280-320 нм в течение 100-160 мин, периодически контролируя вязкость ММА. Для проведения предполимеризации ММА УФ-лампу помещают на расстоянии 3 мм от объекта. Полимеризация завершается в течение одной ночи.
Наконец, можно с помощью УФ-облучения предполимеризовать 20 мл ММА, его вязкость должна увеличиться до 2.3-4.0 сП (необходимо постоянно контролировать вязкость жидкости). Полностью ММА можно заполимеризовать с помощью УФ-облучения в течение 18 ч. В указанном количестве предполимера растворяют 250 мг ПБ. В отдельной чашке смешивают 7 мл гидроксипропилметакрилата и 0.4 мл диметиланилина. Перед самой инъекцией эти два состава смеси перемешивают.
В качестве инициатора можно применять чистую гранулированную перекись 1,2-дихлорбензоила, либо простую ПБ. Перед употреблением ПБ надо тщательно высушить на фильтровальной бумаге в эксикаторе или термостате при t=37®С в течение 30 мин. Для удобства работы можно использовать Люперко, которая представляет собой пасту, состоящую из 60 % ПБ и 40 % дибутилфталата (ДБФ) или равных их частей. Перекись бензоила должна храниться в темноте в этаноле. После добавления ПБ полимеризация ММА может происходить и при комнатной температуре, однако этот процесс идет медленно (несколько суток).
Для окрашивания ИМ обычно в нее добавляют сухие анилиновые красители (0.1 % судана, 0.1 % генцианвиолета и др.), не обладающие химической активностью [10, 19].

20.1.4. Полимеризация

Непосредственно перед инъекцией в предполимер ММА добавляют и тщательно перемешивают 1-2% ПБ и 2% диметиланилина (ДМА). Скорость полимеризации зависит от количества введенного ускорителя и активатора и составляет при данных условиях от 10 до 50 мин. Катализаторы отличаются от инициаторов тем, что они не входят в состав молекул образующегося полимера. Скорость реакции полимеризации пропорциональна квадратному корню из концентрации ускорителя. Полимеризация смолы сопровождается выделением тепла, что может служить признаком начала полимеризации.
Пластичность готовых слепков можно повысить путем добавления в ММА до 10 % ДБФ. Для предотвращения высыхания и деформации при этом органа полимеризацию желательно проводить под слоем жидкости. Указанное условие важно также и потому, что контакт с воздухом замедляет полимеризацию. Скорость полимеризации увеличивается при повышении температуры образца. Для удаления пузырьков воздуха из смолы перед началом инъекции рекомендуется помещать ее на 2-3 мин в вакуум.
Самым существенным артефактом полимеризации является усадка, степень которой у различных смол варьирует, а у рекомендованного нами предполимера ММА не превышает 1-2 %. Для точного определения степени усадки проводят полимеризацию ИМ в запаянной стеклянной трубке, а размеры полученного слепка сравнивают с таковым у трубки. Следует отметить, что степень усадки по всем направлениям одинакова и поэтому не нарушает топологических отношений между структурными элементами.
Для полной полимеризации смолы надо выдержать слепок в течение 5 ч при комнатной температуре [10, 19].

20.1.5. Коррозия тканевых объектов

В зависимости от используемой ИМ для растворения тканей применяют щелочи (20-30%-ные растворы КОН или NaOH), кислоты (HCl,H₂SО₄ и др.), гипохлорит натрия, ферментативное расщепление и другие мацерирующие процедуры. После окончания полимеризации ИМ объект помещают в мацерирующий раствор (обычно 25%-ный раствор щелочи при 50-60®С), в случае использования в качестве ИМ латекса объект корродируют в растворе соляной кислоты. Время процедуры зависит от вида ткани.
Небольшие блоки мацерируются в растворе едкой щелочи в течение 24 ч при t=40®С. Далее следуют промывание в воде в течение 12 ч и замораживание-высушивание. Особые затруднения вызывает коррозия фиксированных объектов. Для удаления нео-тмытого материала можно использовать ультразвуковые колебания в присутствии слабого раствора ионного детергента или кратковременные (3-5-минутные) воздействия 1 М НСl сразу после извлечения объекта из щелочи. Чередование кислоты и щелочи ускоряет процесс мацерации.
Растворение кости вокруг слепков можно производить с помощью 5-7%-ной трихлоруксусной кислоты, удаление возникающих газовых пузырей осуществляется путем осторожного промывания тонкой струей воды. В противном случае пузыри увеличиваются в размерах и могут повреждать объекты [10, 19].
Большие возможности предоставляет метод "дозированного травления", в процессе которого происходит неполная или избирательная коррозия тканевых структур. Как правило, ступенчатое
(дозированное) травление производят в растворах кислот или щелочей при возрастающей их концентрации. В каждой порции корродирующего раствора объект находится от нескольких минут до 2-3 ч в зависимости от его величины, вида ткани и цели исследования. Помимо-обычных коррозионных и мацерирующих сред при дозированном травлении можно использовать ферменты (трипсин, панкреатин) и детергенты, растворяющие лишь мембранные (липосодержащие) структуры. Можно применять не полностью очищенные высушенные реплики микрососудов для анализа в СЭМ. При этом создаются условия для визуализации некоторых структурных элементов стенки сосуда - выявляются распределение гладких миоцитов, архитектоника волокнистого каркаса и т.п. [203].
Следует помнить, что при использовании горячего раствора щелочи возможно частичное растворение плохо заполимеризованной ИМ. Разбавление же предполимера мономером может приводить к образованию характерного "изъеденного" рельефа поверхности.
Высушивание препаратов, если реплики достаточно ригидны, проще всего проводить на воздухе. Напротив, если полимер получился мягким, то этот метод вызывает коллапс сосудистых конструкций. В данном случае можно использовать ВКТ или замораживание-высушивание [10, 19].

20.1.6. Микродиссекция объектов

Диссекция органа для обнажения внутренних структур проводится перед началом коррозии, после высушивания реплик, во время просмотра объекта в СЭМ с помощью встроенного в колонну микроманипулятора. От качества диссекции во многом зависит, насколько информативна будет полученная картина. Предварительное просветление некоррелированных тканевых блоков позволяет выбрать нужный план для среза объекта и прицельного обнажения интересующих исследователя участков органа. При изучении пространственной организации сложно устроенных конструкций, например клубочков почки, рекомендуется растягивать реплики под контролем микроскопа. Эта процедура облегчается после размягчения объектов. В случае ММА объекты выдерживают в 100%-ном этаноле в течение 60 мин при температуре 30-40®С или же добавляют ДБФ в предполимер ММА. Для микродиссекции применяют луч лазера и встроенные в СЭМ микроманипуляторы. Чтобы предотвратить спадение слепков, используют метод лиофилизации.
Микродиссекцию объектов лучше проводить под слоем жидкости - они меньше повреждаются. Кроме того в теплой воде коррозионные препараты становятся более гибкими.
При диссекции коррозионных препаратов с целью получения хорошего сечения слепка их заключают в 20%-ный раствор желатины, замораживают в жидком азоте и раскалывают ударом лезвия ножа. Затем желатину, как и ткань, растворяют в 40%-ном растворе едкого натра. Можно после мацерации просто заморозить слепок в воде и с помощью микротомного ножа изготовить срезы толщиной 2-3 мм, которые затем полируют в жидком азоте на наждаке до получения гладкой поверхности. Наконец, коррозионные препараты можно поместить в третичный бутиловый спирт, заморозить (t=4®С), разрезать бритвой и лиофилизировать [263].

20.1.7. Подготовка слепков для исследования в СЭМ

Монтирование препаратов на столики осуществляется с помощью электропроводящих клеев. В случае слабого крепления коррозионного препарата к столику возможно движение ("качание") реплики. Для анализа препаратов в СЭМ необходимо, чтобы происходило удаление накапливающихся электростатических зарядов, т. е. требуется обеспечение электропроводности реплик (см. гл. 19).

20.2. СЭМ-АНАЛИЗ

При изучении препаратов в микроскопе мы рекомендуем вначале провести обзорный анализ реплики (выбор нужных зон, общая оценка качества заполнения исследуемой полости, регистрация артефактов), затем осуществить прицельный последовательный анализ по сегментам, а под большим увеличением - изучение рельефа. Наконец, желательно выявить специфику тканевой организации или органной специализации микроциркуляторного русла.
Следует, однако, помнить, что фотография, получаемая в СЭМ, только создает впечатление трехмерности. На самом же деле это лишь проекция трехмерного изображения на плоскость, поэтому истинные размеры и форма объекта в этом случае искажаются. Для получения трехмерной оптической модели используют методику получения стереопар.
Морфометрия трехмерных изображений может производиться только после реконструкции трехмерного объекта, что обычно завершается получением либо профильных диаграмм (пакет срезов, перпендикулярных поверхности объекта), либо контурных карт (серия срезов, параллельных поверхности образца). Однако технические сложности, возникающие при реализации этих способов, делают их неэкономичными для рутинных работ. Гораздо проще измерить тот или иной объект на стереопарах и по специальной формуле вычислять его реальные размеры.
На репликах микрососудов можно проводить последовательный анализ "тройников" - мест ветвления сосудов (измерение углов между ветвями, соотношений диаметров и т.п.), что может быть полезным при расчете гемодинамических параметров сосудистого русла. Можно измерять отпечатки эндотелиальных клеток: соотношение длины и ширины, угол отклонения от оси сосуда. Наконец, возможен анализ васкуляризации целостных органов путем определения объема целого органа до коррозии и после, однако для этого необходимо полное заполнение русла при физиологическом давлении и сохранение всего слепка.

20.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ

20.3.1. Маркировка межклеточных контактов

Метод основан на свойстве ионов серебра адсорбироваться на параплазмалеммальном покрытии клеток в области интерцеллюлярных стыков. Для этого после промывания органов последние перфузируют 0.05-0.1%-ным изоосмотическим раствором азотнокислого серебра (нельзя использовать буферные растворы, содержащие ионы, с которыми ионы серебра образуют малорастворимые соединения), а затем в сосуды вводят ИМ. Клеточные границы выявляются в виде линейных углублений вокруг ядер эндотелиоцитов.

22.3.2. Дифференцировка сегментов микроциркуляторного русла

Идентификация артериальных и венозных звеньев сосудистого русла может достигаться путем последовательной инъекции различно окрашенных порций ИМ. При этом под микроскопом контролируют тот момент, когда вторая порция достигает уровня артериол, после чего инъекцию прекращают. Для дифференцировки различных звеньев микроциркуляторного русла на слепках с успехом используют градиент формы и ориентации отпечатков ядро-содержащих зон эндотелиальных клеток или их контуров.
В ряде органов (например, сальник) при антеградном введении ИМ не всегда происходит универсальное заполнение всех сегментов сосудистого русла. В этом случае используют ретроградное введение ИМ через отводящие венозные сосуды, поскольку со стороны венулярного отдела практически нет сфинктеров. Однако при этом чаще возникает экстравазация ИМ.
В некоторых случаях для выявления особенностей микроангиоархитектоники рекомендуется частичное (до уровня прекапиллярных сфинктеров) заполнение сосудистого русла. Густые капиллярные сети при таком подходе не мешают изучению ветвления артериальных сегментов микроциркуляторного русла. Указанную цель легко реализовать, используя смолу повышенной вязкости.
При наличии специальных задач применяется двойная инъекция - одновременное заполнение различных полостей одного и того же органа, например сосудистых и воздухоносных полостей легких, что позволяет изучать их пространственные взаимоотношения.
Для выявления тканевых (интерстициальных) каналов можно рекомендовать несколько технических приемов, например введение ИМ непосредственно в интерстиций и стимуляция так называемых течей из микрососудистого русла. Последнего можно добиться предварительным введением гистамина для раскрытия межэндотелиальных контактов или заполнением микрососудистого русла ритмично сокращающегося органа, например сердца [10,19].

20.3.3. Одновременный анализ микрососудов с помощью СЭМКП и ТЭМ

После отмывания сосудистого русла от крови проводят кратковременную перфузионную фиксацию 0"5%-ным раствором ГА, затем в сосуды вводят ИМ, ее полимеризацию осуществляют в 2%-ном растворе ГА. Перед коррозией орган разрезают (или раскалывают после замораживания) на две части. Одну половину объекта готовят для ТЭМ, заключая ее в ИМ (например, в предполимер ММА). ПС и УС готовят непосредственно со срезанной (сколотой) поверхности объекта. Вторая половинка подвергается коррозии, а коррозионный препарат монтируют на столике срезанной (сколотой) поверхностью вверх. Таким образом удается проследить как пространственную архитектонику микрососудов, так и ультратонкую организацию их стенок. Введение с ИМ электронно-плотного вещества, например взвеси благородного металла, при параллельной стимуляции образования "течей" дает возможность использовать маркерные свойства ИМ. При этом сочетание методов СЭМКП с ТЭМ при использовании УС позволяет не только определять наличие и локализацию "течей" на слепках микрососудов, но и находить пути трансмурального транспорта маркера [3].

20.4. СЭМКП ДРУГИХ ПОЛОСТЕЙ ОРГАНИЗМА

Метод СЭМКП может быть использован для анализа и других полостей организма: воздухоносных полостей, спинномозгового канала, желудочков мозга, железистых протоков, семенных канальцев и т.д. Для получения коррозионных препаратов воздухоносных путей в трахею вставляют канюлю. Из легких с помощью шприца отсасывают воздух до их максимального спадения, затем в бронхи вводят ИМ таким образом, чтобы объем легких был равен прижизненному. Дальнейшие манипуляции те же. Важным применением метода СЭМКП является микроинъекция пункционных биоптатов различных органов [10, 19].

20.5. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ИЗОБРАЖЕНИЙ

Рельефные образования на слепках классифицируются следующими образом: 1) продольные складки, которые, как правило, располагаются на уровне мелких артериол и отражают наличие тонуса в клетках мышечной оболочки сосуда; 2) циркулярные складки к перехваты на уровне артериол чаще всего соответствуют локализации сфинктеров, отдельных гладких мышечных клеток или перицитов; 3) петлистая сеть мелких бороздок представляет собой отпечатки границ эндотелиальных клеток (при использовании метода маркировки межклеточных контактов) или волокнистого каркаса сосудистой стенки; 4) овальные или округлые углубления соответствуют отпечаткам ядросодержащей зоны эндотелиоцитов; 5) почкующиеся или грыжеподобные выпячивания представляют собой так называемые течи, или экстравазаты, ИМ; 6) глубокие шароподобные вдавления соответствуют прилипшим или неотмытым клеткам крови; 7) циркулярные колечки с заостренными концами, наблюдаемые обычно на слепках артериальных сосудов, соответствуют заполненным смолой ложам гладких мышечных клеток (это обусловлено тем, что течи ИМ проникают в соединительнотканные влагалища гладкомышечных клеток сосудистой стенки, что и дает картину циркулярных полосок).
Слепо оканчивающиеся концы коррозионных препаратов могут быть следствием неполного заполнения, сдавливания сосудов, их пролиферации или представлять собой сломанный слепок. Истинный капилляр в мышцах надо измерять на точке последнего деления артериолы, а конец его там, где он присоединяет другой капилляр и переходит в венулу или же под прямым углом входит в большую венулу.
При визуализации тканевых каналов ИМ часто заполняет лимфатические сосуды, которые надо уметь отличать от течей, распространяющихся по тканевым каналам. Сети лимфатических сосудов имеют вид цепочек баллоноподобных уплощенных структур-синусов, между которыми располагаются V-образные перетяжки, соответствующие клапанам. Кроме того, лимфатические сосуды топографически тесно связаны с венулярными сегментами микроциркуляторного русла. Основными рельефными образованиями лимфатических сосудов являются отпечатки клапанов, ядерные импрессии, расположение которых хаотично, и бороздки - отпечатки окружающих соединительнотканных волокон [10, 19].
Глава 21 Маркеры в электронной микроскопии (Глава подготовлена в соавторстве с М.Д.Рехтером)
Маркер (Мр) - это вещество или частица, хорошо выявляемые в ЭМ. Идеальный Мр должен отвечать следующим требованиям: 1) быть видимым и легко идентифицироваться в ЭМ соответствующего типа; 2) иметь определенный размер, форму или композицию; 3) быть стабильным по отношению к агрегации или деградации в растворах, используемых в процессе препарирования; 4) прочно связываться с объектом за счет сильного специфического связывания; 5) иметь минимальное неспецифическое связывание с клеточной поверхностью; 6) обеспечивать возможность количественного подсчета частиц; 7) позволять проводить исследования препаратов как в СМ, так и в ЭМ. Мр для СЭМ должны иметь определенные размер, форму или композицию, позволяющие опознать их среди других рельефных образований клеточной поверхности [182].
Все Мр можно разделить на три группы: 1) естественные электронно-плотные частицы (например, ферритин, гемоцианин, вирусы; последние две группы Мр чаще используют в СЭМ); 2) искусственные электронно-плотные частицы (обычно КЗ); 3) ферменты (чаще всего ПХ). По другой терминологии их относят к биологическим и синтетическим. Главным недостатком биологических Мр является их нестабильность при длительном хранении. Они могут быть подвержены денатурации, протеолитической деградации и агрегации. Синтетические же Мр стабильны и могут храниться длительное время.
К настоящему времени предложено множество биологических (ферритин, гемоцианин, ПХ, вирусные частицы, бактериофаги) и синтетических (полистирольные, метакрилатные, кремниевые, железные и декстран-железные комплексы и т.п.) Мр, а также ряд радиоактивных изотопов. Однако применение каждого из них имеет существенные ограничения. Особое место в этом ряду занимает КЗ, которое в настоящее время используется наиболее широко [62].

21.1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

Ферритин, железосодержащий белок - один из широко используемых Мр. В ЭМ частица ферритина выглядит как электронно-плотная частица с диаметром 5.5 нм. При малых увеличениях ферритин очень трудно идентифицировать. Увеличение его размеров и электронной плотности проводят с помощью реакции с ферроцианидом свинца или с помощью окрашивания УС субнитратом висмута. В последнем случае диаметр электронно-плотной частицы увеличивается в 2 раза за счет осаждения металлического висмута в обычно невидимой протеиновой оболочке [302].
Ферритин для маркирования ЭМ-объектов получают по следующей схеме: кристаллизация белка в 5%-ном сульфате кадмия, преципитация в 50%-ном сульфате аммония и ультрацентрифугирование. Замороженный или лиофилизированный ферритин не может быть использован в качестве Мр. Ферритин связывают с молекулой антитела с помощью бифункциональных реагентов, например толуол-2,4-диизоцианата. При высоких разрешениях ЭМ молекула ферритина выявляется в виде квадрата с уплотненными в углами [215].
Гемоцианин - пигмент из гемолимфы морских ракообразных и моллюсков. Молекула гемоцианина имеет циллиндрическую форму (диаметр 35 нм, длина 50 нм). В зависимости от ориентации молекула гемоцианина имеет округлую или прямоугольную форму и может быть легко идентифицирована. Он обладает высокой аффинностью к конканавалину А. Вместе с тем выявлено небольшое неспецифическое связывание гемоцианина с клеточной поверхностью. Замораживание вызывает необратимую агрегацию гемоцианина. Поскольку агрегация наблюдается даже в случае хранения при t=4®С, рекомендуется проводить повторную гель-хроматографию на сефарозе-2В непосредственно перед мечением.
Частицы комплекса декстран-железо обычно ковалентно связывают с IgG. Они имеют игольчатую форму и размеры 3-12 нм. Это свойство помогает отличать их от ферритина при двойном мечении [24].

21.2. ВИРУСНЫЕ МАРКЕРЫ

Вирусные частицы, в основном вирус табачной мозаики, используют как Мр в СЭМ. Они имеют характерную палочковидную форму и размеры 15-25 х 300 нм.
Бактериофаг Т-4 имеет гексагональную головку и длинный палочковидный хвост. Вследствие больших размеров он пригоден лишь в том случае, когда не требуется высокая разрешающая способность, например при сравнении интенсивности мечения различных эндотелиоцитов. Используются и другие растительные вирусы различной формы и размеров.

21.3. ФЕРМЕНТЫ

Применение ферментов в качестве Мр имеет определенные минусы. При этом, как правило, включаются две дополнительные обработки и соответственно два промывания, во время которых УС могут повреждаться. Кроме того, процедура окрашивания удлиняется и встает проблема блокирования эндогенной пероксидазной (или иной ферментативной) активности.

21.3.1. Пероксндаза хрена (ПХ)

Молекулярная масса ПХ 40 тыс., диаметр молекулы 5 нм, под ЭМ она невидима. Вследствие высокого содержания углеводов она обладает сильным сродством к молекулам маннозоспецифичных лектйнов. С помощью ПХ можно маркировать лиганды для СМ, ТЭМ, СЭМ. В последнем случае лиганд имеет вид частичек различного диаметра. Для присоединения ПХ к антителам чаще всего используют ГА (о методах конъюгации антител с ПХ см.: [66]). Для увеличения выхода продукта реакции (окисленного ДАБ) может применяться хлорид золота.
В процессе реакции на ПХ окисление ДАБ происходит на уровне аминогрупп, и после полимеризации ДАБ-полимеры выявляются в СМ как коричневый осадок. Для визуализации их в ЭМ аминореактивные группы используют для восстановления ЧО до осмиевой черни. Чтобы усилить реакцию на ПХ, инкубацию с ДАБ ведут в присутствии 0.01 М имидазола. Оптимум рН пероксидазной реакции около 5.0. Чувствительность метода в этой области рН действительно возрастает, однако продукт реакции может диффундировать из места своего образования и кристаллизоваться. В связи с этим реакцию обычно ведут при нейтральном рН. До смешивания с субстратом рН раствора имидазола доводят до нейтрального при помощи 1 М НСl.
Использование ПХ в качестве Мр имеет определенные недостатки: 1) продукт реакции на ПХ трудно отличить на контрасти-рованном УС; 2) он имеет тенденцию к диффундированию от места своего образования; 3) этот продукт часто маскирует окружающие структуры, затрудняя идентификацию ультраструктур [325].
Если при проведении иммуномечения наблюдается избыточная диффузия продукта реакции с ДАБ, то следует увеличить разведение сыворотки, сократить время обработки объектов в инкубационной среде или концентрацию в ней субстрата.
Для блокирования эндогенной ПХ применяют либо погружение препарата в 0.3%-ный раствор перекиси водорода в метаноле или в буфере, либо обработку объектов периодатом, борогидридом, нитроферрицианидом натрия или фенил гидразином.
Если перед проведением реакции на пероксидазу объекты были осмированы, то осмий желательно удалить с помощью насыщенного раствора метапериодата натрия. Если применяется режим постэмбеддинга, то после обработки в инкубационной среде и промывания УС желательно обработать в растворе 40 на биди-стиллированной воде (при такой обработке увеличивается плотность осадка ДАБ). Нельзя использовать буферные растворы ЧО, поскольку в этих условиях осмируются добавочные тканевые компоненты, что ведет к ошибкам в интерпретации результатов. По этой же причине сеточки лучше не контрастировать в УА и ЦС [116]. В процессе реакции на пероксидазу на ПС широко используют никелевое усиление (см. Приложение, 21.6).

21.3.2. Щелочная фосфатаза и гпюкооксидаза

Щелочная фосфатаза в качестве Мр используется редко, поскольку этот фермент часто встречается в тканях. Эндогенную щелочную фосфатазу блокируют инкубацией в 20%-ной уксусной кислоте. Напротив, достоинством глюкозооксидазы является то, что она отсутствует в животных тканях и нет необходимости блокировать эндогенный фермент.

21.4. СИНТЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ

Полистирольные и метилметакрилатные микросферы, несмотря на ряд преимуществ (стабильность, легко распознаваемая форма), используют редко вследствие их относительно крупных размеров и слабого нековалентного связывания с лигандами (например, с лектинами). Карбоксилирование полистирольных латексовых сфер улучшает их качество.
Сополимерные микросферы полимеризуются из ММА, гидроксиэтилметакрилата, метакриловой кислоты и этиленгликольдиметакрилатных мономеров. Размеры синтезируемых микросфер составляют от 30 до 340 нм. Поверхность сфер гидрофильна, что связано с наличием большого числа гидроксильных и карбоксильных групп. Гидроксильные и карбоксильные группы микросфер могут быть использованы для их ковалентного связывания с флюоресцирующими красителями, радиоактивными изотопами и лектинами. Включение коллоидной окиси железа в микросферы делает их доступными для анализа в ТЭМ.
Кремниевые микросферы со средним диаметром 13-5 нм синтезируют путем полимеризации кремниевой кислоты. Электронная плотность и форма позволяют использовать эти микросферы в качестве Мр для ТЭМ и СЭМ. С этой же целью предложены маннано- и декстран-железные комплексы. Однако значительная вариабельность размеров гранул и возможность агрегации снижают их качество как Мр. Особым родом Мр следует также считать радиоактивные изотопы. Выявление с их помощью лектиновых рецепторов строится на принципах метода ЭМ-АРГ.
Хорошее маркирование белков может быть достигнуто включением изотопов, например, ¹³¹I или ¹²⁵I. Однако интенсивное иодирование ведет к быстро усиливающейся инактивации. Иммуноавторадиографические методы обеспечивают получение хорошей контрастности. Недостатками их являются низкая разрешающая способность и необходимость больших временных затрат.

21.5. КОЛЛОИДНОЕ ЗОЛОТО (КЗ)

Применение КЗ в качестве Мр основано на целом ряде его преимуществ по сравнению с другими Мр: 1) частицы КЗ имеют высокую электронную плотность, что дает возможность контрастирования УС, следовательно, проведение гистохимической реакции не ухудшает качества препарата; 2) мелкие частички КЗ (3 нм) не маскируют ультраструктуры; 3) частицы КЗ дискретны, поэтому поддаются количественному анализу; 4) частицы КЗ располагаются точно в месте локализации исследуемого лиганда; 5) можно получать гранулы КЗ заданного размера, что позволяет одновременно метить две молекулы или более; б) взаимодействие КЗ с макромолекулой стабильно и не влияет на активность белка; 7) неспецифическая адсорбция КЗ незначительна; 8) размер частиц КЗ можно увеличивать с помощью серебрения, что существенно расширяет границы применения метода; 9) процедуры конъюгации с лигандами и мечения относительно просты; 10) КЗ обычно дешевле других маркеров; 11) при СЭМ КЗ отличается хорошей эмиссией вторичных электронов, поэтому наложение сигналов вторичных и обратнорассеянных электронов позволяет точно соотнести локализацию антитела с микрорельефом поверхности; 12) использование мечения КЗ и серебряного усиления на ПС обеспечивает хорошее выявление деталей и позволяет оценивать степень сохранности антигенов, что позволяет соотносить данные иммуно-ЭМ и СМ [171, 176, 191].
При анализе частиц КЗ получаемое в обратнорассеянных электронах изображение можно превратить в картину светящихся частиц на черном фоне [176]. С помощью КЗ метят микросферы, например из агарозы или желатины, а затем изучают их фагоцитоз. Очень часто после негативного контрастирования бывает трудно различить вирусные частицы, если у них нет четко опознаваемой структуры. Мечение КЗ позволяет решить эту проблему. Частицы КЗ имеют красный цвет и могут быть полезны как краситель для ловикриловых ПС. При необходимости окраска может быть усилена с помощью серебряного усиления. Трудностью в исследовании ПС с меткой из КЗ даже после серебряного усиления является низкая интенсивность окрашивания. С помощью темного поля можно добиться эффекта усиления за счет отражения света частицами металла - в этом случае объект светится. Еще большее усиление обеспечивает эпиполяризационная оптика [201].

21.5.1. Физико-химические основы получения комплексов белка с КЗ

Процесс получения КЗ как Мр включает три основных этапа: приготовление КЗ, связывание золота с белком, очистку и концентрирование продукта.

21.5.1.1. Получение КЗ

Можно выделить следующие методы получения КЗ: с помощью тиоцианата, белого фосфора, цитрата и таниновой кислоты (ТК), борогидрида натрия, цитрата, этанола, аскорбиновой кислоты [169] (см. Приложение, 21.1).
Чаще всего КЗ получают путем химической конденсации, основанной на реакции восстановления золотохлористоводородной кислоты, например с помощью цитрата натрия. Размеры частиц КЗ и соответственно цвет раствора (от оранжево-красного до темно-бордового) зависят от количества восстановителя. Изменяя его объем, можно получить золь с диаметром частиц от 10 до 150 нм. Чем больше добавлено цитрата, тем меньше размер частиц и соответственно светлее цвет коллоида. Следует отметить, что с увеличением размера растет гетерогенность частиц Мр.
Другие восстановители (аскорбиновая кислота, ТК и др.) позволяют получать частицы КЗ одинакового размера. Особенно стабильные результаты дает метод с низкомолекулярной ТК. Поскольку в ряде случаев образуется полидисперсный золь, для получения одинаковых частиц КЗ, например диаметром 8 нм, применяется центрифугирование в градиенте 10-30%-ного глицерина. Рекомендуется проводить фильтрацию и диализ полученного золя, что обеспечивает его стабильное хранение в течение нескольких месяцев. Частицы КЗ в коммерческих препаратах обычно монодисперсны с коэффициентом вариации размеров частиц не более 15 %.
Очень важным вопросом является адекватный выбор величины частиц КЗ. Частицы размером 20 нм хорошо различимы под малым увеличением, а частицы с размером 3-5 нм - только под большим. Выгоднее использовать частицы меньшего размера, так как они лучше стабилизируются белками, демонстрируют большую эффективность мечения, дают более интенсивное окрашивание при последующем серебрении. Частицы КЗ диаметром 15 нм наиболее удобны для исследования - они легко идентифицируются и не имеют недостатков, связанных с их пространственным расположением [62].
Существуют методы получения сверхмалых частиц КЗ, которые ковалентно связаны с Fab-фрагментом антител. Такая частица состоит из 11 атомов золота и имеет диаметр 0.9 нм. Расстояние от частицы до антигенного сайта около 4.5-5.0 нм. Они довольно глубоко проникают в крио-УС, однако, как правило, требуют серебряного усиления. Если размер частиц КЗ превышает 25 нм, то они начинают приобретать эксцентриситет и различные формы (пентагональную и гексагональную) [62].
При каждом изготовлении КЗ, как правило, 5-8 % частиц образуют агрегаты. Их можно удалить с помощью короткого центрифугирования. Крупные агрегаты частиц КЗ отражают наличие загрязнений либо обусловлены высушиванием раствора на стенках во время кипячения. Обычно это происходит в том случае, если во время кипячения объем раствора уменьшается более чем на 40 %. Агрегации можно избежать, если использовать чистые реагенты, посуду небольшого объема, во время кипячения применять обратный холодильник.
При увеличении температуры уменьшается размер частиц КЗ. Смешиваемые растворы желательно готовить ex tempore, обязательно фильтровать и интенсивно перемешивать [62].

21.5.1.2. Измерение величины частиц КЗ

Если в дальнейшем предполагается производить двойное мечение с помощью частиц КЗ разного диаметра, то точное определение их размера приобретает принципиальное значение, тем более что многие коммерческие препараты КЗ значительно варьируют по размеру частиц. Для этого используют спектрофотометрию раствора или осуществляют прямое измерение в ЭМ. Каплю раствора КЗ наносят на сеточку, покрытую формваром, и высушивают. Для улучшения прикрепления мелких частиц рекомендуется покрытые формваром сеточки обработать в 0.01%-ном растворе поливинилпирролидона (ПВП) в течение 15 мин, промыть их и окунуть на несколько секунд в каплю КЗ. При негативном контрастировании вокруг золотой гранулы наблюдается прозрачный ободок адсорбированного белка.

21.5.1.3. Стабилизация коллоида

КЗ - это лиофобный коллоид (золь), частицы дисперсной фазы которого состоят из золотого центра (т. е. собственно гранулы золота), окруженного адсорбированными ионами, которые обусловливают отрицательный заряд частиц. Стабильность коллоида (без добавления молекулярных стабилизаторов) определяется зарядом этих ионов и соответственно электростатическим отталкиванием частиц При увеличении ионной силы раствора слои гидратной оболочки сжимаются, позволяя частицам сблизиться друг с другом. Если сближение достигает критического уровня, то происходит их слияние и коагуляция коллоида. Добавление белка может защитить (стабилизировать) коллоид от агрегации [62].
Поскольку частицы КЗ не содержат на своей поверхности реакционных групп, белки физически адсорбируются на ней. Наиболее важную роль при этом играет электростатическое взаимодействие.
Из общих соображений следуют по крайней мере два практически важных вывода: 1) белок не вступает в химическое взаимодействие с Мр и, следовательно, его структура и биологическая активность не нарушаются; 2) для предотвращения коагуляции коллоида электролитами белок перед добавлением в раствор должен быть обессолен.
Однородность частиц КЗ зависит от тщательности приготовления растворов. При конъюгации КЗ с антителами последние присоединяются к частицам золота за счет нековалентной адсорбции.
Минимальное количество белка, необходимое для стабилизации КЗ, можно установить следующим образом: к постоянному объему (1 мл) раствора КЗ с точно определенным размером частиц при оптимальном рН доливают 0.1 мл белка при серийных разведениях, а через несколько минут - 100 мкл 10%-ного раствора NaCl. Процесс флоккуляции оценивается спектрометрически (максимум поглощения 510-550 нм). Количество белка, которое способно предупредить флоккуляцию, и является искомой величиной. Однако указанное количество зависит от размера частиц. Как правило, белок добавляют с избытком в 10-20 %. При конъюгации КЗ с первыми антителами желательно использовать реагенты в соотношении 1:1.
Свежеприготовленный раствор КЗ может храниться при t=4®С в стерильных условиях без потери стабильности. Меченные белком частицы КЗ могут быть лиофилизированы для длительного хранения или очищены с помощью жидкостной хроматографии или путем фракционирования с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы.
При работе с лектинами частицы КЗ можно вначале связать с овомукоидом (белок, специфически связывающийся с некоторыми лектинами, например лектином зародышей пшеницы и церулоплазмином, а также фетуином и ПХ).
Растворы КЗ не рекомендуется хранить более года.

21.6. СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЗ

Все реакции с использованием КЗ можно разделить на прямые и непрямые.
Прямой метод включает лишь один этап - обработку препаратов меченым лигандом, поэтому его основными преимуществами являются простота и быстрота проведения реакции. Недостаток его состоит в необходимости специального приготовления каждого меченого белка. Однако если конъюгация с такими Мр, как ферритин или ПХ, технически трудна, то связывание большого числа различных молекул с КЗ однотипным методом не представляется сложным и существенно расширяет возможности прямого выявления рецепторов и макромолекул. КЗ стабильно связывается с иммуноглобулинами, гормонами, нативными и ацетилированными липопротеидами, лектинами (62, 169].
Например, непосредственно связываются с КЗ лектины клещевины, арахиса, сои и улитки. Однако не все лектины способны стабилизировать золь золота. Если это вызвано наличием в препарате белка примесей, то дополнительная его очистка может привести к положительному результату. Если же защитного действия лектина недостаточно для стабилизации коллоида, то мечение становится невозможным. Конъюгирование КЗ с различными энзимами позволяет выявлять локализацию специфичных для данного фермента субстратов (см. гл. 9).
Непрямой метод состоит во взаимодействии первого немеченого лиганда с мишенью и в последующем выявлении его с помощью второго меченого лиганда, специфически связывающегося с первым.
Достоинство такого подхода заключается в возможности использования одного или нескольких меченых реагентов, что значительно снижает объем подготовительных работ. Особенно широко непрямой метод используется в иммуногистохимии, так как антисыворотки обычно имеют высокий титр и авидность. Кроме того, существенно повышается чувствительность реакции, так как с каждой молекулой первого антитела могут связываться две меченые молекулы антииммуноглобулинов [54].

21.6.1. Конъюгирование макромолекул с КЗ

При конъюгировании лиганда с КЗ используют фирменные препараты либо белки диализируют против трижды дистиллированной деионизированной воды или низкомолекулярного Трис-НСl буфера. Хорошие результаты дает гель-фильтрация на сефадексе Г-25. Если происходит коагуляция золя при добавлении белка или белок не соединяется с КЗ, то рекомендуется определить оптимальные условия адсорбции белка. Для адсорбции имеет значение дзета-потенциал частиц, растворимость белка, рН и поверхностное натяжение на границе частиц золота и воды. Изменение рН может менять заряд белковой молекулы. Тогда как заряд частицы золота от рН не зависит. Следовательно, результирующая рН отражает изменения физических характеристик белка, что является ключевым моментом неудовлетворительной адсорбции. Максимальное связывание и наибольшая стабильность комплекса достигаются при рН, несколько превышающей изоэлектрическую точку белка. Если рН золя не подобрано тщательно, то наблюдается его флоккуляция. Это проявляется в изменении цвета раствора до пурпурно-синего и появление при центрифугировании черного налета Г на стенках пробирки без образования красного осадка [62].
Итак, перед добавлением белка раствор КЗ доводят до нужного значения рН (рН свежеприготовленного раствора 5.5). Берут пробную порцию раствора (2-5 мл) и измеряют рН. Чтобы золото не оседало на стеклянном электроде, его стабилизируют 10%-ным раствором поливиншширролидона или 1%-ным раствором ПЭГ. Подщелачивают раствор до нужных значений с помощью 0.2 М раствора К₂СО₃. Затем белок в виде тщательно обессоленного водного раствора добавляют к коллоиду. Белок должен стабилизировать золь, сделав его соответственно устойчивым к воздействию электродов. Поэтому эффективность адсорбции белка определяется добавлением к 0.5 мл полученного раствора 0.1 мл 10%-ного раствора NaCl. При этом цвет не должен меняться на фиолетовый. На последнем этапе адсорбции белка к КЗ можно для предотвращения агрегации добавить ПЭГ. Успешное связывание белков с КЗ возможно не только в воде, но и в различных буферах, например ФБ или Трис-HCl. Меченный золотом белок можно хранить при t=4®С с добавлением азида натрия в качестве консерванта-антисептика [62] (см. Приложение, 21.2 и 21.3).
Для очистки и концентрирования комплекса белка с КЗ раствор центрифугируют со скоростью 300 об./с в течении 1 ч. Бесцветный супернатант отсасывают, а осадок суспензируют в ФБФР в объеме, составляющем 1/10 объема исходного раствора. Непосредственно перед употреблением раствор центрифугируют при частоте вращения 33 об./с в течение 10-15 мин для удаления крупных агрегатов частиц КЗ и используют прозрачный супернатант. Рекомендуется освобождаться от крупных агрегатов дважды: до и после ультрацентрифугирования. С этой целью используют также фильтрование через миллипоровый фильтр с диаметром пор 0.2-0.22 мкм, предварительно обработанный ПЭГ и сывороточным альбумином для снижения адсорбции белка. При этом на мембране должно остаться незначительное количество материала. Окрашивание фильтра в красный цвет свидетельствует об агрегации частиц.
Данный способ особенно полезен в случае применения очень маленьких частиц КЗ или очень крупных белковых молекул. Кроме того, возможно получение нескольких хроматографических фракций и выбор лучшей из них с помощью бумажной цитохимической модельной системы [62].
Раствор желательно использовать в течение нескольких суток. Его можно хранить некоторое время в пластиковых или парафинированных стеклянных пробирках при t=4®С. Для длительного хранения лиофилизированного комплекса к нему добавляют 1/9 часть водного раствора, содержащего 100 мг/мл ПЭГ-20000 и 5 % Твин-20. Раствор трижды по 1 ч диализируют против 1000-кратного объема 5%-ного раствора NH4HCO3. Затем 5 мл диализированного раствора замораживают в смеси сухого льда с этанолом, лиофилизируют в течение ночи и хранят при t=4®С в пластиковых пробирках с силикагелем. Перед употреблением к лиофилизированным образцам добавляют исходный буфер. Для удаления агрегатов применяют центрифугирование при 5000-8000 об./с в течение 10 мин. Замораживание-высушивание и длительное (до 6 мес) хранение не инактивируют белок в комплексе с КЗ.
Непосредственно перед употреблением биологическая активность белка может быть проверена в реакции агглютинации, при радиоиммунном анализе или с помощью простой "бумажной" цитохимической модельной системы. В последнем случае на лист фильтровальной бумаги наносят несколько капель раствора антигена. После высушивания лист фиксируют в формальдегиде. Затем проводят цитохимическую реакцию с последующим серебрением. Результат оценивают макроскопически. Отметим, что иммуноглобулины не всех видов животных прочно связываются с КЗ.
Для обнаружения пектинов, которые не могут стабилизировать золь КЗ, разработаны реакции связывания с глюкопротеидами, меченными КЗ.

21.6.2. Особенности ЭМ-выявления КЗ

Частицы КЗ диаметром от 5 до 50 нм могут быть визуализированы с помощью СЭМ во вторичных электронах. Частицы диаметром 13 нм легко идентифицируются в современных в СЭМ. С помощью СТЭМ удается визуализировать частицы золота диаметром вплоть до 0.8 нм.
При анализе меченных КЗ объектов в СЭМ следует учитывать следующее: 1) число частиц КЗ, выявляемых с помощью обратно-рассеянных электронов, значительно больше, чем при использовании вторичных электронов (соответственно количественная оценка должна базироваться только на обратнорассеянных электронах); 2) смешанное изображение в обратно- и вторичнорассеянных электронах позволяет наряду с анализом строения поверхности клеток оценивать количество мест связывания КЗ; 3) рельеф клеток сохраняется удовлетворительно при условия префиксации в 0.1%-ном ГА в течение 10 мин; 4) префиксация в ГА почти полностью блокирует перераспределение и(или) интернализацию меченных золотом комплексов антиген-антитело.
Для подготовки к СЭМ при использовании КЗ вместо обычного осмирования предпочтительнее применять метод с многократными чередующимися обработками в 40 и в тиокарбогидразине (ОТОТО-метод), поскольку в этом случае после СЭМ-анализа препараты можно исследовать в ТЭМ.
При работе с КЗ количественный анализ сводится в основном к оценке частиц в разных участках объекта. Для этой цели удобно пользоваться отношением числа частиц золота к площади поверхности. Это отношение определяет плотность метки [62].

21.7. АРТЕФАКТЫ

Слабое окрашивание (когда часть рецепторов не связывается с меченым лигандом) возможно в случае конкуренции немеченого белка с меченым, недоступности рецептора, а также при снижении биологической активности комплекса лиганда с КЗ.
В процессе связывания КЗ с белком не исключено образование многослойной белковой "скорлупы" вокруг золотого ядра. При окрашивании тканей наружный слой белка может десорбироваться и переходить в раствор. За счет связывания возникает конкуренция меченых и немеченых белковых молекул. Рекомендуется добавлять в раствор КЗ строго определенное количество белка, необходимое и достаточное для его стабилизации. При концентрировании и очистке комплекса необходимо полностью удалять супернатант, так как в нем содержится немеченый лиганд. После ультрацентрифугирования в осадке остается часть немеченых молекул. Десорбция белка может обусловливаться, кроме того, изменением рН. Действительно, адсорбция белка на частицах КЗ обычно происходит при значениях рН, близких к его изоэлектрической точке, но взаимодействие этого комплекса с клеточными структурами зачастую происходит при иной кислотности среды, особенно когда изучаются живые клетки. Следовательно, связь амфотерных молекул с золотом в таких условиях может ослабнуть.
Другой причиной недостаточно интенсивного окрашивания является недоступность рецептора. Процесс диффузии меченого лиганда при окрашивании после заливки (особенно в эпоксидные смолы) также практически не поддается контролю, поэтому метятся главным образом рецепторы, находящиеся на поверхности среза. Кроме того, следует учитывать повреждающее действие веществ, используемых для удаления смолы. И, наконец, малая интенсивность окраски может обусловливаться снижением активности комплекса белка (в частности, фермента) с КЗ при хранении.
Другую группу артефактов составляют случаи неспецифического окрашивания, причины которого кроются в особенностях адгезии белка к гранулам КЗ, технике подготовки препарата и т.д. Основное допущение, на котором основывается использование КЗ в качестве Мр, состоит в том, что белок необратимо адсорбируется на поверхности частицы КЗ и полностью покрывает ее. Если эти условия не выполняются, то возможно неспецифическое взаимодействие "обнаженных" участков с белками клеток и тканей. Частицы КЗ иногда не полностью покрываются белком. Для покрытия белком этих участков поверхности добавляют ПЭГ. Однако этот способ не всегда эффективен.
Неспецифическая адсорбция частиц КЗ может возникать при высыхании срезов во время процедуры окрашивания, что указывает на необходимость постоянного контроля за наличием слоя жидкости над поверхностью среза. Для исключения неспецифического окрашивания необходимо промывать объекты особенно тщательно и не допускать их подсыхания между процедурами инкубации [116]. При окрашивании после заливки результат в значительной степени зависит также и от качества среза. Частицы золя неспецифически накапливаются в складках среза и отсутствуют на соседних участках.
Кроме того, обнаружено неспецифическое связывание Мр с погибшими клетками и продуктами их распада.

Белки, меченные КЗ, могут неспецифически связываться со структурами, содержащими остатки аминокислот с высоким электрическим зарядом. Для снижения неспецифического окрашивания частицами КЗ щелочных остатков аминокислот рекомендуется добавлять 1-2 мг низкомолекулярного поли-Ь-лизина к каждому миллилитру разведенной пробы.
Если КЗ приготовлено с помощью ТК, то неспецифическое связывание с ЦС на УС может быть обусловлено остатками ТК на частицах КЗ. Проблема решается путем разведения раствора Мр буфером, содержащим желатину (2-4 %) или смесь БСА (1 %) с Тритоном Х-100 (0.05 %), либо Твином-20 (0.5 %).
Наконец, последняя группа артефактов включает агрегацию частиц КЗ и загрязнение срезов. Если агрегация возникает в процессе приготовления комплекса, то вместо ультрацентрифугирования можно использовать хроматографическую очистку продукта. Если же причиной артефактов является высыхание срезов во время окрашивания, то нужно просто избегать этой ошибки. Агрегаты могут образоваться также при хранении комплекса. Поэтому перед его употреблением рекомендуют проводить центрифугирование.
Загрязнение образцов продуктами окисления металлов возникает, если окрашивание срезов производят на медных сеточках. Для предупреждения этого артефакта используют никелевые или золотые сеточки. Необходимо проводить ряд контрольных реакций, обеспечивающих достоверность получаемых результатов [121].

21.8. НЕТРАДИЦИОННЫЕ СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ КЗ

КЗ позволяет выявлять несколько рецепторов одновременно. Для достижения этой цели существует несколько подходов. Различные лиганды можно метить частицами золота разного размера. Если Мр значительно различаются по размеру, то рекомендуется сначала инкубировать препарат с более крупным Мр, иначе мелкие частицы создадут стерические препятствия для крупных. Иногда удается покрасить обе стороны одной и той же сеточки для ЭМ различными конъюгатами антител, отличающимися по диаметру гранул золота.
Так, можно приготовить препараты КЗ с диаметром частиц от 5 до 30 нм и проводить окрашивание одновременно по нескольким антигенам с последующим анализом в ЭМ. Для этого проще прямо пометить первые антитела частицами КЗ разного диаметра. При нанесении такой смеси меченых антител на УС удается продемонстрировать присутствие разных антигенов, поскольку каждый из них будет связываться с частицами определенного диаметра.
Применяют двойное мечение с использованием КЗ и ферритина. Этот метод полезен для исследования топографии и динамики рецепторов, но не поддается количественному анализу. При мечении используются сочетания КЗ с ПХ, КЗ с последующим серебряным усилением и ПХ, а также КЗ с рутинными гистохимическими методами, например с обработкой при помощи ТК, что позволяет исследовать распределение антигена в клетках определенного типа.
КЗ может использоваться в качестве трейсера, а также для анализа электростатических свойств клеточной поверхности. Комплекс агглютинина завязи пшеницы с ПХ и КЗ с успехом был применен для изучения ретроградного нейронального транспорта. Радиоактивное КЗ различной дисперсности используют также в физиологических исследованиях при анализе проницаемости гистогематических барьеров. Частицы КЗ диаметром 5-15 нм после инкубации в растворе полилизина при рН 7.0 покрываются слоем молекул полилизина, приобретая катионные свойства. В этом случае они связываются с анионными сайтами клеточной поверхности [62, 93].

21.9. СЕРЕБРЯНОЕ УСИЛЕНИЕ

Величину частиц КЗ можно увеличить с помощью метода серебряного усиления, который часто называют аутометаллографией. Серебрение основано на реакции, используемой в фотографии и называемой "физическое" проявление. Проявители, предназначенные для получения фотографического изображения за счет восстановления микрокристалов галогенида серебра, называются "химическими" (традиционный способ проявления). "Физический" проявитель содержит помимо восстановителя ионы или комплексы металлов. Из таких растворов происходит осаждение металлов на центры скрытого изображения или на серебряное почернение. В качестве таких центров выступают гранулы КЗ, которые катализируют восстановление ионов серебра до металлического серебра при использовании гидрохинона как восстановителя. Оболочка металлического серебра вокруг частицы КЗ сама в свою очередь катализирует процесс восстановления, и реакция становится аутокаталитической. Присутствие только двух атомов золота при контролируемых условиях может инициировать "физическое" проявление (см. Приложение, 21.4).
Следовательно, при добавлении проявителя к объекту, меченному КЗ, каждая золотая частица становится каталитическим центром и инкапсулируется в растущем слое металлического серебра, увеличиваясь в диаметре. Это дает возможность использовать очень маленькие частицы КЗ, что позволяет добиться наиболее точной локализации исследуемых молекул и большей чувствительности. Серебряное усиление рекомендуется для увеличения размеров не только мелких частиц КЗ, но и средних и даже крупных.
Следует иметь в виду, что восстановление серебра может происходить не только на частицах КЗ, но и на угольных пигментах в легких и в лимфатических узлах. Наличие в образцах сульфида ртути и золотосодержащих лекарств также ведет к восстановлению ионов серебра. Серебряное усиление можно использовать при работе со сверхмалыми частицами КЗ в случае преэмбеддинга.

Имеется прямая зависимость между временем обработки и размерами отложений серебра вокруг золотой гранулы. Причем, для того чтобы этот процесс был контролируемым, он должен протекать достаточно медленно. Для снижения скорости восстановления серебра при физическом проявлении используют защитный коллоид. В отсутствие коллоида уже через 5 мин образуются кристаллы неправильной формы. При использовании ПЭГ или поли-винилпирролидона (ПВП) неконтролируемый рост кристаллов начинается через 10 мин проявления. Лучшим защитным коллоидом оказался гуммиарабик. Под его воздействием диаметр частиц увеличивается медленно, но прогрессивно. Так, через 60 мин размер частиц увеличивается в 15 раз при сохранении сферической формы. Гуммиарабик перед употреблением рекомендуется очищать с помощью ультрацентрифугирования.
Серебряное усиление можно использовать не только при иммуномечении и обработке лектинами, но и в случае проведения реакции гибридизации in situ и двойного мечения, в том числе и при светооптических исследованиях. В СЭМ мечение КЗ с последующим серебряным усилением решает многие проблемы.
Частицы КЗ подвергают серебряному усилению при изучении фагоцитоза (метод преэмбеддинга), что позволяет выявлять фагоцитирующие клетки под СМ [118].

21.9.1. Процедура серебряного усиления

После иммуномечения УС промывают в том буфере, который использовался для разведения антител, затем промывают в бидистиллированной воде или разведенном цитратном буфере, после чего вновь в бидистиллированной воде. Время проявления 10-45 мин. УС покрывают 0.05%-ным водным раствором желатины и высушивают. Желатина предупреждает выпадение аутоката-литических преципитатов из проявителя, уменьшает зерно. Всю процедуру желательно проводить при красном свете [318].
После 5-минутного перемешивания проявителя сеточки, увлажненные до этого водой, помещают на каплю проявителя. Рекомендуется использовать магнитную мешалку для вращения никелевых сеточек (оптимальное время проявления подбирают эмпирически). Для прекращения проявления сеточки надо интенсивно промыть в бидистиллированной воде. Реакцию надо вести при красном свете, комнатной температуре и постоянной влажности. После серебряного усиления реакция иммуномечения блокируется.

21.9.2. Используемые реактивы

Для проявления имеют значение и другие факторы, например то, какая соль серебра содержится в растворе. В качестве источников ионов серебра используют нитрат, ацетат или лактат серебра. В

последнем варианте процесс серебряного усиления контролируется лучше. В случае нитрата реакцией довольно трудно управлять вследствие высокой степени диссоциации соли и быстрого течения проявления. Оптимальным считается применение лактата серебра.
В большинстве работ в качестве восстановителя используется гидрохинон. Некоторые авторы рекомендуют заменять его бром-гидрохиноном, дающим большую контрастность и снижающим неспецифическую адсорбцию серебра. Метод позволяет проводить гистохимическую реакцию с частицами КЗ небольшого диаметра (например, 5 нм), что исключает стерические препятствия при взаимодействии рецептора с меченым лигандом. Это открывает перспективы для внедрения метода КЗ-серебрение как в СМ, так и в СЭМ.
Итак, основными компонентами "физического" проявления являются лактат серебра (источник ионов серебра), гидрохинон или бромгидрохинон (выполняет функцию восстановителя, т.е. способствует образованию атомарного серебра из ионного) и гуммиарабик (замедляет процесс до необходимого уровня и стабилизирует его). Для обработки ПС и УС используют проявитель. Гуммиарабик представляет собой сложный сополимер D-галактозы, L-маннозы, L-арабинозы и остатков D-глюкуроновой кислоты. Количество гуммиарабика, добавляемого в проявитель, является критическим фактором для контролирования скорости процесса усиления. Можно использовать 30%-ный раствор, но это снижает чувствительность процесса усиления. Поэтому чаще всего применяют 15%-ный раствор. Меньшая концентрация делает процесс усиления неконтролируемым. Вместо гуммиарабика можно использовать БСА, декстран, ПЭГ, ПВП, вольфрамовую кислоту, желатину и др. ПЭГ и ПВП имеют преимущества: известно их химическое строение, они быстро растворяются и могут готовиться ex tempore.
Чувствительность метода с КЗ значительно увеличивается при восстановлении частицами золота лактата серебра с образованием интенсивно черного продукта. Иногда лучше применять реактивы, разведенные 1 : 1.
Можно использовать другие проявители (см. Приложение, 21.4), которые проявляют быстрее, однако это увеличивает риск возникновения фона. Время инкубации подбирают индивидуально для каждого опыта. Оно зависит от толщины среза, длительности и последовательности процедур, использованных при проводке, плотности золотой метки. Усиление лучше всего проводить на водяной бане при стабильной температуре. Повышение температуры увеличивает скорость реакции, но ведет к росту фона. Во время проявления меченные КЗ участки становятся желтыми, затем коричневыми, наконец, черными. Очень черные препараты маскируют подлежащие структуры. Для контролирования скорости реакции препараты промывают бидистиллированной водой или разбавленным цитратным буфером, просматривают под слабым светом в темной комнате и вновь возвращают в проявитель.

В качестве донора ионов серебра можно использовать фотоэмульсию (см. Приложение, 21.5.1). Для этого срезы покрывают фотоэмульсией, содержащей кристаллы бромистого серебра, а затем обрабатывают проявителем. При этом ионы серебра, освобождаемые из фотоэмульсии, проникают к частице золота вместе с молекулами восстановителя и образуют слой металлического серебра. Увеличение гранул в 35 раза достигается после 15-минутного проявления.
Слой эмульсии можно впоследствии удалить с препаратов с помощью раствора протеолитического фермента. При использовании в СЭМ этот метод, по нашему мнению, хуже, чем "физическое" усиление, так как требует высушивания образца до и после нанесения эмульсии и более длительной инкубации.

21.9.3. Возможные опасности

Раствор серебряного усилителя рекомендуется держать в темноте. Любое изменение цвета раствора свидетельствует о неспецифической преципитации серебра. Очень важно во время реакции не допускать попадания света на УС. При потемнении раствора на препаратах резко возрастает фон. Если во время усиления проявитель становится серым, то его лучше заменить свежим. Это позволяет уменьшить фон. Для удаления фона можно применять фотографические ослабители типа раствора Фармера. Реакцию проявления останавливают погружением препарата в 20-25%-ный раствор тиосульфата натрия на 1-3 мин. Можно предварительно использовать стоп-ванну с 1%-ной уксусной кислотой в течении 1 с. Каждый этап требует промывания в бидистиллированной воде.

21.9.4. Преимущества и недостатки

Метод серебряного усиления КЗ имеет ряд недостатков: 1) возможно аутокаталитическое серебрение, не блокирующееся коллоидом; 2) в гуммиарабике могут быть ионы хлора, осаждающие ионы серебра; 3) кислая среда проявителя приводит к отщеплению антител с низкой авидностью. Наряду с этим метод имеет существенные преимущества: 1) он в 2-5 раз более чувствителен, чем непрямой метод с ПХ, и в 4-8 раз чувствительнее метода с ПАП; 2) его можно использовать в случае применения преэмбеддинга, например на вибратомных срезах. Однако осмирование после серебрения, но до заливки в эпон существенно снижает величину гранул из-за окисления 40. Для предупреждения данного недостатка серебряные зерна покрывают золотом. Метод серебряного усиления позволяет при двойном мечении пользоваться одним и тем же Мр второго слоя. После реакции на ПХ срезы можно усилить серебром [339] (см. Приложение, 21.5).
Глава 22 АНАЛИТИЧЕСКАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

Когда пучок электронов, обладающий высокой энергией, взаимодействует с образцом, атомы образца могут вызвать замедление электронов. Если это происходит, то кинетическая энергия электрона превращается в другие формы энергии. Электроны с уменьшенной кинетической энергией двигаются по другой траектории.
Природа и спектр выделяемой энергии, так же как и изображения, образуемые замедленными электронами, могут регистрироваться специальными детекторами, которыми снабжен ЭМ. Такие детекторы способны определять атомный состав объекта и количество элементов, присутствующих в нем. Если ЭМ используется для идентификации химической природы компонентов объекта, то он называется аналитическим ЭМ [234, 352].
Такие приборы позволяют определять локализацию ионов и электролитов в различных частях клеток, изучать изменения в распределении ионов во время различных физиологических процессов, проводить идентификацию неизвестных кристаллических включений в клетке и продуктов ферментативных реакций, исследовать пути проникновения токсических ионов в клетку, выявлять их, а также пути их выведения. Аналитическая ЭМ представляет собой важный инструмент в изучении распределения ионов и регуляции процессов, происходящих в биологических системах [209].
В рентгеновском микроанализаторе объект сканируется тонким пучком электронов (электронный зонд). Взаимодействие такого зонда с объектом вызывает рентгеновское излучение, позволяющее идентифицировать химические элементы [57, 334, 368].

22.1. МЕХАНИЗМЫ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ СИГНАЛОВ

При облучении объекта электронами формируется несколько энергетически различных излучений. При упругом соударении энергия электронов практически не теряется, но меняется направление их движения. Эти электроны названы упругорассеянными, или трансмиссионными, и используются в обычных ТЭМ для получения морфологической информации об объектах.
Упругорассеянные электроны могут либо проходить сквозь объект, либо отклоняться (отбрасываться) назад в направлении пучка. Это обратнорассеянные электроны. Они регистрируются с помощью специальных детекторов как в ТЭМ, так и в СЭМ. Такие детекторы используют для картирования областей, содержащих элементы с различным атомным номером. Элементы с высоким номером дают большее число обратнорассеянных электронов и кажутся более яркими, чем те, которые содержат элементы с более низким атомным номером.
Вторичные электроны, энергия которых обычно ниже 50 эВ, представляют собой один из типов неупругорассеянных электронов. Именно эти электроны используют для анализа клеточной поверхности в СЭМ.
Наиболее практически важные для биологов типы рентгеновского излучения генерируются, когда электроны с высокой энергией взаимодействуют в электронами, располагающимися на различных энергетических орбитах атома объекта. Поскольку при этом электроны переходят на более низкий энергетический уровень, определенное количество энергии освобождается в виде рентгеновского излучения. Падающие электроны взаимодействуют с электронными оболочками атомов объекта (К-уровня) и выбивают электроны с соответствующей орбиты. В результате этого процесса создаются вакансии, для заполнения которых используются электроны с более высоких энергетических уровней (L- или М-уровни). Так как энергия у этих электронов выше, чем у выбитого электрона, то ее избыток выделяется в виде квантов рентгеновского излучения. Различие между двумя энергетическими уровнями является энергией, которая характеризует элемент. Поскольку каждый элемент генерирует уникальную серию пиков энергии, то спектр их может быть использован для идентификации элементов. Такое дискретное рентгеновское излучение названо характеристическим.
При взаимодействии заряженной частицы (в данном случае падающего электрона) с ядром атома происходит торможение электрона и выделение рентгеновского излучения с непрерывным (белым) спектром, т.е. со всеми возможными значениями энергии [80, 105, 334].

22.2. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЕТЕКТОРЫ

Для микроанализа применяют различные типы детекторов. Энергетические полупроводниковые детекторы рентгеновского излучения наиболее часто используются в биологических исследованиях. Они состоят из полупроводника, сделанного из кристалла кремния, в который введено некоторое количество атомов лития. Когда рентгеновское излучение падает на полупроводниковый кристалл, поглощенная энергия изменяет его электропроводность. Поскольку энергия рентгеновского излучения прямо пропорциональна увеличению проводимости кремниевого кристалла, то таким образом можно определять интенсивность рентгеновского излучения. Кристалл детектора охлаждается в жидком азоте для получения максимального разрешения и уменьшения шума и содержится в условиях сверхвысокого вакуума.
Преимущества энергетических детекторов следующие: 1) простая конструкция и относительно небольшие размеры; 2) высокая чувствительность и почти 100%-ная эффективность; 3) способность одновременно анализировать полный элементный спектр; 4) возможность использовать узкий электронный зонд с малыми токами пучка. Однако эти детекторы имеют и недостатки: 1) точность метода при низких концентрациях элементов значительно снижается; 2) разрешение ограничено 100-120 эВ, соответственно близко расположенные энергетические пики рентгеновского излучения плохо различаются; 3) чувствительность для легких элементов падает; 4) необходимо работать при температуре жидкого азота.
В кристаллическом, или волновом, детекторе тормозное рентгеновское излучение отражается атомными плоскостями кристалла согласно уравнению Брагга. Используемые кристаллы имеют вогнутую форму для фокусировки рентгеновского излучения. Поскольку кристалл отражает относительно узкую часть спектра рентгеновского излучения, он может использоваться только для очень небольшого числа элементов с близкими атомными номерами. Например, гипсовый кристалл отражает волны длиной от 0.26 до 1.5 нм, что соответствует атомным номерам от 11 до 14. Кристалл хлорида натрия отражает волны длиной от 0.09 до 0.53 нм и позволяет детектировать элементы с атомными номерами от 16 до 37. Поэтому для анализа широкого спектра элементов необходимо использовать несколько типов кристаллов.
Отраженные и сфокусированные рентгеновские лучи попадают в камеру, заполненную инертным газом (обычно смесь аргона с метаном), вызывая ионизацию аргоно-метановой смеси и одновременно ионный ток. Этот электрический ток измеряется и количественно оценивается во времени. Поскольку величина тока прямо связана с энергией падающих рентгеновских лучей, то можно определить энергию рентгеновского излучения.
Волновой кристаллический детектор реже используется в биологических исследованиях, так как представляет собой сложную механическую конструкцию с рядом регулировок; он осуществляет анализ в данный момент только одного элемента, менее эффективен, чем детектор энергетического рассеяния, и требует более интенсивного облучения объекта, что может приводить к его повреждению.
Однако волновой кристаллический детектор более четко различает близко расположенные энергетические пики рентгеновского излучения, лучше приспособлен для анализа следовых количеств элементов и не требует жидкого азота для своего охлаждения.
Данные, получаемые при использовании обоих типов детекторов, могут быть представлены тремя способами.

Как правило, при анализе вторым и третьим способами производится компьютерная обработка данных [244].

22.3. РЕНТГЕНОВСКИЙ МИКРОАНАЛИЗ (РМА)

Для изучения локализации и концентрации элементов в клетках и тканях широко используется метод РМА, который имеет ряд преимуществ по сравнению с другими видами количественного анализа. Наиболее важными из них являются следующие: 1) анализ с помощью рентгеновского излучения является достаточно щадящим; 2) анализируемое вещество может находится в различных агрегатных состояниях; 3) определение содержания всех присутствующих в объекте химических элементов можно осуществлять одновременно с помощью РМА, если использовать энергетический детектор; 4) можно производить анализ в широком диапазоне концентраций (практически от 10^-4 до 100%-ной); 5) содержание элементов можно определять в очень малом объеме (порядка нескольких пиколитров) [80].
Особый интерес для биологов и медиков представляет возможность получения количественных характеристик некоторых физиологически активных элементов, таких как натрий, магний, фосфор, калий и кальций, которые играют значительную роль в протекании процессов как в норме, так и при патологии. С помощью РМА можно не только идентифицировать элементы, но и определить их количественное содержание в ядре и органеллах, в частности в митохондриях, эндоплазматической сети, а также в лизосомах и цитозоле.
Большинство биологических объектов состоит из элементов с низкими атомными номерами. По этой причине падающие электроны проникают глубоко в образец, где они теряют свою энергию и располагаются в пространстве, имеющем форму капли. С ростом ускоряющего напряжения происходит увеличение глубины и диаметра этой капли [80].
В настоящее время рентгеновскими спектрометрами оснащают как СЭМ, так и ТЭМ, создаются также специальные аналитические комплексы (ЕММА-4 и ТЕМСКАН), объединяющие большие аналитические возможности рентгеновских спектрометров и высокое разрешение ЭМ. С помощью этих приборов можно производить анализ как объемных образцов, так и срезов тканей.
Трансмиссионный РМА может быть проведен и в СЭМ, который снабжен детектором трансмиссионных электронов или же специальным устройством, позволяющим использовать один и тот же детектор вторичных электронов и для сканирующего, и для трансмиссионного режима работы. Хотя разрешение в СЭМ ниже, чем в ТЭМ, тем не менее исследования в трансмиссионном режиме сканирующего микроскопа обладает некоторыми преимуществами: 1) в нем можно исследовать более толстые объекты (срезы до 5 мкм), что удобно для обнаружения элементов, присутствующих в тканях в небольших количествах; 2) в большой камере СЭМ легче разместить устройства для анализа образцов при температуре жидкого азота; 3) изображение в СЭМ гораздо контрастнее, а это обстоятельство может иметь большое значение, так как уменьшение или полный отказ от использования химических веществ для контрастирования важен для корректного проведения микроанализа [80, 365].

22.3.1. Возможности метода

Наиболее простая задача, решаемая с помощью РМА, - это качественное определение элементного состава в объекте. Гораздо сложнее выполнить количественное исследование, т. е. определить количество различных элементов в различных участках объекта. Решению такой задачи препятствуют весьма существенные и труднопреодолимые сложности, связанные с препарированием и аппаратурным обеспечением, что приводит к тому, что довольно мало исследований выполнено с использованием количественного микроанализа.
Среди многочисленных направлений применения метода можно выделить четыре основные группы: 1) определение неорганических веществ в тканях и клетках; 2) идентификация продуктов гистохимических реакций; 3) локальное определение содержания легкодиффундирующих ионов (натрия, хлора, калия) и других физиологически важных элементов (кальция, фосфора и др.); 4) оценка изменений содержания неорганических элементов в малых объемах [314, 340, 365].
К первой группе обычно относят не только изучение минеральных отложений в виде водонерастворимых солей, но и определение внутриклеточной или внутритканевой локализации некоторых металлов. Избыточное накопление последних происходит при некоторых заболеваниях, и их исследование может иметь диагностическое значение. Для быстрой идентификации неорганических отложений в хирургических биопсиях пригодны как депарафинированные 5-10-микронные срезы (в том числе окрашенные гематоксилином и эозином), так и криостатные срезы, высушенные под вакуумом или на воздухе. РМА применяется для анализа состава калькулезных отложений в мочевыводящих путях, минеральных отложений в легочной ткани, в судебно-медицинской диагностике для определения ядов в тканях. В фармакологии РМА позволяет уточнять локализацию лекарств, например арилсульфонамидов, содержащих фтор, диуретиков, содержащих ртуть; и т.д. Можно внутривенно вводить частицы золота и с помощью РМА регистрировать их в макрофагах легких. Важным направлением применения РМА является его использование для определения концентрации неорганических элементов в различных биологических жидкостях. РМА с успехом применяется для идентификации продуктов гистохимических реакций. С помощью РМА можно детектировать фармакодинамику лекарств, содержащих мышьяк [351].

22.3.2. Подготовка объектов для РМА

Самая большая проблема, возникающая у биологов, применяющих РМА, связана с приготовлением объекта. Для твердых биологических объектов, таких как кость, не требуется особой подготовки, кроме зачистки и полировки. Мягкие же ткани содержат большое количество внутриклеточной и интерстициальной воды, в которой растворены многочисленные аминокислоты, белки и электролиты. Из таких тканей воду необходимо удалить, либо объекты надо заморозить.
При подготовке объектов приходится решать две взаимоисключающие задачи - сохранить как интересующие нас элементы в местах их прижизненной локализации, так и ультраструктуру объекта. Использование нефиксированной ткани часто не дает возможности зарегистрировать, в каком участке клетки находится данный элемент. Наиболее подходящим методом для целей аналитической ЭМ является сверхбыстрое замораживание, при котором сохраняется структурный и элементный состав клеток [365].
В настоящее время существуют два основных направления в препарировании объектов для РМА: 1) клетки осаждают на подложку или выращивают на ней; затем объекты быстро замораживают и высушивают из замороженного состояния или изучают замороженные объекты на охлаждаемом до t=-173®С столике ЭМ; 2) проводят криоультратомию замороженных объектов; последующее исследование крио-УС в замороженном состоянии является наиболее адекватным подходом для РМА.
Можно также исследовать объемные объекты - толстые срезы и кусочки расколотых образцов. Такие объекты монтируют на алюминиевые или угольные столики и покрывают проводящим покрытием. Использование РМА для замороженных гидратированных объемных биологических образцов обусловлено тем, что их легче готовить и они более стабильны [245].
Особое внимание во время удаления воды следует уделять причинам, способным вызвать потерю или перераспределение элементов. Единственным методом, который обеспечивает возможность сохранения распределения ионов, характерного для состояния in vivo, является криоультратомия. Крио-УС готовят с помощью сухого ножа. Их обычно помещают на никелевые сеточки, покрытые подложкой, а после сублимации напыляют углеродом.
Для наблюдения замороженных объектов и исследования их с помощью РМА необходимо использовать специальную охлаждающую камеру в микроскопе, способную поддерживать определенную температуру (обычно температуру жидкого азота) для предотвращения сублимации льда из объекта [365].
Преимуществом данной методики является доступность препаративной техники, основанной на получении гладких, плоских срезов толщиной 500 нм. Срезы изготавливают с помощью охлажденных бритв. Угол наклона ножа составляет 6®. Для анализа используют бериллиевые сеточки, это обусловлено тем, что бериллий достаточно теплопроводен и дает низкий рентгеновский фон. В ряде случаев используют алюминиевые сеточки, однако рентгеновский характеристический сигнал алюминия накладывается на таковой натрия (при энергодисперсионном анализе).
Другим способом препарирования являются лиофилизация и низкотемпературная заливка. Высушенные крио-УС очень гигроскопичны. Для увеличения прочности и создания электропроводящего покрытия рекомендуется их напылить тонким слоем угля. Работать с ними желательно в атмосфере сухого азота, а хранить лучше в вакууме [365].
Высушенные крио-УС имеют ряд преимуществ над гидратированными: 1) с ними проще манипулировать; 2) обеспечивается более высокое разрешение; 3) они более стабильны и могут храниться длительное время. Однако такие крио-УС имеют и недостатки: 1) результаты могут быть выражены только в пересчете на сухую массу; 2) невозможно прямо определить содержание воды; 3) нельзя анализировать области, близкие к поверхности клеток.
Поскольку при РМА гидратированные крио-УС очень нестабильны под электронным лучом, исследуют гидратированные крио-ПС. Для их закрепления часто применяют раствор Рингера с добавлением декстрана (до 20 %). Другой способ прикрепления крио-ПС к держателю - придавливание ПС с помощью охлажденного медного полированного стержня.
Получаемое на гидратированных срезах изображение имеет очень слабую контрастность, в связи с этим иногда осуществляют частичную сублимацию срезов в ЭМ [80, 365].
РМА позволяет проводить элементное картирование поверхности гидратированных крио-УС. Взвешивание одного и того же среза до и после высушивания дает возможность определить в нем количество воды и получить абсолютные значения содержания элементов.

В редких случаях даже при изучении ионов применяют высушивание на воздухе. Это в первую очередь относится к изолированным клеткам: делают мазок взвеси клеток в подходящем буфере на подложке ЭМ-сеточек, которые затем быстро высушивают на воздухе.
Указанных проблем не возникает при использовании РМА для изучения неорганических включений в самые различные ткани. В ряде случаев для анализа элементного состава применяют вещества, вызывающие преципитацию интересующих элементов. Так, для осаждения кальция применяют оксалат аммония или пироантимонат калия. Для определения содержания легкодиффундирующих ионов калия, натрия, хлора и кальция используют методику криофиксации, которая предотвращает перераспределение этих элементов. Показано, что любая другая процедура приводит или к их перераспределению, или к потере. После этого приготовление препаратов для микроанализа может быть различным [80, 105, 365].
Удаление воды из замороженных объектов можно производить не только с помощью сублимации, но и в процессе замещения в замороженном состоянии. Однако при этом может происходить транслокация элементов.
РМА применим также для анализа УС после заключения в аралдит. Однако лучше использовать акриловые смолы, поскольку содержащиеся в эпоксидных пластмассах сера и хлор могут усиливать фон и маскировать имеющиеся в образце элементы [80, 202].

22.3.3. Количественная оценка результатов

РМА в отличие от ряда гистохимических методов не позволяет различать свободные и связанные элементы, а определяет их общее содержание. Предел количественной оценки элементов этим методом варьирует от 0.5 до 1 ммоль на 1 кг сухой массы. Поэтому небольшие внутриклеточные перемещения свободных ионов в наномолярных концентрациях уловить трудно [80, 365].
Разработаны приборы для создания карт концентраций различных элементов на гидратированных (или высушенных из замороженного состояния) крио-УС в реальном времени и в сравнении со стандартами. Это позволяет оценить содержание воды и концентрацию различных элементов в одной и той же клеточной области, определить концентрационные градиенты и гетерогенность ответа клеток на действие одного и того же стимула [105, 230].
Для количественного микроанализа желательно использовать эталоны, сходные с образцами по физико-химическим свойствам и составу [361].
Существует несколько подходов для количественного микроанализа. Выбор их зависит от толщины образца и методов его подготовки. Для объектов толщиной до 10-15 мкм пригодна следующая формула:

C_x=I_x/I_xs,

где C_x - концентрация элемента х в анализируемом микрообъеме образца (в действительности масс-фракция данного элемента); I_x - измеряемая интенсивность выбранной характеристической линии данного элемента; I_xs - интенсивность той же линии (того же диапазона энергий) эталона, содержащего элемент х в известной концентрации.
Условия анализа должны быть идентичными. Однако данное уравнение неточно. Для уточнения его вводят факторы коррекции (ZAF-факторы). Тогда более точная с физической точки зрения формула соотношения масс-фракций элемента и интенсивности приобретает вид:

C_x=I_x/I_xsZAF,

где Z - фактор коррекции, учитывающий разницу среднего атомного номера элементов, составляющих объект и эталон; А - фактор коррекции, учитывающий внутреннюю адсорбцию образованных рентгеновских лучей объектом и эталоном; F - фактор, учитывающий флюоресценцию рентгеновских лучей, которые образовались не под действием электронного пучка [90, 105, 365].
Другой подход был разработан специально для биологических объектов. Было выведено следующее уравнение:

C_x=KI_x/I_w.

Здесь I_w - интенсивность рентгеновского излучения вблизи от характеристической линии элемента x, где отсутствуют какие-либо пики других элементов; К - константа, определяемая по эталону.
Близость энергий I_x и I_w делает ненужным использование А-фактора коррекции, а наличие соотношения I_x/I_w - Z-фактора коррекции. F-фактор коррекции (для флюоресценции) обычно незначителен в случае биологических объектов [80, 105, 365].
В настоящее время большинство аналитических методов количественного анализа введены в миникомпьютеры, прилагаемые к приборам для РМА. Исследователь должен, однако, представлять себе, какие методы он использует и какие у них ограничения. В вышедшей на русском языке монографии ("Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ" [57]) все эти вопросы тщательно разобраны.
Для определения концентрации элементов необходимо с помощью соответствующих эталонов, содержащих известное количество элементов в определенной пропорции, выявить соотношение между концентрацией данного элемента и интенсивностью рентгеновского излучения. При РМА биологических объектов используют весьма разнообразные эталоны. Для удобства их можно разделить на несколько типов: неорганические, смеси неорганических веществ со смолами, смеси органических веществ с электролитами, макроциклические полиэфирные комплексы с неорганическими солями, ткани и их гомогенаты с добавлением солей или без него, растворы электролитов. Наиболее широко используют смеси органических растворов (альбумина, желатины, агар-агара, карбоксилметилцеллюлозы, декстрина и их комбинации) с неорганическими или органическими солями [364]. Однако, несмотря на простоту работы с подобными стандартами и легкость их приготовления, они недостаточно гомогенны.
В качестве эталонов используют также органометаллические или органометаллоидные вещества, заключенные в эпон. Органические стандарты основаны на свойстве макроциклических полиэфиров образовывать комплексы с натрием и калием. Однако оба эти метода применяют для приготовления стандартов лишь при исследовании тканей, залитых в смолу, ввиду того что одним из требований, предъявляемых к эталонам, является максимальная идентичность его матрикса по плотности с исследуемым объектом [364]. Для определения толщины среза используется фоновое рентгеновское излучение [303, 364].

22.3.4. Основные ошибки при количественной оценке

Можно отметить следующие источники ошибок: 1) сложности в отделении характеристического пика от наслаивающихся пиков и от фона; 2) нарушения, вызываемые электронным пучком в эталоне и в объекте, приводят к изменениям как содержания элементов, так и общей массы; 3) инструментальные факторы - изменения в калибровке рентгеновского излучения, определении ширины пиков и дрейфа объекта; 4) основные статистические ограничения обусловлены малой интенсивностью рентгеновского излучения, детектируемого как в пиках, так и в области континуума; это связано в основном с практическим временем счета, используемым источником излучения, техникой анализа [80, 105, 365].

22.4. СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПОТЕРЬ ЭЛЕКТРОНОВ

Этот метод используют для разделения электронов различных энергетических уровней после их прохождения через тонкий объект. При этом в принципе можно определить элементный состав образца. Разделение электронов осуществляют с помощью электромагнитного спектрометра, помещенного либо непосредственно за объектом, либо вслед за экраном ТЭМ или СТЭМ. Когда электроны попадают в электромагнитное поле спектрометра, они отклоняются в различной степени и фокусируются на некотором расстоянии от спектрометра. Электроны с низкой энергией отклоняются в большей степени, чем электроны, имеющие более высокую энергию. Тем самым точки фокусирования различных групп электронов физически разделяются. Подвижную пластинку с узким щелевидным отверстием помещают в таком положении, чтобы только электроны с определенным энергетическим уровнем проникали в детектор; последний имеет сходную конструкцию с детектором вторичных электронов в СЭМ (сцинтилляционного типа) [105, 365].
Типичный разброс энергетических потерь для электронов, ускоряемых напряжением 100 кВ, занимает пределы от 100 до 1000 эВ. Современные спектрометры могут детектировать энергетические потери от 0 до 2000 эВ с разрешением лучше 5 эВ. Поскольку данный тип спектрометров регистрирует первичные события (потерю энергии проходящих электронов), а не вторичные (рентгеновское излучение), то он на 1-2 порядка (в 10-100 раз) более эффективен, чем РМА. Пространственное разрешение в спектрометре энергетических потерь электронов (10 нм) сопоставимо с таковым, получаемым в РМА при изучении УС (10-50 нм). При этом возможно картирование распределения элементов по площади среза.
Количественная оценка получаемых данных проще, чем в случае РМА, поскольку она не требует специальной математической коррекции результатов. Принципиальный недостаток данного метода - это невозможность получения достаточно тонких (в несколько раз тоньше обычных) УС. Чем толще УС, тем выше уровень фона из-за многочисленности событий, обусловленных рассеиванием электронов.
Система спектрометрии энергетических потерь позволяет, во-первых, увеличить контрастность изображения в светлом и темном поле путем фильтрации упруго рассеянных электронов, особенно при изучении толстых УС, во-вторых, составить карты распределения легких и среднетяжелых элементов с высоким разрешением, в-третьих, определять следовые концентрации элементов.
Кроме изучения элементного состава объектов и подсчета их количества метод может быть использован для увеличения контрастности и разрешения в случае более толстых объектов. Детектор обычно помещают между объектной и промежуточной линзами. ЭМ, снабженные подобной приставкой, позволяют анализировать толстые срезы, поскольку электроны с определенной длиной волны могут быть удалены. Данный метод может быть использован и для получения изображения отдельных атомов тяжелых металлов, расположенных на субстрате, который изготовлен из элемента с малым атомным весом.
Для изучения гидратированных крио-УС рекомендуется использовать спектроскопию энергетических потерь электронов в режиме нулевых потерь. Данный метод не нашел еще широкого применения, из-за того что большинство биологических объектов слишком толстые и легко повреждаются пучком электронов при исследовании [105, 365, 375].

ВМЕСТО ЗАКЛЮЧЕНИЯ

Вот и прочитана (или пролистана) книга. Надеемся, что она Вам в будущем еще пригодится.
Представленный в книге материал показывает, что в настоящее время электронная микроскопия обладает огромными возможностями в исследовании самых различных морфологических образований. Она постепенно становится настоящей научной дисциплиной, переходя из разряда искусства в разряд воспроизводимых методов исследования. Однако первичные сведения о внутреннем строении самых разнообразных биологических структур - супрамолекулярных образований, органелл, клеток, тканей и органов уже собраны. Получены морфологические обоснования большинства функциональных феноменов. Началось интенсивное исследование процессов гисто- и органогенеза.
Вы ждете заключения, подводящего итоги, ставящего новые задачи, рисующего перспективы будущих открытий и разработок в области ЭМ? Мы не станем подводить итоги, поскольку время для этого уже прошло. Авторы крупнейших открытий в области ЭМ уже получили свои Нобелевские премии. Если раньше буквально каждый день выходили все новые и новые статьи, зачастую переворачивающие наши представления о возможностях электронной микроскопии, то в настоящее время электронная микроскопия стала обычным методом морфологического исследования. И все же она продолжает развиваться. Мы рассматриваем наш труд всего лишь как короткий привал на длинном и трудном марше кропотливого изучения морфологических основ жизнедеятельности животного и растительного мира. И если нам удалось заинтересовать читателей и сообщить им хотя бы крупицу полезных для них сведений, то мы будем считать свою задачу выполненной.
В конце книги нам хотелось бы обратить внимание читателей на наличие значительной опасности для здоровья при работе буквально со всеми веществами, используемыми в ЭМ: они обладают сильной токсичностью, канцерогенностью, аллергизирующим влиянием и т.п. Для перечисления их вредоносных свойств не хватит еще одной книги. Да и сам электронный микроскоп, а также аппаратуру для препарирования объектов в ЭМ трудно отнести к полезным для здоровья устройствам: рентгеновское излучение, высокая пожароопасность, повышенное давление и т.д. и т.п. Поэтому исследователь должен быть чрезвычайно внимателен к технике безопасности и технологии работы - иначе возможна беда.
В заключение выражаем свою признательность всем сотрудникам лаборатории электронной микроскопии и кафедры анатомии Ивановского медицинского института, а также лаборатории ультраструктуры клеточных мембран Института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург) за советы и предоставленные материалы. Они по существу являются соавторами настоящей книги. Мы особенно благодарны ВАТарасову, А.Г.Богданову, А.М.Игнатьеву и Е.В.Королеву за помощь в проведении ЭМ-исследований.
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АБПХ - авидин-биотин-пероксидаза
AT - антиген
AT - антитело
АРГ - авторадиография
БВ - бидистиллированная вода
БДМА - бензилдиметиламин
БМ - базальная мембрана
БСА - бычий сывороточный альбумин
ВАТ - второе антитело
ВКТ - высушивание в критической точке
ВМЧ - внутримембранные частицы
ВПЕ - масса смолы, приходящаяся на эпоксид
ВСЭМ - высоковольтная СЭМ
ВТЭМ - высоковольтная ТЭМ
ГА - глютаральдегид
ГИС - гибридизация in situ
ГМА - гликольметакрилат
ГМК - гладкомышечные клетки
Д - дегидратант
ДАВ - диаминобензидин
ДБФ - дибутилфталат
ДДСА - додеценилсукциниловый ангидрид
ДМА - диметиланилин
ДМАЭ - диметиламиноэтанол
ДМП - диметоксипропан
ДМСО - диметилсульфоксид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДСТ - дисульфосукциними-дилтартрат
ЗС - заливочная среда
ИМ - инъекционная масса
ИС - инкубационная среда
КБ - какодилатный буфер
КЗ - коллоидное золото
КП - коррозионный препарат
КТ - критическая точка
Л - лектин
МАТ - моноклональные антитела
МВИ - микроволновое излучение
ММА - метилметакрилат
МНА - метилнадикангидрид
Мр - маркер
МФ - микрофиламенты
МЦ - метилцеллюлоза
НД - неионогенный детергент
НК - негативное контрастирование
ПАП - пероксидаза-антипероксидаза
ПАТ - первое антитело
ПБ - перекись бензоила
ПВП - поливинилпирролидон
ПИПЕС - пиперазин - N, N-биc-2-эта-нолсульфоновая кислота
ПС - полутонкий срез
ПХ - пероксидаза хрена
ПЭГ - полиэтиленгликоль
РБНС - раствор, блокирующий неспецифическое связывание
РК - рутениевый красный
РМА - рентгеновский микроанализ
РНК - рибонуклеиновая кислота
РРА - раствор для разведения антител
СМ - световая микроскопия
СТЭМ - сканирующая трансмиссионная электронная микроскопия (сканирующий трансмиссионный электронный микроскоп)
СЭМ - сканирующая электронная микроскопия (сканирующий электронный микроскоп)
СЭМКП- СЭМ коррозионных препаратов
ТБФР - забуференный Трис физраствор
ТК - таниновая кислота
Тр - трейсер
ТС - толуидиновый синий
ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия
УА - уранилацетат
УС - ультрасрез (ультратонкий срез)
УТФ - уридинтрифосфат
УФО - ультрафиолетовое облучение
ФА - формальдегид
ФБ - фосфатный буфер
ФБФР - физиологический раствор, забуференный фосфатным буфером
ФВК - фосфорно-вольфрамовая кислота
ФМК - фосфорно-молибденовая кислота
ФХД - физико-химическая диссоциация
ЦС - цитрат свинца
ЦСБ - цитоскелетстабилизирующий буфер
ЦФР - цитратный физраствор
ЧО - четырехокись осмия
ЭГТА - этиленгликоль-бис-бета-амино-этиловый эфир-N, N - тетраксусной кислоты
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭМ - электронная микроскопия (электронный микроскоп)
ЭОД - эффективное осмотическое давление

Примечание:

ПРИЛОЖЕНИЕ

Вариант 1. Добавить к раствору универсальный индикатор ЗИВ-1: рН 7.4 - цвет раствора ярко-зеленый, рН 7.2 - желто-зеленый, рН 7.6 - синевато-зеленый.
Вариант 2. Добавить к раствору фенолрот (феноловый красный). Фенолрот изменяет свой цвет в пределах рН от 6.8 до 8.0:
рН от 6.8 до 7.2 - цвет желтовато-оранжевый,
рН от 7.2 до 7.4 - розовый,
рН от 7.4 до 7.6 - красный,
рН от 7.7 до 8.0 - слабо-фиолетовый.
Вначале приготовить 0,2%-ный раствор красителя, который и добавить к используемому раствору (конечная концентрация должна быть 0,02-0,002%).

1.2 Расчет осмолярности

Пусть приготовлено 100 мл изотонического какодилатного буфера (рН 7.4), для этого к 50 мл 0,2 М какодилата натрия добавлено 8 мл 0,1 М НСl и объем доведен водой до 100 мл. Какодилат натрия диссоциирует в растворе на две частицы. Осмолярность в 100 мл конечного раствора равна сумме осмолярностей какодилата и соляной кислоты. Осмолярность какодилата составляет
0,2?2?50100=0,2
где 0,2 - исходная молярность какодилата, 2 - число диссоциированных частиц, 50 - исходный объем 0,2 М раствора, 100 - объем готового раствора.
Осмолярность НСl, диссоциирующей на 2 частицы, равна
0,1?2?8100=0,016
Тогда осмолярность общей смеси будет 0,2 + 0,016=0,216.

При работе с тканями млекопитающих осмолярность растворов должна быть равна 0,3. Повысить осмолярность можно с помощью 2 М сахарозы. Ее количество должно быть таким, чтобы осмолярность 100 мл 0,216 М раствора довести до 0,3, т.е.
0,3--0,216=0,084
Зная, что сахароза не диссоциирует, составляем уравнение:
2?1???100=0,084
Отсюда обьем раствора сахарозы (Y) равен 4.2 мл. Итак, для получения 100 мл изотонического тканям млекопитающих какодилатного буфера (рН 7.4) к 50 мл 0,2 М какодилата натрия следует добавить 8 мл 0,1 М НСl, 4.2 мл 0,2 М раствора сахарозы и объем довести водой до 100 мл.

2. РАСТВОРЫ

2.1. Солевые растворы

2.1.1. Молярность изотонических растворов [253]

NaCl 0,16 М MgCl₂ 0,11 М

КCl 0,16 М Na2HP04 0,13 М

Na₂HPO₄ 0,16 М Глюкоза 0,30 М

СаCl₂ 0,12 М Сахароза 0,29 М

2.1.2. Забуференный фосфатным буфером физраствор (ФБФР) [253]

Состав: 8.0 г NaCl, 1.0 г Na₂HPO₄ и 0,2 г КСl; долить водой до 1 л; рН довести до 7.4 с помощью 1 М раствора НСl.

2.1.3. Физиологический раствор, забуференный Трис-буфером

Приготовить 0,15 М раствор NaCl на 0,1 М Трис-HCl буфере (рН 7.4) (см. Приложение, 2.2.6.)

2.1.4. Раствор Рингера для млекопитающих [253]

Состав: 0,9 г NaCl, 0,42 г КСl, 0,24 г СаСl₂"6Н20, 0,05 г NaHCO₃, 0,05 г глюкозы и 0,025 г MgCl₂-6H₂0; долить водой до 100 мл.

2.1.5. Раствор Рингера для амфибий [253]

Состав: 0,65 г NaCl, 0,02 г КCl, 0,02 г СаСl₂"6Н20; долить водой до 100 мл.

2.1.6. Раствор Тироде [253]

Раствор А: 20,0 г NaCl, O,5 г KCl, 0,05 г СаСl₂"6Н20, 0,25 г MgCl₂"6Н20; долить водой до 100 мл.
Раствор Б: 5,0 г NaНСО₃, 0,25 г NaН₂PО₄; долить водой до 100 мл.
Смешать 40 мл раствора А, разведенных 460 мл воды, и 20 мл раствора Б, разведенных 480 мл воды, и добавить 1,0 г глюкозы.

2.2. Буферные растворы

2.2.1. Na-K-фосфатный буфер (ФБ) Соренсена [253]

Раствор А: 0,066 М КН₂РО₄ (= 0,908% КН₂РО₄).
Раствор Б: 0,066 М Na₂НPО₄ (= 1.188% Na₂НPО₄ "2Н₂О),
(= 1.786% Na₂НPО₄"7H₂О),
(= 2.387% Na₂НPО₄"12Н₂О).
Слить соответствующие объемы растворов А и Б.

рН	6.0	6.8	7.0	7.2	7.4	7.6	7.8	8.0
А, мл	87.7	50,8	39.2	28.5	19.6	13.2	8.6	5.5.0
Б, мл	12.3	49.2	60,8	71.5	80,4	86.8	91.4	94.5

2.2.2. Изотонический Na-ФБ [253]

Вариант 1. Приготовить растворы А и Б.
Раствор А: 0,164 М Na₂НPО₄ (= 2.26% NaН₂PО₄ "Н₂О),
(= 2.56% NaН₂PО₄"2Н₂О).
Раствор Б: 0,63 М NaOH (= 2.52% NaOH).
Слить соответствующие объемы растворов А и Б.

рН	6.0	6.2	6.4	6.8	7.0	7.2	7.4	7.6	7.8
А, мл Б, мл	96.2 3.8	94.7 5.3	92.5 7.5	87.9 12.1	85.8 14.2	83.9 16.1	82.5 17.5	81.6 18.4	80,8 19.2

Вариант 2. Взвесить указанное число граммов веществ А и Б, растворить в 100 мл воды.

рН	6.6	6.8	7.0	7.2	7.4	7.6	7.8
A: Na₂Н₂PО₄ "Н₂О, г	1.30	0,90	0,70	0,51	0,34	0,25	0,16
Б: Na₂НPО₄"7Н₂О, г или NaН₂PО₄ "12Н₂О, г	0,90 1.20	1.72 2.30	2.10 2.80	2.50 3.33	2.82 3.77	3.00 4.03	3.19 4.26

2.2.3. Растворы Na-ФБ разной молярности [253]

Вариант 1. Приготовить растворы А и Б нужной молярности.

Раствор А: 0,02 М NaН₂PО₄

Раствор Б: 0,02 М Na₂НPО₄

Раствор А: 0,1 М NaН₂PО₄

Раствор Б: 0,1 М Na₂НPО₄

Раствор А: 0,2 М NaН₂PО₄

Раствор Б: 0,2 М Na₂НPО₄

(= 0,276% NaН₂PО₄ "Н₂О),
(= 0,31% NaН₂PО₄ "2Н₂О),
(= 0,36% Na₂НPО₄ "Н₂О),
(= 0,54% Na₂НPО₄ "7Н₂О),
(= 0,72% Na₂НPО₄ "12Н₂О).

(= 1,38% NaН₂PО₄ "Н₂О),
(= 1,56% NaН₂PО₄ "2Н₂О),
(= 1,78% Na₂НPО₄ "Н₂О),
(= 2,68% Na₂НPО₄ "7Н₂О),
(= 3,58% Na₂НPО₄ "12Н₂О),

(= 2,76% NaН₂PО₄ "Н₂О),
(= 3,12% NaН₂PО₄ "2Н₂О),
(= 3,56% Na₂НPО₄ "Н₂О),
(= 5,37% Na₂НPО₄ "7Н₂О),

Слить соответствующие объемы растворов А и Б.

pH	6,0	6,2	6,4	6,8	7,0	7,2	7,4	7,6	7,8	8,0
А, мл	87,7	81,6	73,5	51,0	39,0	28,0	19,0	13,0	8,5	5,30
Б, мл	12,3	18,4	26,5	49,0	61,0	72,0	81,0	87,0	91,5	94,7

Вариант 2. Взвесить указанное под нужным значением pH количество граммов вещества А и Б, растворить для получения 0,5М раствора в 20 мл воды, 0,2М - в 50 мл, 0,1М - в 100 мл, 0,05М - в 200 мл, 0,02 М - в 500 мл соответственно.

pH	6,4	6,8	7,0	7,2	7,4	7,6	7,8	8,0
А: NaН₂PО₄ "Н₂О, г	1,0	0,7	0,54	0,39	0,26	0,18	0,12	0,07
Б: Na₂НPО₄ "Н₂О или Na₂НPО₄ "12Н₂О, г	0,71 0,95	1,31 1,75	1,63 2,18	1,93 2,58	2,17 2,9	2,32 3,1	2,46 3,28	2,54 3,39

2.2.4. Какодилатный буфер (КБ) [253]

Раствор А: 0,2 М какодилат натрия (= 4.28% NA(CH₃)₂As"ЗН₂О).
Раствор Б: 0,2 М НСl - 1.66 мл концентрированной (36-38%) НСl долить водой до 100 мл.
0,2 М буфер: слить 25 мл раствора А с соответствующим объемом раствора Б.

рН	6.4	6.6	6.8	7.0	7.2	7.4
Б, мл	9.2	6.7	4.7	3.2	2.1	1.4

0,1 М буфер: слить 10 мл буфера и 10 мл воды.
0,05 М буфер: слить 10 мл буфера и 30 мл воды.
0,4 М буфер с сахарозой (рН 7.4): 34.2 г сахарозы и 21.4 г какодилата натрия растворить в 300 мл воды; добавить 3 мл 1 М раствора НСl; долить водой до 500 мл; отъюстировать рН с помощью 0,1 М раствора NaOH.

2.2.5. 0,2 М коллидиновый буфер (рН 7.4)

Растворить 26.7 мл S-коллидина в 500 мл воды; добавить 90 мл 1.0 М раствора НСl; долить водой до 1000 мл.

2.2.6. Трис-HCI буфер

Раствор А: 0,2 М Трис (24.2 г Трис долить водой до 1000 мл).
Раствор Б: 0,1 М НСl.
Слить 25 мл раствора А с соответствующим объемом раствора Б, долить водой до 100 мл.

РН	7.19	7.36	7.54	7.66	7.77	7.87	7.96	8.05	8.14
Б, мл	45.0	42.5	40,0	37.5	35.0	32.5	30,0	27.5	25.0

рН	8.23	8.32	8.41	8.51	8.62	8.74	8.92	9.10
Б, мл	22.5	20,0	17.5	15.0	12.5	10,0	7.5	5.0

2.2.7. 0,2 М Трис-малеатный буфер

Раствор А: 24.2 г Трис и 232 г малеиновой кислоты (или 19.6 г малеинового ангидрида) растворить в воде; объем довести до 1000 мл.
Раствор Б: 0,2 М раствор NaOH.
Слить 25 мл раствора А с соответствующим объемом раствора Б, долить водой до 100 мл.

рн	5.8	6.0	6.2	6.4	6.6	6.8	7.0	7.2
Б, мл	10,3	13.0	15.8	18.5	21.3	22.5	24.0	25.5

рН	7.4	7.6	7.8	8.0	8.2	8.4	8.6
Б, мл	27.0	29.0	31.8	34.5	37.5	40,5	43.3

2.2.8. Натрий-малеатный буфер [253]

Раствор А: 1.96 г малеинового ангидрида (или 2.32 г малеиновой кислоты) и 0,8 г едкого натра растворить в воде, объем довести до 100 мл.
Раствор Б: 0,2 М раствор NaOH (= 0,8%). 0,2 М буфер: слить 50 мл раствора А с соответствующим объемом раствора Б, долить водой до 200 мл.

рН	5.2	5.4	5.6	5.8	6.0	6.2	6.4	6.6	6.8
Б, мл	7.2	10,5	15.3	10,8	26.9	33.0	38.0	41.6	44.4

0,05 М буфер: слить 10 мл 0,2 М буфера и 30 мл воды.

2.2.9. Вероналовый буфер [253]

Раствор А: 0,1 М веронала натрия (= 2.06%).
Раствор Б: 0,1 М HCI - 0,83 мл концентрированной НСl растворить в 100 мл Н₂О.
Взять соответствующее количество раствора А и долить раствором Б до 100 мл.

рН	6.8	7.0	7.2	7.4	7.6
А, мл	52.2	53.6	55.4	58.1	61.5

2.2.10. 0,028 М вероналацетатный буфер [253]

Вариант 1. Приготовить растворы А-В.
Раствор А: взвесить 2.95 г веронала натрия и 1.17 г ацетата натрия (или 1.94 г CH₃COONa"3Н₂О), долить водой до 100 мл; выдержать 24 ч.
Раствор Б: 0,1 М НСl. Раствор В: 85%-ный раствор NaCl.
Слить соответствующие объемы растворов А, Б, и В, долить водой до 100 мл.

рН	3.0	4.0	5.0	6.0	6.8	7.0	7.2	7,4 1
А, мл	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0	20,0
Б, мл	61.6	50,2	35.2	28.4	25.6	24.2	22.6	20,2
В, мл	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0	8.0

Вариант 2 (рН 7.2). Растворить в воде 1.493 г ацетата натрия и 2.943 г веронала натрия, объем довести до 100 мл; слить 5 мл этого раствора и 5.5 мл 0,1 М НСl, долить водой до 25 мл.
Вариант 3 (рН 7.2). Слить 10 мл раствора Г, 3.4 мл раствора Рингера, 25 мл воды и 11 мл раствора Б.

2.2.11. 0,3 М пиперазиновый буфер [253]

0,3 М буфер: 9.0 г ПИПЕС растворить в 50 мл воды, оттитровать рН с помощью 0,1 М раствора NaOH (= 0,4%), долить водой до 100 мл.
0,2 М буфер: слить 20 мл 0,3 М раствора и 10 мл воды.
0,1 М буфер: слить 10 мл 0,3 М раствора и 20 мл воды.
0,08 М буфер: слить 8 мл 0,3 М раствора и 22 мл воды.
Использование: для животных тканей - префиксация 3%-ным раствором ГА на 0,1 М пиперазиновом буфере (рН 8.0), постфиксация 2%-ным раствором ЧО на 0,08 М пиперазиновом буфере (рН 6.8); для растительных тканей - префиксация 5%-ным раствором ГА на 0,08 М пиперазиновом буфере (рН 8.0), постфиксация 2%-ным раствором ЧО на 0,2 М пиперазиновом буфере (рН 6.8). Раствор ГА стабилен на протяжении 1 мес. Раствор ЧО портится в течение 1 ч.

2.2.12. Ацетатный буфер [253]

Раствор А: 0,2 М уксусная кислота (= 1.2%) - 12.0 г уксусной кислоты развести водой до 1000 мл.
Раствор Б: 0,2 М раствор ацетата натрия (= 1.64% CH₃COONa или 2.74% CH₃COONa"3Н₂О) - 16.4 г ацетата натрия растворить в воде, объем довести до 1000 мл.
0,1 М буфер: слить соответствующие объемы растворов А и Б, долить водой до 1000 мл.

рн	3.6	3.8	4.0	4.2	4.4	4.6	4.8	5.0	5.2	5.4	5.6
А, мл	46.3	44.0	41.0	36.8	30,5	25.5	20,0	14.8	10,5	8.8	4.8
Б, мл	3.7	6.0	9.0	13.2	19.5	24.5	30,0	35.2	39.5	41.2	45.2

2.2.13. Буфер Мак-Ильвейна (Na-фосфатцитратный)

Раствор А: 0,2 М раствор Na2HP04 (см. Приложение, 2.2.3).
Раствор Б: 0,1 М раствор лимонной кислоты.
Слить соответствующие объемы растворов А и Б.

рн	4.0	4.2	4.4	4.8	5.0	5.2	5.4	5.6	5.8	6.0
А, мл	7.7	8.3	8.8	9.4	10,3	10,7	11.2	11.6	12.1	12.6
Б, мл	12.3	11.7	11.2	10,6	9.7	9.3	8.8	8.4	7.9	7.4

рн	6.2	6.4	6.6	6.8	7.0	7.2	7.4	7.6	7.8	8.0
А, мл	13.2	13.9	14.6	15.5	16.5	17.4	18.2	18.7	19.2	19.5
Б, мл	6.8	6.1	5.4	4.5	3.5	2.6	1.8	1.3	0,8	0,5

2.2.14. 0,2 М хроматный буфер

рН 6.2: 0,40 г бихромата калия и 2.79 г хромата натрия растворить в 100 мл бидистиллированной воды.
рН 7.2: 2.23 г бихромата калия и 0,79 г хромата натрия растворить в 100 мл бидистиллированной воды.

3. ФИКСАЦИЯ

3.1. Схема препарирования объектов для ТЭМ [253]

Процедура	Длительность процедуры, мин
Процедура		минимум	оптимум	максимум
ГА	10-60	90	24 ч
Промывание	10	30	24 ч
ЧО	60	90	24 ч
Промывание	10	30	24 ч
Дегидратант (Д):
30%-ный (можно исключить)	1	5	30
50%-ный	1	5	30
70%-ный	1	5	На ночь
96%-ный	1	5	-"-
100%-ный	5 раз по 3	5 раз по 6	-"-
Смесь (1 : 2) 100%-ного Д с ЗС	5	10	-"-
ЗС	5	10	-"-
Полимеризация		24-48 ч

3.1. Агаровый гель для контроля за температурой фиксации

Смешать 100 мл 0,9%-ного раствора NaCl и 29 мл агара, нагреть до расплавления, добавить 0,5 мл красителя Гимза, охладить и нарезать блоками.

3.2. Очистка ГА

К 200 мл 25%- или 50%-ного раствора ГА добавить активированный уголь (30,0 г), встряхивать 1 ч, отфильтровать под вакуумом (фильтр - Ватман N 42), жидкость вновь смешать с такой же свежей порцией активированного угля и все повторить еще раз. Выход составляет 20-30 мл очищенного ГА. В процессе фильтрации концентрация и объем ГА снижаются, а рН повышается: 1-я фильтрация - объем уменьшается с 200 до 150 мл, концентрация ГА падает с 25 до 22%, рН повышается до 5.8; 2-я фильтрация - объем снижается до 95 мл, концентрация - до 18%, рН возрастает до 6.9. Конечная концентрация ГА составляет 8-12%, рН 8.0 (поскольку ГА в щелочной среде быстро полимеризуется, надо немедленно добавить несколько капель НСl).
При дистилляции под атмосферным давлением дистиллят собирают при t=100®С порциями по 50 мл, в которых определяют рН. Если рН < 3.4, то порцию выбрасывают.
Дистилляция под слабым вакуумом проводится в колбах путем их нагревания до t=65®С. После снятия вакуума дистиллят (вязкая прозрачная жидкость) разводят таким же количеством свежепрокипяченной деминерализованной воды путем медленного добавления последней (t=75®С) к дистилляту на магнитной мешалке под азотом.

3.3. Регенерация ЧО

К 500 мл использованного раствора ЧО постепенно добавить при постоянном помешивании 5 мл концентирированной серной кислоты и 200 мл 6%-ного раствора перманганата калия и оставить на 30 мин. Если раствор стал коричневым, то надо добавить свежий перманганат, чтобы цвет вновь стал фиолетовым.
Смесь следует экстрагировать путем интенсивного встряхивания в течение 2-3 мин в делительной воронке с тремя последовательно сменяемыми порциями по 150 мл ССЦ. Более тяжелую фракцию четыреххлористого углерода, содержащую ЧО, тщательно отделить в делительной воронке от водной фракции, содержащей двуокись марганца.
Добавить 10 мл абсолютного этанола. При этом цвет раствора становится более темным и начинает осаждаться осмиевая чернь (O_SO₂). Колбу закрыть и оставить на 48 ч при t=20®С. Бесцветный супернатант слить, а осадок оставить. Добавить к осадку 20 мл абсолютного ацетона. Колбу несколько раз встряхнуть, осадок, прилипший к стенкам, тщательно счистить стеклянной палочкой. Взвесь отфильтровать через фильтровальную воронку с сухим фильтром (Ватман N 1). Колбу промыть добавочными порциями ацетона для удаления остатков осмиевой черни. Ацетон отфильтровать через тот же фильтр. Осадок O_SO₂ промыть тремя порциями ацетона по 50 мл. Бумажный фильтр с осадком поместить на фарфоровую пластинку и перенести в вакуумную сушилку на ночь. В камере желательно иметь влагопоглотитель (хлорид кальция и т.п.).
Сухой порошок O_SO₂ собрать в небольшую стеклянную бутылку и закрыть пробкой; здесь он может храниться неограниченное время. Из каждого литра использованного 2%-ного раствора ЧО получается около 5 г сухой осмиевой черни (O_SO₂).
Для приготовления раствора ЧО 1.0 г сухого порошка O_SO₂ поместить в чистую стеклянную бутылку, добавить 45 мл воды для получения суспензии, а затем 1 мл 30%-ной перекиси водорода; все перемешать, закрыть кусочком алюминиевой фольги и поместить в холодильник на 30 мин. Если растворилась не вся двуокись осмия, то бутылку оставить еще на 30 мин.
При наличии иодидов и двухромовокислого калия метод не работает.

3.4. Приготовление раствора ФА

Размешать параформ (2.0 г) в 25 мл воды; нагреть до t=60®С (закрыв пробку), добавить 1-5 капель 1 М NaOH до просветления, охладить.

3.5. Фиксаторы на основе ГА

Вариант 1. Слить 10 мл 25%-ного раствора ГА и 90 мл 0,1 М ФБ (рН 7.4), добавить 2 капли 1%-ного раствора CaCl₂.
Вариант 2. Слить 10 мл 25%-ного раствора ГА и 90 мл раствора Хэнкса (или среды 199), добавить 1-2 капли 0,1 М раствора NaOH до окрашивания раствора в красный цвет.
Вариант 3. Приготовить на 0,1 М ФБ (рН 7.4) 15%-ный раствор ГА, содержащий 2.5% поливинилпирролидона.
Вариант 4, фиксатор Милонига. Слить 415 мл 2.26%-ного раствора NaН₂PО₄ "2Н₂О, 8.5 мл 2.52%-ного раствора NaOH и довести рН до 7.3. К 50 мл этого раствора добавить по каплям, помешивая, 0,1 мл 0,5 М раствора CaCl₂. К 42 мл полученного раствора добавить 8 мл 25%-ного ГА.

3.6. Фиксаторы на основе ФА

Вариант 1. Приготовить 4%-ный ФА на 0,1 М КБ (рН 7.4). Фиксация длится 2-16 ч.

3.7. Фиксаторы на основе ЧО

3.7.1. ЧО с двухромовокислым калием[253]

Вариант 1. В 25 мл 0,13 М ФБ (рН 7.7) растворить 0,175 г К2СГ2О7 (рН снизится до 6.8) и 0,5 г ЧО. Фиксация длится 1-2 ч.
Вариант 2. Растворить 2.0 г K₂Cr₂O₇ в 40 мл воды, довести рН до 7.2 с помощью 5 М раствора КОН. Слить 2 мл этого раствора, 2 мл 3.4%-ного NaCl и 4 мл 2%-ного ЧО. Раствор фиксатора стабилен несколько месяцев. Фиксация длится 1-24 ч.

3.7.2. Фиксатор Милонига

Вариант 1. Приготовить растворы А-Г.
Раствор А: 5.1%-ный раствор NaН₂PО₄ "Н₂О.
Раствор Б: 5.5%-ный раствор NaOH.
Раствор В: 5.4%-ный раствор глюкозы.
Раствор Р. слить 49.5 мл раствора А и 10,8 мл раствора Б.
Слить 20 мл раствора Г, 5 мл раствора В и 25 мл 2%-ного раствора ЧО.

Вариант 2. Слить 14.0 мл 6.71%-ного раствора NaН₂PО₄ "Н₂О, 8.5 мл 2.52%-ного раствора NaOH, 55 мл 5.4%-ного раствора глюкозы, 27.5 мл 2%-ного раствора ЧО, 0,3 мл 1%-ного раствора CaCl₂.

3.8. Фиксаторы на основе акролеина

3.8.1. 10%-ный акролеин на ФБ [253]

Слить 25 мл 0,2 М ФБ (рН 7,6), 5 мл чистого акролеина и 20 мл воды. Фиксация длится 30-120 мин.

3.9. Смешанные фиксаторы

3.9.1. Фиксатор Карновского

Приготовить на 0,08 М КБ (рН 7.2) раствор, содержащий 5% ГА и 4% ФА, и добавить 5 ммоль/л CaCl₂.

3.9.2. Разведенный фиксатор Карновского

Приготовить 1%-ный раствор ГА и 1%-ный раствор ФА на 0,1 М КБ (рН 7.3).

3.9.3. Фиксатор с акролеином

Слить 50 мл 0,2 М КБ (рН 7.4), 1 мл акролеина, 8 мл 25%-ного раствора ГА, долить водой до 100 мл. Фиксация длится 2 ч. Нельзя добавлять сахарозу.

3.9.4. Фиксатор:1 акролеин + ФА + ГА + ДМСО [253]

Слить 44.0 мл 2%-ного раствора ФА на 0,1 М КБ (рН 7.4), 5.0 мл 25%-ного раствора ГА, 05 мл акролеина, 1.25 мл ДМСО и добавить 8 мг CaCl₂. Время фиксации - до 16 ч. Промывание в 0,1 М КБ (рН 7.4) с 0,1 М сахарозой (= 3.4%) длится 10 мин. Постфиксация 2%-ным раствором ЧО в 0,2 М сахарозе (= 7%) - в течение 2-4 ч. Затем осуществить обезвоживание и заключение в смолу.

3.9.5. Фиксатор: ГА + ФА + акролеин + УА

Приготовить на 0,1 М коллидиновом буфере (рН 6.8) раствор, содержащий 1% акролеина, 1% ФА, 1% ГА и 2% УА.

3.10. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ФИКСАТОРЫ

3.10.1. ЧО + феррицианид натрия

Вариант 1. К 1%-ному раствору ЧО на 0,1 М КБ (рН 7.4) добавить ex tempore 50 ммоль/л феррицианида натрия. Фиксация длится 2 ч (t=4®С).
Вариант 2. Приготовить на 0,1 М ФБ (рН 6.0) раствор, содержащий 2% ЧО и 1.5% феррицианида калия. Фиксация длится 2 ч (t=4®С).

3.10.2. ЧО + ферроцианид калия

Смешать равные объемы 2%-ного раствора ЧО и 3%-ного раствора ферроцианида калия, приготовленного за 10 сут до этого; оба раствора готовят на 0,2 М КБ (рН 7.4). При смешивании ЧО с ферроцианидом калия раствор приобретает темно-коричневый цвет, поскольку ЧО восстанавливается. Постфиксация длится 2 ч (t=4®С). Промывать объекты в 6.8%-ном растворе сахарозы на 0,1 М КБ (рН 7.4), до тех пор пока промывочный раствор не станет прозрачным.
Провести обезвоживание и заключение в смолу.

3.10.3. Фиксатор для выявления гликозаминогликанов

Приготовить 2%-ный раствор ГА с добавлением 0,1-1% аль-цианового синего (рН 6.5). В постфиксатор следует добавить лантан - осадок будет виден более четко.

3.10.4. Фиксатор для выявления липидов

Приготовить на КБ (рН 7.1) 2%-ный раствор ГА с добавлением 0,1% малахитового зеленого.

3.10.5. ГА + таниновая кислота

Вариант 1. Приготовить 0,5%-ный раствор ГА на 0,05-0,1 М ГЕПЕС-буфере (рН 7.4) с добавлением 0,2% ТК.
Вариант 2. Растворить 0,5 г ТК в 22.5 мл 0,05 М КБ (рН 6.8), добавить 2,5 мл 25%-ного раствора ГА. Фиксация длится 120 мин, промывание в 8%-ном растворе сахарозы на 0,05 М КБ (рН 6.8) -в течение ночи, постфиксация в 1%-ном растворе ЧО на 0,05 М КБ (рН 6.8) с добавлением 7% сахарозы - в течение 1.5 ч.

3.10.6. Обработка таниновой кислотой

Фиксация перфузией 1%-ного раствора ГА на 0.1 М КБ (рН 7.3) с добавлением 1% ТК в течение 5 мин. Фиксация иссеченных кусочков в том же растворе в течение 2 ч. Промывание в КБ с добавлением 180 ммоль/л сахарозы. Постфиксация в 1%-ном растворе 40 на КБ (рН 7.3) в течение 1 ч.

3.10.7. ГА + лизин

Раствор А: свежеприготовленный очищенный 4%-ный раствор ГА на 0.05 М КБ (рН 7.4).
Раствор Б: свежеприготовленный 0.1 М раствор лизина (осно вания) на 0.05 М КБ (рН 7.4).
Раствор В: слить растворы А и Б (1 : 1), рН снизится.
Раствор Г: слить раствор А и 0.5 М КБ (рН 7.4) (1 : 1). Фиксировать 10-60 мин в растворе В, а затем 60 мин (можно оставить на ночь) в растворе Г.

3.10.8. Перйодат + лизин + ФА [246]

Раствор А: к 0.2 М раствору гидрохлорида лизина добавлять 0.2 М раствор Na₂НPО₄, до тех пор пока рН не будет равен 7.4; раствор развести в 2 раза с помощью 0.1 М ФБ (рН 7.4).
Раствор Б: растворить 8.0 г параформа в 100 мл воды (t=65®С), добавить несколько капель 40%-ного раствора NaOH для просветления жидкости и растворить 5.4 г глюкозы.
Перед использованием смешать растворы А и Б (3 : 1) и добавить 10 ммоль/л метаперйодата натрия. Продолжительность фиксации - до 3 сут (t=4®С).

3.10.9. Фиксатор для МВИ

Приготовить на 0.1 М КБ (рН 7.2) раствор, содержащий 2% ФА, 0.5% ГА, 2 ммоль/л CaCl₂ и 1 ммоль/л MgCl₂. Облучение продолжается 20 с (2.45 гГц, 500 Вт). Кусочки оставляют в фиксаторе на 60 мин (t < 35®С).

3.10.10. Фиксатор для перфузии и иммуно-ЭМ [281]

Приготовить на 0.1 М КБ (рН 8.0) раствор, содержащий 2% ФА, 1% акролеина, 0.05% ГА, 0.1% пикриновой кислоты, 1% сахарозы.

3.10.11. Фиксатор для иммуно-ЭМ

Вариант 1. Нагреть в конической колбе 100 мл 0.2 М ФБ (рН 7.2) до t=60®С, добавить 8.0 г параформальдегида, интенсивно перемешать, добавить 1-3 капли 1 М раствора NaOH. Нагревать смесь до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (но не до кипения!); охладить, добавить 4 мл 25%-ного раствора ГА, долить водой до 200 мл, оттитровать рН.
Вариант 2 [227]. Приготовить 0.5%-ный раствор ФА, содержащий 0.1 моль/л циклогексиламина (основания), 2 ммоль/л ЭГТА, 5 ммоль/л ПИПЕС, 2 ммоль/л MgCl₂ (рН 6.5).

3.10.12. Фиксатор для иммуно-ЭМ и МВИ [255]

Приготовить 4%-ный раствор ФА, содержащий 0.1% ГА, 2 ммоль/л CaCl₂, 2 ммоль/л MgCl₂. Время воздействия МВИ 15-30 с. После МВИ объекты оставить в том же растворе на 1 ч.

3.10.13. Постфиксационная обработка ТК [323]

Фиксировать в 2%-ном растворе ГА на 0.1 М КБ (рН 7.4) в течение 90 мин. Промыть в КБ 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО на том же буфере 90 мин. Промыть в КБ (рН 7.2) 10 мин. Обработать в 1%-ном растворе ТК на 0.05 М КБ (рН 7.0) 30 мин. Промыть в 1%-ном растворе сульфата натрия на 0.05 М КБ (рН 7.0) 5 мин. Обезводить, заключить в эпоксидную смолу.

4. ЗАЛИВКА

4.1 Свойства основных компонентов эпоксидных смол [156]

Название	Молекулярная масса	Вязкость, сП	Плотность, г/мл	ВПЕ
ДДСА (DDSA)	266	290-295	1.0	-
МНА (MNA)	178	225-275	1.24	-
НСА (NSA)	224	117-120	1.00-1.05	-
ГХСА (HXSA)	182	20-26	1.00-1.10	-
ОСА (OSA)	210	32	1.00	-
Аралдит М (Araldit)	-	1300-1650	1.1-1.15	226-242
Аралдит MY 753	-	1800-2800	1.13-1.17	219-235
Аралдит 502	-	2100-3600	1.13-1.17	222-238
Эпон 812 (Ероп)	-	120-210	1.15-1.22	145-160
Г ТААБ (ТааЬ)	-	-	1.11	-
ДЕР 732 (DER)	-	-	1.07	-
Мараглас 655 (Maraglas)	-	-	1.19	-
Дибутилфталат	-	-	1.04	-
БДМА (DDMA)	-	-	0.93	-
ДМАЕ или Сl (DMAE, S1)	-	-	0.9	335

4.2. Стандартные заливочные смеси эпона и аралдита [156]

Название компонента	Аралдит, мл(г)	Эпон, мл(г)			Эпон+Аралдит, мл(г)
Название компонента	Аралдит, мл(г)			А	Эпон+Аралдит, мл(г)	Б	В
Аралдит	19.0(22.0)	-	-	-	12.0(14.0)
Эпон	-	20.0(24.0)	20.0(24.0)	20.0(24.0)	20.0(24.0)
ДДСА	21.0(21.0)	22.0(22.0)	16.0(16.0)	9.0(9.0)	50.0(50.0)
МНА	-	5.0(6.0)	8.0(10.0)	12.0(15.0)	-
БДМА	1.2(1.3)	1.4(1.5)	1.3(1.5)	1.2(1.4)	2.5(2.6)
ДБФ*	0.6(0.6)	-	-	-	0.4(0.4)

*Только для Аралдита 502 и Аралдита MY753.
Блоки: А - мягкие, Б - средней твердости, В - твердые.

4.3. Стандартная схема заливки объектов в эпоксидные смолы [156]

N п/п	Этап	Длительность этапа
1	Обезвоживание в 100%-ном этаноле	30 мин
2	Замещение этанола его смесью с окисью пропилена (1 : 1)	10 мин
3	Инфильтрация чистой окисью пропилена	10 мин
4	Инфильтрация смесью смолы и окиси пропилена (1 : 1)	1-2 ч
5	Инфильтрация полной заливочной смесью эпоксидной смолы	На ночь
6	Инфильтрация полной заливочной смесью эпоксидной смолы	2-4 ч
7	Полимеризация при t=60®С	24-48 ч

4.4. Ускоренное обезвоживание и пропитывание

После обезвоживания в абсолютном этаноле кусочки поместить для пропитывания в смесь смолы с абсолютным этанолом (1: 1) и поставить в термостат при t=37®С на 30 мин; затем перенести в смесь для пропитки и оставить при t=37®С на ночь. После этого кусочки переложить в полную заливочную среду (ЗС) на 1-2 ч, а затем перенести в капсулы со смесью для заливки. Капсулы поместить в термостат на несколько часов при t=37®С, а затем на 2 сут при t=56®С.

4.5. Заливочная среда ТААБ [253]

Компонент	Количество компонента, мл
Компонент		А	Б	В
ТААБ (смола)	20.0	20.0	20.0
ДДСА (пластификатор)	20.0	10.0	2.0
МНА (отвердитель)	-	10.0	18.0,
Все смеша т ь
БДМА (акселератор)	1.2	1.2	1.2
Время полимеризации, ч	24-48

Блоки: А - мягкие, Б - средней твердости, В - твердые.

4.6. Заливка в смолу с низкой вязкостью (СПЕРРА) [336]

Компонент	Количество компонента, г
Компонент		А	Б	В	Г	Д
ЕРЛ 4206 (ERL 4206) (смола)	10.0	10.0	10.0	10.0	10.0
ДЕР 736 (пластификатор)	6.0	4.0	8.0	6.0	6.0
НСА (отвердитель)	26.0	26.0	26.0	26.0	26.0
ДМАЕ (акселератор)	0.4	0.4	0.4	1.0	0.2
Общее количество	42.4	40.4	44.4	43.0	42.2
Время полимеризации, ч (t=37®С)	8	8	8	3	16
Сохранность ЗС, сут	3-4	3-4	3-4	2	7

Блоки: А - стандартной твердости, Б - твердые, В - мягкие.
Полимеризация: Д - быстрая, Г - медленная.
Пропитывание. К последней смене 100%-ного этанола добавить столько же ЗС, инкубировать 30 мин. Затем к этой смеси добавить равное количество ЗС - на 30 мин. Объект перенести в свежую порцию ЗС и оставить на 4 ч, заменить на свежую ЗС, пропитывание длится всю ночь.

4.7. Заливочная смесь Мараглас + Кардолит

Вариант 1. Отмерить 60-70 мл Марагласа 655, 20-30 мл Кардолита НС-513, 5-10 мл ДБФ. Перемешать и добавить 2 мл БДМА. После окиси пропилена поместить в разведенную окисью пропилена ЗС (1: 1) на 30 мин, а затем в свежую ЗС на 12 ч. Залить в капсулы и полимеризовать при t=60®С 48-72 ч.
Вариант 2 [253]. Отмерить 34 мл Марагласа 655, 10 мл Кардолита НС-513, 5 мл ДБФ. Перемешать и добавить 1 мл БДМА (2%). После обработки окисью пропилена объекты поместить в закрытые контейнеры с ЗС (t=10®С) на 12 ч, а затем перенести их в капсулы с ЗС (t=60®С) на 48 ч.
Вариант 3. Отмерить 36 мл Марагласа 655, 8 мл ДЕР 732, 5 мл ДБФ. Перемешать и добавить 2% БДМА (1 мл или 4 капли на каждые 5 мл).

4.8. Заливочная среда Вестопал В [253]

К 50.0 мл Вестопала В (Westopal W) добавить 0.5 мл инициатора (катализатора) и перемешать, затем добавить 0.25 мл активатора (ускорителя) и снова перемешать.
После обезвоживания в ацетоне поместить объекты в смесь Вестопала В с ацетоном 3 : 7 на 30 мин, затем в смесь 5 : 5 на 30 мин, затем в смесь 7 : 3 на 30 мин и, наконец, в смесь 9 : 1 на 30 мин. Пропитать в ЗС Вестопал В 2 раза по 1 ч. Поместить в свежую ЗС в капсулах на 24 ч. Полимеризация длится 24 ч (t=60®С).

4.9. Заливочная среда Д.Е.Р. (D.E.R.) [253]

Компонент	Количество компонента, мл
Компонент		А	Б	В
ДЕР 332 (нагреть до 60®С)	7	6	7
ДЕР 732	3	3	2
ДДСА	5	10	5
Все смешать
БДМА	0.45	0.57	0.42

Блоки: А - средней твердости для обычного использования, Б -средней твердости с повышенной терморезистентностыо, В - твердые для твердых тканей.
Пропитывание. После обработки окисью пропилена поместить объекты в смесь окиси пропилена с ЗС (1 : 1) в закрытом контейнере на 1 ч (t=45®С); перенести объекты в открытый контейнер с ЗС (t=37®С) на 1 ч; разлить свежую ЗС в капсулы и поместить в них объекты (t=37®С) на 24 ч, затем температура поднимается до 45®С на 24 ч, после чего температуру поднять до 60®С на 24 часа; изготавливать УС можно через 24 ч.

4.10. Заливочная смесь ЕРЛ 4206 [253]

Компонент	Количество компонента, г
	А	Б	В
ЕРЛ 4206 (ERL 4206)	20	20	20
ДЕР 736	16	12	8
НСА	52	52	52
Все смешать
ДМАЕ (в зависимости от продолжительности полимеризации) при t=70®С
16 ч	0.4 г (1% или 1 капля на 2 г смеси)
8 ч	0.8 г (2% или 1 капля на 1 г смеси)
3 ч	2.0 г (5%, или 5 капель на 2 г смеси)

Блоки: А - средней твердости для обычного использования, Б - средней твердости с повышенной терморезистентностью, В - твердые для твердых тканей.
Пропитывание. После обработки в окиси пропилена объект поместить в смесь окиси пропилена с ЗС 1 : 1 на 30 мин, в смесь 3 : 1 на 30 мин, в полную ЗС (при постоянном помешивании) на 3-4 ч; перенести объекты в свежую ЗС в капсулах и оставить на ночь (последний этап для плотных тканей) в термостате.

4.11. Заливка в полиэтиленгликоль (ПЭГ)

Обезводить объект в возрастающих концентрациях ПЭГ (лучше всего использовать ПЭГ-3350, который является жидким при t=55®С). Если необходимы более толстые срезы (более 0.5 мкм), то рекомендуется использовать ПЭГ-3350 в смеси с ПЭГ-1500 (9 : 1). Пропитать объект в водных растворах ПЭГ с возрастающей концентрацией (25, 40, 50, 70, 95%) по 10-20 мин. Инфильтрировать в 100%-ном ПЭГ 3 раза по 60 мин (t=55®С). Объекты при переносе быстро обсушить на фильтровальной бумаге, можно обезвоживать в этаноле, а затем выдержать в смеси этанола и ПЭГ (1 : 1) и 100%-ном ПЭГ по 60 мин.
Налить ПЭГ в желатиновые капсулы, поместить туда объект и быстро охладить капсулы в жидком азоте. Резание проводить на сухой стеклянный или алмазный нож.

4.11.1. Монтирование срезов, залитых в ПЭГ

Вариант 1. УС (или ПС) с сухого ножа с помощью ресницы перенести на покрытые полилизином сеточки или стекло, которые в свою очередь на 1-5 мин поместить в термостат (t=55®С). Срезы расправить и прикрепить к сеточке или стеклу.
Вариант 2. Петлю диаметром 2-3 мм, сделанную из платиновой проволоки и прикрепленную к деревянной палочке, погрузить в 2.3 М сахарозу или в 40%-ный раствор ПЭГ на 0.1 М ФБФР. Петлей, с образовавшейся на ее конце каплей, нужно коснуться ленты УС, контролируя процедуру под стереомикроскопом. УС предварительно следует отодвинуть от лезвия ножа, чтобы капля не коснулась ножа. УС на капле затем перенести на сеточку или на стекло.

4.13. Замещение воды в замороженном состоянии

Вариант 1. Быстро заморозить объекты с линейными размерами меньше 1 мм. Поместить в 0.5%-ный УА на метаноле (t=-80®С) на 5 ч. Медленно (в течение 5-6 ч) поднять температуру до -35®С и оставить в свежем метаноле на 7 ч. Поместить в смесь Ловикрила К4М с метанолом (2 : 1). Далее - по протоколу 5.2.
Вариант 2 [268]. Поместить монослой клеток в среду А или Б на 2 сут (t=-90 ® С).
Среда А: смешать 0.5 мл 70%-ного раствора ГА, 0.5 мл 0.2 М КБ (рН 7.2) и 9.0 мл 100%-ного этанола.
Среда Б: приготовить на метаноле раствор, содержащий 3% ГА, 1% ЧО, 0.5% УА, для лучшего растворения компонентов можно добавить 3% воды.
Вариант 3. Поместить объект в среду В (см. ниже) при t=-80®С, поднять температуру до -60®С, а затем до -40®С (держать по 24 ч соответственно). Перенести в ацетон (три смены по 1 ч) (t =0®С). Заключить в аралдит.
Среда В: 6 мл диметоксипропана; 3 мл ацетона; 2.25 мл метанола; 0.75 мл 10%-ного раствора УА на метаноле; 0.6 мл 25%-ного раствора ГА, 0.1 г ЧО.

5. НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЕ ПРЕПАРИРОВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ДЛЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ЗАЛИВКИ

5.1. Состав смол [109]

Ловикрил (Lowicryl) К4М: компонент А (отвердитель) - 2.7 г, компонент Б (мономер) - 17.3 г, компонент Г(6) (инициатор -этиловый эфир бензоина) - 0.10 г.
Ловикрил НМ20: компонент Д (отвердитель) - 2.98 г, компонент Е (мономер) - 17.02 г, компонент С (инициатор) - 0.10 г.
Ловикрил К11М: компонент А (Н) (отвердитель) - 1.0 г, компонент Б (I) (мономер) - 19.0 г, компонент В (С) (фотоинициатор -метиловый эфир бензоина) - 0.10 г.
Ловикрил НМ23: компонент A (F) (отвердитель) - 1.1 г, компонент Б (G) (мономер) - 18.9 г, компонент С (фотоинициатор) -0.10 г (если полимеризация проводится при t > -50®С) или I (инициатор - Igracure 651) - 0.10 г (если полимеризация проводится при температуре от -50 до -70®С), либо 0.15 г (если полимеризация идет при t < -70®С).
ЛР ВАЙТ: 100 мл мономера и 10 капель ускорителя.
ЛР ГОЛД: 100 мл мономера и 4 мл ускорителя (0.5%-ного бензила).

5.2. Обезвоживание и заливка в Ловикрил К4М

Вариант 1. Обезводить объект в этаноле: в 30%-ном растворе 30 мин (t=20®С), в 50%-ном растворе 60 мин (t=0®С), в 80%-ном растворе 60 мин (t=-20®С), в 100%-ном этаноле 2 раза по 60 мин (t=-35®С). Пропитать в ЗС К4М, разведенной 100%-ным этанолом: в смеси 1: 1 - 60 мин (t=-35®С), в смеси 3:1-60 мин (t=-35®С). Поместить в чистую ЗС К4М на 60 мин (t=-35®С), в новой ее порции оставить на ночь (t=-35®С), а затем в желатиновых капсулах с такой же ЗС выдержать 6 ч (t=-35®С). Полимеризацию осуществить с помощью УФО (t=-35®С) в течение 24 ч. Ускоритель не добавлять.
Вариант 2. Обезводить объект в метаноле: в 50%-ном растворе 10-15 мин (t=0®С), в 80%-ном растворе 30-60 мин (температура от -20 до -30®С), в 90%-ном растворе 30-60 мин (температура от -20 до -30®С). Пропитать в ЗС К4М (без инициатора), разведенной 100%-ным метанолом: в смеси 1: 1 - 30 мин (t=-30®С), в смеси 2 : 1 - 60 мин (t=-30®С). В чистой ЗС К4М (без инициатора) инкубировать 2 раза по 60 мин (t=-30®С), в новой ее порции оставить на ночь (t=-30®С). В чистой полной (добавить 0.6% метилового эфира бензоила) ЗС К4М в желатиновых капсулах выдержать 6 ч (t=-30®С). Полимеризацию осуществить с помощью рассеянного УФО (А=360 нм) в течение ночи (t=-30®С). Затем блоки вынуть из холодильной камеры и дополимеризовать с помощью УФО в течение 2-3 сут (t=20®С).

5.3. Заливка в Ловикрил КИМ

Обезводить объекты в дегидратанте (Д), лучше использовать метанол (проводят так, как описано в прописи 5.2, но при t=-60®С). Пропитать в смеси Д и ЗС (в соотношении 1 : 1) в течение 8 ч (t=-60®С), в разведенной среде (2 : 1) - 8 ч (t=-60®С), в не-разведенном заливочном составе - 8 ч (t=-60®С), в новой порции свежего состава для заливки - 8 ч (t=-60®С), в свежем составе для заливки в желатиновых капсулах выдержать 8 ч (t=-60®С). Полимеризацию осуществить с помощью рассеянного УФО (Л=360 нм) в течение 72 ч (t=-60®С), а затем 2-3 сут под прямым УФО при комнатной температуре.

5.4. Заливка в Ловикрил НМ23

То же самое, что и в прописи 5.3, но обезвоживание и пропитывание проводить при t=-80®С, и полимеризацию продолжать 6 сут под рассеянным УФО при t=-70®С, а затем 2-3 сут с помощью прямого УФО при комнатной температуре.

5.5. Заливка в ЛР ВАЙТ (LR WHITE) [224]

Вариант 1. Объект фиксировать в альдегиде. Промыть в буфере в течение 20 мин. Обезводить в возрастающих концентрациях этанола: в 50%-ном растворе - 2 раза по 30 мин, в 60%-ном растворе - 2 раза по 30 мин, в 70%-ном растворе - 2 раза по 30 мин. Пропитать в смеси смолы с 70%-ным этанолом (1 : 1) в течение 1ч, затем в неразбавленной смоле еще 12 ч (можно сменить ее несколько раз). Поместить объект в смолу, разлитую в желатиновые капсулы, и полимеризовать (при температуре от 50 до 60®С) в течение 24 ч. "Тепловую" полимеризацию лучше проводить в бескислородной среде.
Вариант 2. Химическая полимеризация. После фиксации обезводить объект в 70%-ном этаноле - 3 раза по 10 мин. Пропитать в смоле - 2 раза по 20 мин (t=4®С). Поместить в желатиновые капсулы с составом для заливки (t=4®С) - реакция экзотермичная (хотя температура редко поднимается выше 50®С), поэтому склянки лучше поставить в ванну с водой для отвода тепла. Дегидратацию можно проводить прямо в нескольких сменах смолы.
Заливочная смесь: 10 мл смолы 15 мкл инициатора, тщательно перемешать непосредственно перед использованием - полимеризация завершается через 30 мин.
Вариант 3. Ускоренная заливка. После ускоренного обезвоживания объекты пропитать сначала в смеси состава для заливки и 96%-ного этанола (1: 1) в течение 1 ч, а затем в чистом составе - раза по 20 мин. Полимеризовать при t=75®С в течение 30 мин, а затем при t=85®С еще 30 мин.

5.6. Заливка в ЛР ГОЛД (LR GOLD)

Вариант 1. Обезводить объект в метаноле: в 50%-ном растворе 15 мин (t=0®С), в 70%-ном растворе 45 мин (t=-25®С), в 90%-ном растворе 45 мин (t=-25®С). Пропитать в смеси мономера и 100%-ного (можно 90%-ного) метанола: в смеси 1:1-30 мин (t=-25®С), в смеси 7 : 3 - 60 мин (t=-25®С), в 100%-ном мономере - 60 мин (t=-25®С). Поместить объект в смесь мономера, содержащего 0.1% бензила, на ночь (t=-25®С). Полимеризация осуществляется в этой смеси с помощью голубого света от галогеновой лампы при недонакале (напряжение 7-9 В) в течение 20-25 ч (t=-25®С).
Вариант 2. В процессе обезвоживания в возрастающих концентрациях метанола, если ткань не была зафиксирована, следует добавить во все растворы метанола по 10-20% поливинилпирроли-дона (ПВП; молекулярная масса 44000); обезвоживание осуществляется в растворах метанола с возрастающей концентрацией: в 50%-ном растворе с 20% ПВП - 15 мин (t=0®С), в 70%-ном растворе с 20% ПВП - 45 мин (t=-25®С), в 90%-ном растворе с 20% ПВП - 45 мин (t=-25®С). Пропитывание: а) в смеси (1:1) мономера и метанола с добавлением 10% ПВП в течение 30 мин (t=-25®С), б) в смеси (7 : 3) мономера и метанола с добавлением 10% ПВП - 60 мин (t=-25®С). Поместить объект в 100%-ный мономер на 60 мин (t=-25®С), затем в 100%-ный мономер с добавлением 0.1% бензила на 60 мин (t=-25®С) и, наконец, в свежую порцию такой же смеси мономера и бензила на ночь (t=-25®С). Полимеризация осуществляется в последней порции смеси с помощью голубого света от галогеновой лампы при недонакале (напряжение 7-9 В) на протяжении 20-25 ч (t=-25®С).

5.7. Заливка в гликольметакрилат (ГМА)

Вариант 1. Смешать 7 частей состава из 97% ГМА и 3% воды, 3 части бутилметакрилата и добавить Люперко до концентрации 2%. Небольшое количество смеси наливать в склянку с широким дном так, чтобы слой жидкости не превышал 1 см. Склянку быстро нагреть до начала кипения и немедленно охладить в емкости с ледяной водой. При нагревании и охлаждении жидкость необходимо перемешивать. Предполимер не должен иметь вязкость более 30 сП (как густой сироп). Если степень предполимеризации недостаточна, то процедуру повторять, до тех пор пока не будет достигнута нужная вязкость. Предполимер хранить в морозильной камере и нагревать до комнатной температуры перед использованием.
Обезводить объекты в смеси ГМА с водой: в смеси 4:1-15 мин, в смеси 37 : 3 - 15 мин. Пропитать в чистом мономере ГМА в течение 20 мин, в предполимере оставить на ночь. Затем предполимер налить в прозрачные желатиновые капсулы, поместить туда объекты, оставить капсулы на 30 мин открытыми для удаления пузырьков воздуха, после чего закрыть. Полимеризацию осуществить с помощью УФО при ? < 315 нм, объекты поместить на расстоянии 2.5 см от лампы.
Вариант 2. Кусочки ткани после дегидратации пропитать в нескольких сменах состава А (пропитывание длится от 4 до 48 ч). Из состава А кусочки ткани перенести в формы из алюминиевой фольги, залить смесью из 42 частей состава А и 1 части состава Б (полимеризация длится 30-45 мин).
Состав А: смешать 80 мл 2-этоксиметакрилата, 8 мл 2-бутоксиэтанола и 0.5 г перекиси бензоила.
Состав Б: смешать 8 мл ПЭГ-400 и 1 мл 1 N,N-диметиланилина.
Вариант 3. Обезводить объекты в смеси ГМА с водой: в смеси 4 : 1 - 20 мин, в смеси 97 : 3 - 20 мин. Поместить в смесь составов В и Г (1: 1) на 20 мин, а затем в предполимер на 30 мин. Залить в прозрачные желатиновые капсулы (полиэтиленовые нежелательны). Полимеризацию осуществить с помощью УФО (?=315 нм, расстояние 10 см) в течение 24-48 ч.
Состав В: 68.0 г гликольметакрилата, 2.0 г воды.
Состав Г: 29.0 г п-бутилметакрилата, 1.0 г перекиси бензоина. В и Г смешивать непосредственно перед использованием.
Предполимер: нагревать смесь составов В и Г (1: 1) на водяной бане, до тех пор пока вязкость смеси не достигнет таковой у жидкого сиропа (несколько минут при t=80®С), и быстро охладить до t=-4®С.

6. УЛЬТРАТОМИРОВАНИЕ

6.1. Материалы, необходимые для изготовления УС

6.2. Изготовление ПС

Установить подачу в 1-2 мкм (угол резания ножа не должен превышать 6-7®). Подвести нож как можно ближе к блоку. При каждом подъеме и опускании блока производить указанную подачу ножа, до тех пор пока не будет получен первый срез. После получения 4-5 ПС снять их либо петлей, либо тонкой кисточкой и перенести в каплю, помещенную на чистое предметное стекло, которое можно покрыть адгезивной смесью (см. Приложение, 6.З.1.). При резании ПС на жидкость налить в ванночку 10%-ный раствор ацетона (уровень жидкости должен быть горизонтальным), а ПС снимать петлей. Высушить ПС с помощью нагревания на горелке (не допускать закипания) или (лучше) в термостате (на термостатированном столике). Окрасить ПС (см. Приложение, 6.4-65.), промыть водой и высушить.

6.3. Укрепление ПС на стеклах

Окунуть чистое предметное стекло в адгезивную смесь (см. Приложение, 6.3.1), высушить (t=50®С), нанести ПС на стекло I и снова высушить.

6.3.1. Адгезивные смеси

Вариант 1. Смешать 5 мл 95%-ного этанола, 25 мл ледяной I уксусной кислоты, 70 мл воды и 10.0 г фторида натрия.
Вариант 2. Раствор альбумина (1 мг/мл), перед использовани-I ем профильтровать.
Вариант 3. Раствор яичного белка с глицерином [38].
Вариант 4. Приготовить 1%-ный раствор желатины [38]. Покрыть чистое стекло желатиной при t=50®С. Положить ПС на I стекло. Высушить сначала при t=20®С, затем при t=60®С. Поместить стекло в раствор ФА или ГА на 30 с. Высушить сначала при t=20®С, затем при t=60®С.
Вариант 5. Приготовить 0.1%-ный (25 мкг/мл) раствор поли-L-лизина (рН 8.5). Каплю раствора полилизина поместить на р стекло, через 5 мин промыть водой и высушить.

6.4. Монохромные красители

6.4.1. Одноступенчатые методы окрашивания ПС

На ПС нанести каплю раствора А, Б или В. Окрашивать ПС при t=70®С в течение 10-15 с (если не прокрашиваются, то дольше). Промыть водой в течение 1-2 мин.
Раствор А: приготовить 0.3%-ный раствор бриллиант-крезил-блау на ФБ (рН 9.1); визуализируются клетки и соединительная ткань.
Раствор Б: приготовить 1%-ный раствор виктория-блау в 70%-ном этаноле; окрашиваются эластин и ретикулиновые волокна, липидные включения после осмиевой фиксации приобретают черный цвет.
Раствор В: приготовить краситель Гимза, разведенный в 10 раз 2%-ным раствором тетрабората натрия; ПС прикрепляют на стекла, покрытые желатиной, и окрашивают.

6.4.2. Толуидиновый синий (ТС)

Вариант 1. На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора А, отфильтрованного через миллипоровый фильтр, нагреть до температуры 60-70®С и выдержать 1 мин. Интенсивно промыть водой.
Раствор А: 0.5 г буры (тетрабората натрия) растворить в 50.0 мл воды и добавить 0.5 г ТС.
Вариант 2. ПС, прикрепленные к стекчу, поместить на 2 ч в раствор Б (t=60®С). Интенсивно промыть водой. Обезводить в возрастающих концентрациях этанола. Поместить в ксилол и заключить в Пермаунт.
Раствор Б: 0.15 г ТС растворить в 50 мл 2.5%-ного раствора Na₂CO₃, рН 11.0 (готовится ex tempore и фильтруется).
Вариант 3. На ПС капнуть раствор В. Окрашивать 20 с (t=80®С).
Раствор В: 1.0 г ТС растворить в 100 мл 0.5%-ного раствора Na₂CO₃.
Вариант 4. Каплю раствора Г или Д поместить на ПС, приклеенный к стеклу, и слегка подогреть (в течение 3-4 с) на спиртовке, не допуская закипания, после чего промыть водой.
Раствор Г: приготовить 1%-ный раствор ТС на 0.1 М ФБ (рН 8.0).
Раствор Д: приготовить 0.1%-ный раствор ТС на 0.1 М ФБ (рН 8.4-8.5).

6.4.3. Метиленовый синий

На ПС нанести каплю 1%-ного раствора метиленового синего и каплю 1%-ного раствора буры и смешать. Провести несколько раз над пламенем горелки, не допуская закипания жидкости. Если срез перекрашен, его можно дифференцировать в 96%-иом этаноле.

6.4.4. Сафранин

На ПС нанести каплю раствора А или Б. Окрашивать ПС при t=20®С в течение 30-60 с. Промыть водой в течение 1-2 мин. Дифференцировать в 50%-ном этаноле. Высушить.
Раствор А: приготовить 1%-ный раствор сафранина-О на 50%-ном этаноле.
Раствор Б: разбавить в 2 раза водой 1%-ный раствор сафранина-О на 96%-ном этаноле.

6.4.5. Окраска гематоксилином

ПС толщиной 1 мкм обработать несколькими каплями 2.5%-ного раствора железоаммиачных квасцов в течение 5-10 мин (на горячем столике, температура 70-90®С), сполоснуть водопроводной водой для удаления избытка протравы и обработать раствором А в течение 2-5 мин на горячем столике, пока срезы не примут вид черных пятен. Затем срезы промыть водой (температура 70-90®С), высушить и заключить в канадский бальзам. При плохом проникновении красителя ПС рекомендуется предварительно обработать подкисленной перекисью водорода в течение 1-2 мин (температура 25-30®С).
Раствор А: 0.5 гематоксилина растворить в 10 мл 96%-ного этанола и долить водой до 100 мл.

6.4.6. Метод ШИК

Прикрепленные к стеклу ПС погрузить на 5 мин в 0.1 М раствор NaOH, сполоснуть водой, затем поместить на 15 мин в 1.5%-ный раствор йодной кислоты, вновь сполоснуть водой, после чего инкубировать в реактиве Шиффа [38] 45-60 мин. Промыть водой в течение 30 мин.

6.4.7. Метенамин серебра

Обработать ПС толщиной 1-2 мкм 1%-ным раствором йодной кислоты в течение 5 мин. После промывания (в течение 15 мин) на срез нанести свежий раствор метенамина серебра (см. Приложение, 9.12.1) при t=60®С в темноте, после чего промыть в 5%-ном растворе тиосульфата натрия, затем в воде и этаноле.

6.4.8. Перегревание ПС

ПС поместить в каплю воды и подсушить. Затем стекла нагревать до температуры 250-260®С в течение 15-30 с, необходимо постоянно следить за внешним видом ПС. Срезы приобретают коричневый оттенок, интенсивность которого контролируют просмотром предметных стекол на белом фоне. Перегрев часто сопровождается потерей контрастности.

6.5. Полихромные красители

6.5.1. Трехцветное окрашивание

Вариант 1. На предметное стекло со срезами налить по 1 мл растворов А-Д, стекло нагреть в течение 4-5 с или дольше на горячей плитке или над пламенем (до появления пара). Затем срезы сполоснуть в проточной воде и высушить. На срезы капнуть иммерсионное масло, покрыть покровным стеклом, края которого смазать заливочной смесью эпона.
Раствор А: смешать 50.0 мл ПЭГ-200, 0.75 мл 0.2 М КОН, 1.7 г основного фуксина и 0.3 г ТС; окрашивать срезы 2-3 мин, затем сполоснуть 10%-ным ацетоном.
Раствор Б: 05 г NaН₂PО₄, 0.25 г основного фуксина для фуксинсерной кислоты и 0.2 г метиленового синего растворить в 15 мл 0.5%-ного раствора борной кислоты при постоянном помешивании, добавить 70 мл воды и 10 мл 0.72%-ного раствора NaOH (рН 6.8); краситель можно хранить несколько месяцев, перед употреблением встряхивать; эпоксидный матрикс не красится, ядра окрашиваются в фиолетовый цвет, митохондрии - в темно-красный, эритроциты - в розовый, коллаген - в ярко-розовый, эластический каркас артерий - в красно-фиолетовый, жировые капли - в бледно-оливковый.
Раствор В: смешать равные объемы 1%-ного раствора метиленового синего и 1%-ного раствора азура II, оба красителя приготовить на 1%-ном растворе буры (рН 9.4).
Раствор Г: приготовить на 0.1 М ФБ (рН 9.1) 0.2%-ный раствор азура I с добавлением 2% основного фуксина; окрашивать 2 мин; ядра и нуклеопротеиды цитоплазмы окрашиваются в синий цвет, коллаген - в красный, эластические волокна и гранулы базофилов - в пурпурный.
Раствор Д: приготовить на 1%-ном растворе буры 1%-ный метиленовый синий с добавлением 2% основного фуксина.
Вариант 2. Протравить ПС в растворе этоксида натрия (см. Приложение, 6.6.5), затем промыть в нескольких сменах воды. Поместить ПС в раствор А на 1-2 мин, промыть в воде. Теперь срезы можно либо высушить и заключить в бальзам, либо окрасить в теплом (t=50®С) растворе Б в течение 1-5 мин под контролем СМ, после чего промыть в нескольких сменах воды, высушить фильтровальной бумагой, снова промыть, высушить на воздухе и заключить в бальзам. Базофильные элементы окрашиваются в темно-красный цвет, ацидофильные - в голубой, цитоплазма клеток и дендритов - в зеленый, аппарат Гольджи, вещество Ниссля - в темно-сине-зеленый.
Раствор А: смешать 100 мл 30%-ного раствора этанола, 0.4 г азура-В, 1.0 г малахитового зеленого, 1 мл анилина, 1.0 г фенола кристаллического и профильтровать.
Раствор Б: приготовить концентрированный (около 4%) раствор основного фуксина, профильтровать.

6.5.2. Двойное окрашивание ПС

На высушенные срезы нанести каплю раствора А, подогретого до t=65®С. Время окрашивания варьирует в зависимости от толщины среза и ЗС. Отмыть ПС водой (2-3 смены), нанести на них каплю раствора Б. Можно окрашивать при комнатной температуре или слегка подогреть. Отмыть водой.
Раствор А: смешать 0.130 г метиленового синего, 0.02 г азура II, 10 мл глицерина, 10 мл метанола, 30 мл раствора В и 50 мл воды.
Раствор Б: слить 3 мл раствора Г и 57 мл воды.
Раствор В: растворить 1.338 Na₂НPО₄"2Н₂О и 0.908 г КН₂РО₄ в небольшом количестве воды, долить водой до 100 мл (рН 6.9).
Раствор Г: растворить 0.10 г основного фуксина в 10 мл 50%-ного этанола.
Растворы А и Б не нуждаются в фильтровании, их можно хранить на холоде в течение 4 мес.
Продолжительность окрашивания ПС растворами А и Б зависит от использованной ЗС.

Смола	Раствор А	Раствор Б
Аралдит	30 мин	30-90 с
Эпон 812	30-60 мин и более	1-3 мин
Смесь Эпона и Аралдита	5 мин	1 мин
Смола Сперра	20 мин	1-5 мин

ПС тоньше 1 мкм требуют больше времени для окрашивания в растворе А и меньше - в растворе Б. ПС, полученные со старых блоков, красятся быстрее, чем срезы из свежеприготовленных блоков [70].
Ядро и ядрышко окрашиваются в темно-синий цвет; цитоплазма - в светло-голубой, гликоген - в красный, секреторные гранулы, содержащие мукополисахариды (гликопротеиды), - в цвета от красного до фиолетового, липидные включения - от зеленого до светло-голубого, клетки соединительной ткани - в розовый цвет, эластические волокна - в фиолетовый, коллагеновые волокна - в красный, эритроциты - в сине-зеленый.

6.5.3. Толуидиновый синий и метиленовый синий [253]

На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора А и нагревать при температуре 60-70®С в течение 1-3 мин. Промыть водой. Поместить на срез каплю подкисленной воды на 10 с. Заключить в смолу.
Раствор А: 0.5 г буры растворить в 50 мл воды, добавить 0.5 г ТС и 0.1 г метиленового синего (или азура II); раствор стабилен в склянке с закрытой пробкой.

6.5.4. Толуидиновый синий и азур II [253]

На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора А и нагревать при температуре 60-70®С в течение 5 мин. Промыть водой.
Раствор А: смешать равные объема 1%-ного раствора азура II и 1%-ного раствора ТС; оба красителя приготовить ex tempore на 1%-ном растворе буры.

6.5.5. Толуидиновый синий и пиронин [253]

На прикрепленные к стеклу ПС поместить каплю раствора В и нагревать при температуре 60-70®С в течение 5 мин. Промыть водой. Обработать в течение нескольких секунд в 100%-ном этаноле. Высушить.
Раствор А: в 40 мл воды растворить 0.4 г буры и 0.4 г ТС.
Раствор Б: в 20 мл воды растворить 0.2 г пиронина.
Раствор В: смешать ex tempore растворы А и Б (2 : 1).

6.5.6. Толуидиновый синий и основной фуксин [253]

После окрашивания в 1%-ном раствором ТС на 0.1 М ФБ (рН 8.0) обработать ПС 2%-ным раствором основного фуксина в течение 1-2 мин. Интенсивно промыть водой. Высушить. Заключить ПС в смолу.

6.5.7. Метиленовый синий и азур II

Смешать равные объемы 1%-ного раствора азура II и 1%-ного раствора метиленового синего; оба красителя приготовить на 1%-ном растворе буры. Капнуть краситель на ПС и подогреть в течение 5 мин. Промыть водой.

6.6. Смеси для травления ПС

6.6.1. Подкисленный раствор перекиси водорода

Слить 30 мл воды, 15 мл 30%-ного раствора перекиси водорода и 0.18 мл 0.1 М раствора НСl (рН 3.2). Травление осуществляется в течение 1-2 мин при температуре 25-30®С.

6.6.2. Раствор йодной кислоты

Приготовить 1-4%-ный раствор йодной кислоты и обработать им ПС толщиной 1-2 мкм в течение 5 мин.

6.6.3. Раствор таниновой кислоты (ТК)

Приготовить 1%-ный раствор ТК, после обработки ПС необходимо тщательно отмыть водой.

6.6.4. Раствор метоксида натрия

Растворить 2.0 г металлического натрия в 110 мл метанола, добавить 100 мл бензола. Раствор использовать сразу. Травление длится 3 мин. Отмывать ПС в смеси метанола и бензола 5 мин, затем обработать ацетоном в течение 5 мин.

6.6.5. Раствор этоксида натрия

0.75-1.5 г NaOH растворить в абсолютном этаноле. Травить ПС на стеклах в этом растворе в течение 5-30 с. Промыть сначала в четырех сменах абсолютного этанола, затем в ФБ (рН 7.4) и несколько раз в воде.

6.6.6. Обработка парами брома

Поместить ПС на 30 с в пары над жидким бромом, затем в ксилол на 1 ч с последующим отмыванием в нескольких сменах этанола при нисходящих концентрациях и наконец в воде.

7. КРИОУЛЬТРАТОМИЯ

7.1. Напыление стеклянных ножей вольфрамом

Поместить нож в круговой держатель так, чтобы его нижняя грань находилась под углом 11® к горизонтали, а направление напыления соответствовало биссектрисе угла ножа. На высоте 75 мм от основания ножа укрепить испаритель в виде V-образной вольфрамовой проволоки с диаметром 0.5 мм. Между ножами и проволокой поместить экран. После достижения высокого вакуума (менее 10^-2 Па) в течение 60 с прокалить проволоку для испарения окиси вольфрама. Убрать экран и напылять в течение 30 с при токе 30 А и напряжении 10 В (толщина получаемого слоя вольфрама составляет 2 нм).

7.2. Криоультратомия "сухим" способом

Заморозить маленькие кусочки ткани и расколоть их в жидком азоте на более мелкие (если это необходимо), зажать в держатель криоультратома. Под слоем жидкого азота в специальном контейнере перенести держатель в криокамеру и быстро закрепить в заранее охлажденной до температуры от -80 до -120®С штанге.
Подвести предварительно охлажденный до той же температуры нож к образцу до почти полного контакта. Использовать тонкую механическую подачу до тех пор, пока не будет получен первый срез (не толще 1 мкм, в противном случае блок может быть поврежден). Глубже 5 мкм располагаются кристаллы льда. Начать резание с помощью автоматической подачи со скоростью 1 мм/с.
Срезы собирают на поверхности сухого ножа. Они полупрозрачны и могут иметь те же цвета интерференции, что и пластиковые УС, плавающие на поверхности жидкости, Но по данному признаку оценить толщину среза нельзя. С помощью ресницы срез надо перемещать вниз по ножу, чтобы освободить место следующему срезу. Лента срезов получается редко. Если возникают проблемы со статическим электричеством, то надо использовать ионизатор.
Затем с помощью ресницы срезы переносят на покрытую формваровой пленкой-подложкой сеточку, которая располагается рядом с ножом на охлажденной платформе. Сеточку со срезами помещают на плоскую охлажденную медную поверхность в криокамере. С помощью охлажденного медного блока с плоским полированным основанием диаметром слегка превышающим 3 мм срезы придавливают к поверхности сеточки. После чего срезы либо высушивают в замороженном состоянии в аппарате для низкотемпературной возгонки, либо непосредственно исследуют в ТЭМ с охлажденным столиком. Можно сублимировать срезы и в ЭМ.

7.2.1. Перенос крио-УС "сухим способом"

Проволочной петлей диаметром 2 мм взять каплю раствора сахарозы. Полузамерзающей каплей сахарозы коснуться крио-УС. Последние прилипают к капле снизу. Капля оттаивает, крио-УС расправляются. Каплей с плавающими внизу крио-УС коснуться сеточки, покрытой формваругольной подложкой, крио-УС прилипнут к сеточке, а капля сахарозы растечется по ее верхней поверхности. Сеточку перевернуть и поместить на слой застывшего 2%-ного раствора желатины. Затем желатину нагреть (t=37®С), а когда она станет жидкой, разбавить ФБФР (1 : 1). Под сеточку подвести проволочную петлю диаметром 3 мм, с помощью которой сеточку перенести на каплю ФБФР для удаления желатины. Затем крио-УС заключить в метилцеллюлозу, избыток которой удалить фильтровальной бумагой [163].

7.2.2. Метод "сухой нож - влажный перенос"

Фиксатор отмыть изоосмотическим буфером. Погрузить срезы или небольшие кусочки в 2.1-2.3 М сахарозу (или 1.8 М сахарозу, содержащую 15-20% поливинилпирролидона) на ФБФР на 15-60 мин. Время пропитывания зависит от типа ткани.
Поместить кусочек на медный металлический держатель. Желательно изменить форму кусочка таким образом, чтобы он в наибольшей степени контактировал с держателем. Быстро заморозить объект. Хранить объекты под жидким азотом. Затем перенести их в криокамеру микротома. Получить срезы. Собрать их с помощью ресницы в группы. Подобрать срезы с помощью платиновой петли с каплей сахарозы на конце. Вынести каплю со срезами из крио-камеры. Если она замерзла, то надо дать ей оттаять. При этом капля из молочно-белой становится прозрачной. Нижней поверхностью капли со срезами на ней коснуться сеточки, покрытой форм-варовой или угольной пленкой-подложкой так, чтобы срезы были перенесены на сеточку.
Немедленно, не допуская высыхания срезов, взять сеточку и поместить ее плавать срезами вниз на каплю ФБФР, содержащего 1% БСА и 2% желатины. Отконтрастировать срезы. Если контрастирование не требуется, то сеточку перенести на воду (4 смены) для удаления ФБ.

8. КОНТРАСТИРОВАНИЕ

8.1. Приготовление воды, свободной от СО₂

Проавтоклавировать бутылку с бидистиллированной водой и запечатать в автоклаве или прокипятить 10 мин и закрыть, не охлаждая. При открывании возникает характерный звук входящего воздуха. Вода очень быстро поглощает СО2, поэтому ее можно использовать лишь первые 10-15 мин после открывания. Затем ее вновь нагревают, запечатывают и охлаждают до комнатной температуры.

8.2. Контрастирование кусочков с помощью УА перед обезвоживанием

Вариант 1 [135]. После постфиксации в 1.5%-ном растворе 40 на коллидиновом буфере (см. Приложение, 2.2.5) промыть объекты в трех сменах 0.05 М натрий-малеатного (см. Приложение, 2.2.8) буфера (рН 5.2) и поместить их на 2 ч в 2%-ный водный раствор УА. Промыть объекты в трех сменах 0.05 М натрий-малеатного буфера (рН 5.2), обезводить и подготовить для ТЭМ.
Вариант 2. После постфиксации промыть кусочки 3 раза по 15 мин в 0.05 М натрий-малеатном буфере (см. Приложение, 2.2.8). Контрастировать свежеприготовленным 0,5-2.0%-ным раствором УА на натрий-малеатном буфере в течение 2 ч (t=4®С).
Вариант 3. После постфиксации и промывания контрастировать кусочки соответствующим раствором (см. Приложение, 8.2.1) в течение 2 ч (t=50®С).

8.2.1. Контрастирующие растворы [253]

Раствор А: 7.5%-ный раствор уранил-магнезиумацетата на трижды дистиллированной воде.
Раствор Б: 1%-ный раствор УА (в темноте раствор стабилен в течение недели); обработка длится 5-60 мин.
Раствор В: 1%-ный раствор УА на вероналацетатном (см. Приложение, 2.2.10) буфере (рН 3.9-6.0). Обработка длится 2 ч.
Раствор Г: 1%-ный раствор УА на 0.05 М натрий-малеатном буфере (рН 4.6).
Раствор Д: 1%-ный раствор УА на ацетатном буфере (рН 5).
Раствор Е: к 100 мл натрий-малеатного буфера (рН 6.0) добавить 0.5 г УА (рН снизится до 5.2) или 2.0 г УА (рН снизится до 4.2). Если рН превысит 6.0, то произойдет преципитация.
Раствор Ж: 4%-ный раствор УА; контрастирование длится 60 мин.

8.3. Контрастирование с помощью. УА в процессе обезвоживания

Вариант 1. В схеме обезвоживания (см. Приложение, 3.1) вместо 70%-ного этанола использовать 1-5%-ный раствор УА на 70%-ном этаноле (см. Приложение, 8.3.1), оставить объекты в растворе на ночь. Далее - по схеме.
Вариант 2. В схеме обезвоживания (см. Приложение, 3.1) после 100%-ного этанола провести обработку смесью абсолютных ацетона и этанола (1 : 1) в течение 10 мин, а затем 1-2%-ным раствором УА, приготовленным на этой смеси (1 ч), и вновь чистой смесью ацетона и этанола - 3 раза по 15 мин.

8.3.1. Спиртовой раствор УА

К 5.0 г УА сначала добавить 50 мл 70%-ного этанола, а затем 50 мл 100%-ного этанола. Долить свежепрокипяченную и охлажденную воду. Обработать раствор ультразвуком. Добавить 10 капель 100%-ной уксусной кислоты. Хранить в темноте. Раствор стабилен в течение 6 мес.

8.4. Контрастирование объектов в заполимеризованном блоке

Поместить залитый в смолу блок в 2%-ный раствор УА на 95%-ном этаноле. Плотно закрыть контейнер и поставить в термостат (t=60®С) на 12-24 ч. Промыть блок в нескольких сменах 96%-ного этанола. Высушить и приготовить УС. Окрасить их с помощью ЦС.

8.5. Контрастирование УС

8.5.1. Контрастирование с помощью ЦС

Контрастирование УС производится путем помещения сеточек на каплю раствора ЦС на время от 30 с до 15 мин. Отмыть в трех сменах воды. Раствор ЦС может храниться в холодильнике несколько месяцев. Для уменьшения грязи основной раствор можно центрифугировать. Раствор ЦС фильтровать нельзя.

8.5.2. Свинцовые смеси для контрастирования

8.5.2.1. Приготовление цитрата свинца (ЦС)

Вариант 1. Взять чистую титровальную колбу-пикнометр объемом 50 мл. Тщательно смешать в нем 1.33 г нитрата свинца, 1.76 г цитрата натрия и 30 мл свободной от СОг бидистиллиро-ванной воды (см. Приложение, 8.1) - образуется мелкая молочная взвесь без наличия крупных частичек (если есть крупные частицы, то надо продолжать встряхивание). Добавить 5-7 мл 1 М раствора NaOH, свежеприготовленного на бидистиллированной воде, свободной от СО₂, и размешать - молочный раствор должен стать прозрачным. Если раствор остался мутным, то добавить еще несколько капель NaOH щелочи (объем щелочи не должен превышать 8 мл, если раствор опять не просветляется, то приготовление повторить); рН должен быть 12.0 Ђ 0.1 (при смещении рН красящие свойства падают). Если рН слишком низок, то надо еще добавить раствора щелочи, а если слишком высок, то необходимо уменьшить объем добавляемого к суспензии раствора щелочи (нельзя изменять рН с помощью кислоты, поскольку начинается образование осадка). После измерения рН долить бидистиллиро-ванную воду без СО₂ до объема 50 мл.
Вариант 2. В 10 мл бидистиллированной воды растворить 0.01-0.04 г ЦС. Добавить 0.1 мл 10 М NaOH, пробирку закрыть и тщательно встряхивать, до тех пор пока ЦС не растворится. От-центрифугировать.
Вариант 3. В 50 мл автоклавированной, свободной от СО₂ воды растворить 0.1-0.2 г NaOH. Добавить 0.25 г ЦС и встряхивать пробирку до тех пор, пока ЦС не растворится. Раствор хранится долго, но нуждается в центрифугировании перед использованием.

8.5.2.2. Сложный свинцовый контрастер

Вариант 1. В 41 мл воды, свободной от СО₂, растворить при сильном встряхивании 0.2 г безводного ЦС, 0.15 г нитрата свинца, 0.15 г ацетата свинца, 1.0 г цитрата натрия. Добавить 9 мл 4%-ного NaOH - раствор должен стать прозрачным. Хранить при t=4®С в течение 2 лет. Время контрастирования 2 мин. Раствор проникает в УС на глубину 1.2 мкм, он стабилен, свободен от загрязнений.
Вариант 2. Растворить в 82 мл свежепрокипяченной бидистиллированной воды 1.0 г нитрата свинца, 1.0 г цитрата свинца, 1.0 г ацетата свинца, 2.0 г цитрата натрия. Сильно взболтать или облучить ультразвуком до получения молокообразной консистенции. Добавить 18 мл свежеприготовленного 1 М раствора NaOH, сильно взболтать - раствор должен стать прозрачным. Если просветления не происходит, то обработать раствор ультразвуком. Раствор созревает в течение ночи (t=20®С). Он стабилен на протяжении 6 мес, если нет осадка. Раствор брать из верхней части колбы.

8.5.2.3. Хранение раствора ЦС

Набрать готовый раствор в 30-миллилитровый шприц с миллипоровым фильтром. В полиэтиленовый пузырек налить немного жидкого азота, который начинает интенсивно испаряться. Закрыть пузырек пробкой с иглой. После испарения азота вставить шприц в эту иглу и ввести раствор в пузырек. Вынуть иглу из пробки. Перед взятием раствора ЦС с помощью шприца в пузырек вводят небольшое количество газообразного азота, а затем берут нужное количество раствора. Желательно пользоваться иглой, позолоченной в растворе золотохлористоводородной кислоты или посеребренной в растворе азотнокислого серебра.

8.5.3. Контрастирование УС с помощью УА

Вариант 1. Погрузить (полностью) сеточку с УС в насыщенный раствор УА на 70%-ном метаноле (t=37®С) на 1 ч. Отмыть 2-3 раза в воде (медленно).
Вариант 2. Поместить сеточку в каплю супернатанта раствора А в закрытой банке на 5-30 мин. Промыть 2 раза в 100%-ном метаноле, 2 раза в 50%-ном метаноле, 2 раза в воде.
Раствор А: приготовить 40%-ный раствор УА на метаноле, растворить при постоянном помешивании, хранить в холодильнике.
Вариант 3. Поместить сеточку в насыщенный раствор УА (раствор Б) на безводном метаноле на время от 10-15 до 60 мин. Промыть в двух сменах абсолютного метанола и в двух сменах 50%-ного метанола, а затем в двух сменах воды.
Раствор Б: насыпать избыток УА в абсолютный метанол (45 г на 100 мл), перемешать; для контрастирования брать супернатант и фильтровать.

8.5.4. Контрастирование с помощью ТК [354]

Окрасить УС на капле 8%-ного водного раствора УА в течение 15 мин. Промыть 3 раза на большой капле воды. Перенести УС на каплю 2%-ного раствора ТК на 10 мин. Промокнуть сеточки фильтровальной бумагой и промыть на трех каплях 1%-ного раствора сульфата натрия. Отмыть водой.

8.5.5. Контрастирование акриловых УС после иммуномечения

Вариант 1. Сеточки с УС помещают на поверхность лежащих на парафильме (парафине) капель соответствующих растворов (см. ниже), объем капель порядка 250 мкл.
После иммуномечения сеточки с УС трижды промыть в воде. Обработать в 2%-ном растворе УА на 0.15 М щавелевой кислоте (рН довести до 7.0 с помощью 5%-ного раствора NH4OH) в течение 10 мин. Трижды промыть в воде. Обработать 2-4%-ным водным раствором УА в течение 10 мин. Быстро обработать последовательно в трех каплях 1.5%-ного раствора метилцеллюлозы. С помощью проволочной петли взять сеточку с последней капли метилцеллюлозы и осторожно удалить избыток жидкости фильтровальной бумагой.
Вариант 2 [141]. После иммуномечения высушить сеточки с УС и поместить на поверхность капли 1%-ного водного раствора УА на 10 мин. Промыть в воде. Затем обработать сеточки на капле раствора ЦС в течение 10 мин. Тщательно промыть. Выдержать УС в парах ЧО в течение 1 ч.

8.5.6. Контрастирование крио-УС

Крио-УС стабилизируют, контрастируя 10 мин в крупной капле раствора А, промывают в 4-6 крупных каплях воды и переносят на каплю раствора Б на 10 мин. Для этой же цели можно использовать другую смесь: 0.005-0.1%-ный раствор кислого УА, содержащий 1.8% ПЭГ-1540 и 0.2% метилцеллюлозы.
Раствор Л: смешать равные объемы 4%-ного раствора УА л 0.3 М раствора оксалата калия. рН довести до 7.0-7.4 путем добавления небольших объемов 10%-ного раствора гидрохлорида аммония.
Раствор Б: приготовить 2%-ный раствор метилцеллюлозы путем растворения порошка в воде при t=95®С; затем немедленно поставить его на лед и перемешивать при t=-4®С в течение 24 ч; раствор может храниться при этой температуре по крайней мере еще в течение 3 сут. Его центрифугируют при 55 тыс. g в центрифуге Бекмана в течение 1 ч. Пробирки хранят в холодильнике без перемешивания осадка. Небольшое количество этого раствора берут перед самым использованием и смешивают с раствором А так, чтобы конечная концентрация УА была 0.1-0.4% (в соотношении 4 : 1 или 16 : 1).

8.6. Негативное контрастирование (НК)

8.6.1. Контрастирование взвесей

Вариант 1. Суспензировать объект в 1-2%-ном растворе фосфор-но-вольфрамовой кислоты (ФВК) (рН доводится до 72-7.4 при помощи NaOH или КОН) и нанести суспензию на подложку (распыление, флотация, капля).
Вариант 2. Поместить каплю взвеси (5-10 мкл) объекта на подложку ЭМ-сеточки на 5-30 с. Коснуться края капли краем фильтровальной бумаги - должен остаться тонкий слой взвеси. Поместить каплю контрастера (10 мкл) на сеточку на 5-30 с. Аккуратно промокнуть концом фильтровальной бумаги. Высушить.
Вариант 3. Нанести каплю (10 мкл) водной взвеси объекта и большую каплю (20 мкл) раствора контрастера на парафильм. Коснуться ЭМ-сеточкой с подложкой первой капли и выдержать 5-30 с. Аккуратно промокнуть, прикоснувшись краем сеточки к листу фильтровальной бумаги. Коснуться капли красителя и выждать 5-30 мин. Аккуратно промокнуть. Высушить.

8.6.2. Контрастеры для НК

Раствор А: приготовить 0.5-2.0%-ный раствор уранилформиата, рН довести до 4.5-5.2 с помощью 0.1 М гидрохлорида аммония.
Раствор Б: смешать равные объемы 0.012 М уранилоксалата и 0.012 М щавелевой кислоты, рН довести до 6.5-6.8 с помощью 0.1 М аммония гидрохлорида или концентрированного раствора аммиака.
Раствор В: растворить в 100 мл воды 0.5 г УА и 0.15 г щавелевой кислоты.

9. ГИСТОХИМИЯ

9.1. Выявление фосфатаз свинцовым методом

Приготовить вибратомные срезы. Обработать в инкубационной среде в течение 30 мин. Промыть буфером 3 раза по 90 с. Промыть срезы (кусочки) в 0.1 М КБ (рН 7.4) с добавлением 4% сахарозы - 3 раза по 5 мин. Обезводить. Подготовить для ТЭМ.
Контроль: 1) исключить глицерофосфат; 2) добавить в раствор 2 ммоль/л фторида натрия; 3) добавить 10 ммоль/л тартрата натрия.

9.1.1. Инкубационные среды (ИС) [253] ИС на кислую фосфатазу.

Состав 1: приготовить раствор, содержащий 3.0 ммоль/л бета-глицерофосфата, 45.5 ммоль/л ацетатного буфера (рН 5.0), 10 ммоль/л нитрата свинца и 7.3% сахарозы.
Состав 2: приготовить раствор, содержащий 3.6 ммоль/л нитрата свинца, 13.9 ммоль/л бета-глицерофосфата натрия, 50 ммоль/л ацетатного буфера (рН 5.0)
Состав 3: растворить 750 мг бета-глицерофосфата в 12.5 мл 0.1 М ацетатного буфера, довести рН до 5.0 с помощью 2 М НСl и довести объем раствора до 25 мл; добавить этот раствор при постоянном помешивании к 225 мл раствора, содержащего 300 мг нитрата свинца в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.0).
ИС на щелочную фосфатазу. Приготовить раствор, содержащий 20 ммоль/л бета-глицерофосфата, 28 ммоль/л Трис-НСl (см. Приложение, 2.2.6) буфера (рН 9.4), 3.8 ммоль/л MgSO₄, 2.0 ммоль/л цитрата свинца, 8.0% сахарозы.
ИС на глюкозо-6-фосфатазу. Приготовить раствор, содержащий 1.5 ммоль/л глюкозо-6-фосфата, 80 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 6.7), 3.6 ммоль/л нитрата свинца, 6.0% сахарозы.

9.2. Выявление активности ферментов цериевым методом [119]

Поместить объекты (вибратомные, криостатные среды или маленькие кусочки) в инкубационную среду (ИС) без субстрата на 1 ч (t=37®С или 4®С - при использовании нефиксированных тканей). Обработать объекты в ИС (см. Приложение, 9.2.1) в течение 30 мин (t=37®С). Оставить объекты в 6.8%-ном растворе сахарозы на 0.1 М КБ (рН 6.0) на ночь. Обезводить, подготовить для ТЭМ.
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить в среду 2 ммоль/л фторида натрия или 10 ммоль/л тартрата натрия (кислая фосфатаза); 3) преинкубировать в присутствии 5 ммоль/л левамизола (щелочная фосфатаза); 4) преинкубировать и инкубировать в присутствии 5 ммоль/л левамизола (5'-нуклеотидаза); 5) преинкубировать и инкубировать в присутствии 1 ммоль/л пентоксида ваннадия (АТФаза и АДФаза).

9.2.1. Инкубационные среды [119]

Все ИС готовят на свободной от СО₂ воде.
ИС на кислую фосфатазу. Приготовить раствор, содержащий 2 ммоль/л хлорида церия, 1 ммоль/л бета-глицерофосфата натрия, 100 ммоль/л ацетатного буфера (рН 5.0).
ИС на щелочную фосфатазу [198]. Приготовить раствор, содержащий 14 ммоль/л хлорида церия, 11 ммоль/л цитрата натрия, 4 ммоль/л хлорида магния, 10 ммоль/л пара-нитрофенилфосфата, 100 ммоль/л глицин-NaOH буфера (рН 9.3).
Для этого добавить к 6 мл 0.3 М глицин-NaOH буфера (рН 9.3) 1 мл 0.11 М раствора цитрата натрия, 1 мл 0.04 М раствора хлорида магния, 1 мл 0.1 М раствора паранитрофенилфосфата, 1 мл 0.14 М раствора хлорида церия. Отрегулировать рН с помощью 1 М раствора NaOH. Перемешивать или слегка нагревать, до тех пор пока раствор не станет прозрачным.
ИС на 5'-нуклеотидазу. Приготовить раствор, содержащий 1 ммоль/л хлорида церия, 5 ммоль/л нитрата магния, 1.3 ммоль/л аденозинмонофосфата, 70 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 7.2).
ИС для нуклеотидаз ди- и трифосфатаз. Приготовить раствор, содержащий 1 ммоль/л хлорида церия, 5 ммоль/л нитрата магния, 2.3 ммоль/л субстрата (АТФ, АДФ, УТФ, УДФ, ИТФ, ГТФ, ГДФ), 70 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 7.2).
ИС для глюкозо-6-фосфатазы. Приготовить раствор, содержащий 1 ммоль/л хлорида церия, 2 ммоль/л глюкозо-6-фос-фатдинатриевой соли, 80 ммоль/л Трис-малеатного буфера (рН 6.5).
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить 100 ммоль/л цитрата или 1 ммоль/л диэтилпирокарбоната.
ИС для оксидаз. Приготовить раствор, содержащий 3 ммоль/л хлорида церия, 100 ммоль/л азида натрия, 100 ммоль/л ПИПЕС-буфера (рН 7.8), 0.1-50 ммоль/л субстрата.
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) пропускать азот через ИС; 3) добавить в ИС 0.01% каталазы; 4) добавить в ИС ммоль/л цианида калия (для НАД(Ф)Н-оксидазы результат не меняется); 5) добавить в ИС 100 ммоль/л 0,Ь-бета-гидроксибути-рата (для оксидазы D-аминокислот), 1 ммоль/л п-аргинина или ммоль/л 2-фенетилгидразинсульфата (для моноаминооксидазы), 2 ммоль/л 2,6,8-трихлорпурина (для уратоксидазы), 1 ммоль/л аллопуринола (для ксантиноксидазы), замена L-лейцина на L-ли-зин или L-серин (для оксидазы L-аминокислот).
Субстраты: ввести в инкубационную среду 0S ммоль/л НАДН или НАДФН (для НАД(Ф)Н оксидазы), 10 ммоль/л D-пролина (для оксидазы D-аминокислот), 10 ммоль/л L-лейцина (для оксидазы L-аминокислот), 13 ммоль/л глюконата (для глюконатокси-дазы), 2.5 ммоль/л гидрохлорида триптамина (для моноаминооксидазы), 10 ммоль/л оксалата (для полиаминоксидазы), 0.1 ммоль/л гипоксантина (для ксантиноксидазы).
ИС для арилсульфатазы. Приготовить раствор, содержащий 26 ммоль/л паранитрокатехолсульфата, 96 ммоль/л хлорида бария, 60 ммоль/л ацетатного буфера (рН 55).
Особенности проведения реакции (см. Приложение, 9.2): инкубировать в ИС без субстрата в течение 20 мин (t=20®С), а затем в ИС с субстратом в течение 20 мин (t=37®С).
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить 10 ммоль/л азида натрия.

9.3. Выявление цитохромоксидазы

Инкубировать в ИС в течение 5 мин. Промыть в 0.05 М ФБ (рН 7.2) 3 раза по 10 мин (t=4®С). Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Обезводить и подготовить для ТЭМ.
ИС: растворить в 0.05 М ФБ (рН 7.2) 25 ммоль/л ДАБ и 0.15% цитохрома С.
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) преинкубировать (10 мин) в 0.005 М цианиде калия, в 0.005 М азиде натрия или добавить их к ИС.

9.4. Выявление каталазы [119]

Инкубировать в ИС в течение 5 мин. Промыть в 0.1 М глицин-NaOH буфере (рН 10.5) 3 раза по 10 мин (t=4®С). Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Обезводить и подготовить для ТЭМ.
ИС: растворить в 0.1 М глицин-NaOH буфере (рН 10.5) 0.15% перекиси водорода и 5 ммоль/л ДАБ.
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) преинкубировать (10 мин) в присутствии 0.1 М азида или 0.05 М 3-амино-1,2,4-триазоля, либо добавить их к ИС.

9.5. Выявление пероксидазы [119]

Инкубировать в ИС в течение 5 мин. Промыть в 0.1 М КБ (рН 6.5) 3 раза по 10 мин (t=4®С). Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Обезводить и подготовить для ТЭМ.
ИС: растворить в 0.1 М КБ (рН 6.5) 0.02% перекиси водорода и 2.5 ммоль/л ДАБ.
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) преинкубировать (20 мин) в 0.15%-ном растворе перекиси водорода.

9.6. Выявление глюкозо-6-фосфатдепвдрогеназы

После короткой фиксации в ФА (или без нее) инкубировать в ИС в течение 60 мин (t=37®С). Промыть в 0.22 М растворе сахарозы на 0.1 М ФБ (рН 5.3). Фиксировать в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 5.3) -1ч. Усилить реакцию путем обработки в растворе А в течение 20 мин. Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО - 90 мин (t= 4®С). Подготовить для ТЭМ.
ИС: растворить в 0.1 М ФБ (рН 7.2) 18% поливинилового спирта (18.0 г спирта растворить в 100 мл буфера при температуре 80-90®С, интенсивно помешивая, пока раствор не станет прозрачным), 10 ммоль/л глюкозо-6-фосфата, 0.8 ммоль/л НАДФ, 4 ммоль/л хлорид магния, 5 ммоль/л азида натрия, 10 ммоль/л цитрата натрия, 1.5 ммоль/л сульфата меди. Растворять в указанном порядке, интенсивно перемешивая, отрегулировать рН, а затем добавить 0.5 ммоль/л феррицианида калия и 0.32 ммоль/л 1-метоксифеназинметосульфата.
Раствор А: растворить в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.6) 1.5 ммоль/л ДАБ.
Контроль: 1) исключить субстрат (глюкозо-6-фосфат или НАДФ); 2) включить в ИС 10 ммоль/л глюкоамин-6-фосфата.

9.7. Выявление холинэетеразы

Вариант 1. Инкубировать в ИС в течение 20 мин (t=37®С). Промыть в 0.22 М сахарозе на 0.1 М ФБ (рН 7.2). Фиксировать в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.2) -1ч. Усилить реакцию путем обработки в растворе А в течение 20 мин. Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Подготовить для ТЭМ.
ИС: растворить в 2.5 мл воды 12.5 мг ацетилхолина, добавить 15.8 мл 0.82%-ного раствора ацетата натрия, 0.5 мл 0.6%-ного раствора уксусной кислоты, 1.5 мл 2.94%-ного раствора цитрата натрия, 2.5 мл 0.75%-ного раствора сульфата меди, 2.5 мл 0.165%-ного раствора феррицианида калия, перемешать. Раствор должен быть зеленым (рН 55).
Раствор А: растворить в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.6) 1.5 ммоль/л ДАБ.
Контроль: 1) исключить субстрат; 2) добавить в ИС 0.01 ммоль/л эзерина или 0.01 ммоль/л диизопропилфторфосфа-та (растворять в диметилформамиде).
Вариант 2. Инкубировать в ИС в течение 15-60 мин (t=37®С). Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО в течение 90 мин (t=4®С). Подготовить для ТЭМ.
ИС: растворить в 300 мкл диметилформамида 3 мг индоксил-ацетата и добавить к 10 мл 0.03 М Na-фосфатцитратного буфера (рН 6.0) (см. Приложение, 2.2.13), долить 600 мкл раствора пара-розанилина (см. Приложение, 9.8.1).
Контроль: 1) исключить субстрат (ичдоксилацетат); 2) включить в ИС 40 ммоль/л фторида натрия, 0.5 ммоль/л диизопро-пилфторфосфата или 0.1 ммоль/л парахлормеркурийбензоата.

9.8. Выявление дипептидилпептидаз

Инкубировать в ИС в течение 60 мин (t=37®С). Промыть в воде 3 раза по 10 мин. Постфиксировать в 2%-ном растворе ЧО на ФБ (рН 7.8-8.0) в течение 90 мин (t=4®С). Подготовить для ТЭМ.
ИС: добавить к 1 мл 0.1 М КБ (рН 5.5) 60 мкл парарозанилина (см. Приложение, 9.8.1). Растворить 1 мг синтетического пептида ЛизПро-МНА в 10 мкл диметилформамида и добавить к ИС.
Контроль: исключить субстрат.

9.8.1. Приготовление гексазотированного парарозанилина

Растворить 800 мг парарозанилина и 2 мл концентрированной НСl в 8 мл воды. Перемешивать 2-3 ч, профильтровать. Раствор стабилен в темноте 2-4 недели (t=4®С). Перед самой инкубацией смешать раствор парарозанилина с 8%-ным раствором нитрита натрия (1 : 1). Добавить 60 мкл полученного раствора к 1 мл инкубационной среды.

9.9. Окрашивание купролиновым голубым (Cuprolinic Blue)

Фиксировать в течение ночи 3%-ным раствором ГА на 0.25 М натрий-ацетатном буфере (рН 5.6) с добавлением 2.5% купроли-нового голубого и 0.2% MgCte. Промыть тем же буферным без красителя 3 раза по 10 мин. Обработать 1%-ным раствором воль-фрамата натрия 3 раза по 10 мин. Обезводить в этаноле (30%- и 50%-ный этанол с добавлением 1% вольфрамата натрия). Подготовить для ТЭМ.

9.10. Окрашивание рутениевым красным (РК)

Вариант 1. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на КБ (рН 7.2) в течение 24 ч. Промыть в 0.1 М растворе сахарозы на 0.1 М КБ (рН 7.2) 2 раза по 10 мин. Фиксировать в растворе А в течение 3 ч. Отмыть в 0.1 М растворе сахарозы на 0.1 М КБ (рН 7.2) в течение 1 мин. Быстро обезводить и подготовить для ТЭМ (контрастирование УС с помощью ЦС в течение 3 мин).
Раствор А: слить 1 мл 2%-ного раствора ЧО на КБ (рН 7.2) и 1 мл 0.25%-ного раствора РК.
Вариант 2 [253]. Фиксировать в 1.2%-ном растворе ГА с добавлением 0.075% РК на 0.07 М КБ (смешать равные части 0.2 М КБ, рН 7.4, 3.6%-ного раствора ГА и 0.15%-ного раствора РК) в течение 1 ч. Промыть в растворе, состоящем из равных частей 0.2 М КБ и 0.15%-ного раствора РК, в течение 10 мин. Постфиксировать в 1.3%-ном растворе ЧО с добавлением 0.075% РК на 0.07 М КБ (смешать равные части 4%-ного раствора ЧО, 0.15%-ного раствора РК и 0.2 М КБ, рН 7.4) в течение 3 ч. Быстро обезводить и подготовить для ТЭМ.
Вариант 3. Фиксировать 2-3%-ным раствором ГА на КБ (рН 7.4), содержащем 1 мг/мл РК, - до 4 ч. Промыть КБ - 3 раза по 10 мин. Постфиксировать раствором А в течение 2 ч. Быстро обезводить и подготовить для ТЭМ.
Раствор A: 7.5 мг РК растереть в ступке и растворить в 3 мл 0.4 М КБ (рН 7.5), добавить 4.5 мл 2%-ного раствора ЧО; раствор очень быстро портится, поэтому в процессе обработки его надо сменить несколько раз.

9.11. Выявление анионных сайтов

Вариант 1. Фиксировать в ГА. Изготовить вибратомные срезы. Промыть в 0.1 М КБ (рН 7.4) 4 раза по 2 мин. Инкубировать в 0.05%-ном растворе РК на 0.1 М КБ (рН 7.4) в течение 30 мин. Быстро обезводить и подготовить для ТЭМ.
Вариант 2. Обработать 1%-ным раствором Тритона Х-100 с добавлением 1% РК на буфере Мак-Ильвейна (см. Приложение, 2.2.13) (рН 5.6) в течение 1 ч. Префиксировать 5%-ным раствором ГА с добавлением 1% РК на том же буфере в течение ночи. Обработать 1%-ным раствором РК на том же буфере (рН 5.6) 4 раза по 5 мин. Постфиксировать 1%-ным раствором ЧО, содержащим 0.75% РК, на том же буфере (рН 5.6) в течение 1 ч. Обезводить и подготовить для ТЭМ.

9.12. Окрашивание базальных мембран, коллагеновых волокон и гликогена на УС [249]

УС (на никелевых или золотых сеточках) инкубировать в 25%-ном растворе аммиака в течение 10 мин. Промыть в воде. Инкубировать в 1%-ном растворе йодной кислоты - 20 мин. Промыть в воде. Инкубировать в 1%-ном растворе тиокарбазида - 1 мин. После промывания в воде инкубировать в 25%-ном растворе аммиака - 5 мин. Промыть в воде. Инкубировать в растворе метенамина серебра (температура 50-55®С) - 50 мин. Промыть в воде, подготовить для ТЭМ.

9.12.1. Раствор метенамина серебра

К 50 мл 3%-ного раствора метенамина добавить 5 мл 2%-ного раствора желатины (тщательно перемешать), ввести 5 мл 5%-ного раствора AgN03 (по каплям, постоянно помешивая), долить водой до 95 мл, добавить 5-6 мл 5%-ного раствора тетрабората натрия и смешать. Готовить ex tempore, держать в темноте.

9.13. Выявление элементов эндоплазматической сети [95]

Фиксировать в растворе А - 20 мин. Быстро промыть в 0.1 М вероналацетатном буфере (рН 7.0). Дофикеировать в растворе А (г=4®С) - 2 ч. Промыть водой 3 раза по 5 мин. Импрегнировать в 1%-ном растворе ЧО (t=37®С, объем раствора должен быть значительно больше объема кусочков) - 3-5 сут (раствор менять каждые 12 ч). Промыть водой. Обезводить и заключить в эпоксидную смолу.
Раствор А: слить 32.7 мл 0.1 М веронала натрия, 30.7 мл 0.1 М соляной кислоты, 13.5 мл 0.1 М цитрата натрия, 13-5 мл 0.1 М хлорида кальция или никеля, 10.0 мл 25%-ного раствора ГА.

9.14. Выявление аргентаффинных клеток и биогенных аминов

Фиксировать (лучше перфузией) в растворе, содержащем 1% ГА и 0.4% ФА и приготовленном на 0.2 М хроматном буфере (рН 7.2) (см. Приложение, 2.2.14.) в течение 5-10 мин (t=4®С). Промыть в том же буфере (рН 6.0) - 18 ч (t=4®С, помешивать). Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО на том же буфере (рН 7.2) - 1 ч (t=4®С). Контрастировать УА в блоках. Подготовить для ТЭМ. УС контрастировать ЦС.

10. АВТОРАДИОГРАФИЯ

10.1. ЭМ-АРГУС

10.2. Авторадиография ПС

10.3. Приготовление проявителей для ЭМ-АРГ

В настоящее время в АРГ широко используются следующие проявители.
Фенидоновый: растворить в 250 мл воды последовательно 6.0 г аскорбиновой кислоты, 1.0 г фенидона, 2.0 г КВг, 5.2 г К₂СО₃, 40.0 г Na₂CO₃, 24.0 г NaCNS. Долить водой до 300 мл (раствор должен быть прозрачным) и отфильтровать. Проявление в течение 1 мин (t=17®С). Стоп-ванна - 2%-ная уксусная кислота. Фиксаж - 30%-ный тиосульфат натрия.
Амидоловый: растворить в 600 мл воды последовательно 0.30 г амидола, 10.0 г сульфита натрия безводного, 0.50 г лимонной кислоты. Долить водой до 1 л (t=18®С).
Гидрохиноновый: растворить в 100 мл воды 0.25 г сульфита натрия, 0.27 г гидрохинона, 5.29 г карбоната натрия, 0.1 г бромида натрия. Раствор профильтровать, проявлять 1 мин.
Пирогаллоловый (для эмульсии типа Пр): растворить в 600 мл воды последовательно 37.0 г Na₂SO₄, 25.2 г пирогаллола, 2.0 г амидола, 50.0 г буры, 3.0 г бромистого калия, долить водой до 1 л.

10.4. Абсорбционная ЭМ-АРГ

Приготовить 1%-ный раствор золотохлористоводородной кислоты на трижды дистиллированной воде в склянке из особо чистого стекла (раствор хранится при t=4®С). Чистые предметные стекла слегка натереть глицерином и поместить в чашку Петри с прокаленным силикагелем. Сеточки тщательно промыть бидистиллированной водой и хорошо просушить при комнатной температуре в чашках Петри с прокаленным силикагелем. На предметное стекло поместить каплю 0.01-0.04%-ного раствора золото-хлористоводородной кислоты, приготовленного ex tempore из 1%-ного раствора, и каплю трижды дистиллированной воды. Закрытые чашки Петри с предметными стеклами поставить в термостат при t=35®С на 20 мин.
Поместить на каплю раствора золотохлористоводородной кислоты сеточку на 50-60 с так, чтобы УС были обращены вниз. Тщательно промокнуть сеточку на чистом листе ватмана и поместить на каплю трижды дистиллированной воды на 50-60 с. Промыть в воде и просмотреть в ТЭМ.

11. ЛЕКТИНЫ

11.1. Конъюгирование лектинов (Л)

11.1.1. Конъюгирование Л с КЗ

Вариант 1. К 5 мл раствора КЗ при постоянном перемешивании прибавить 0.1-1.0 мл 0.05%-ного раствора Л. Через 5 мин в полученную смесь влить 1 мл 10%-ного раствора NaCl. Отсутствие изменения цвета раствора свидетельствует об эффективной стабилизации комплекса. Изменение цвета раствора на синий указывает на начало флоккуляции. В этом случае количество Л, прибавляемого к КЗ, следует изменить. Для удаления крупных агрегатов золь надо центрифугировать 20 мин при 1500 об./мин, надосадочную жидкость центрифугировать еще раз 60 мин при 15000 об./мин, t=4®С. Осадок ресуспензировать в 0.5-1.0 мл ФБФР, центрифугирование при 1500 об./мин повторить. Темно-красную надосадочную жидкость используют сразу либо хранят при t=4®С несколько суток.
Вариант 2. рН золя КЗ аккуратно подвести к изоэлектрической точке используемого Л. По таблице или экспериментально определить количество Л, необходимое для стабилизации КЗ при данном рН, увеличить его в 10 раз, растворить данное количество Л в 0.1 мл бидистиллированной воды и поместить в центрифужную пробирку. 10 мл КЗ, имеющего рН, оптимальный для связывания Л, добавить как можно быстрее к полученному раствору Л, которые адсорбируются на поверхности частиц КЗ. В смесь добавить 0.5 мл 1%-ного раствора ПЭГ-20000. Раствор центрифугировать для удаления несвязанного Л. Центрифугирование проводить при t=4®С с использованием Ti-ротора (25000 об./мин, для частиц КЗ с диаметром 8 нм - 45 мин, для частиц КЗ с диаметром 14 нм -30 мин). После центрифугирования в пробирке образуются 3 фазы: вверху раствор чистого несвязанного Л, на самом дне темное пятно нестабилизированных частиц КЗ, между ними у дна темно-красный осадок комплекса КЗ-лектин, который после отсасывания верхнего слоя ресуспензировать в 0.5 мл 0.1 М ФБФР с 0.02% ПЭГ-20000 (рН раствора должен соответствовать значению, оптимальному для связывания). Этот базовый раствор может храниться при t=4®С. Комплекс КЗ с Л сохраняет свою активность по крайней мере 6 мес.

11.1.2. Конъюгирование Л зародышей пшеницы (WGA) с КЗ [312]

Добавить 5 мг лиофилизированного WGA к 10 мл воды и перемешать. Смешать 6 мл полученного раствора ВГА с 20 мл раствора КЗ (диаметр частиц 6-8 нм, рН 9.0). Центрифугировать при 28000 об./мин в течение 30 мин. Осадок ресуспензировать в 5 мл раствора Хэнкса с добавлением 4% ПВП и 0.02% ПЭГ.

11.1.3. Конъюгирование Л с ферритином

К 5%-ному раствору ферритина, отдиализированному против воды, прибавить эквимолярное количество Л. Например, к 5 мл 0,5"10^-6 М раствора ферритина прибавить Л до получения 0,5"10^-6 М его раствора. Затем в раствор ввести углевод, блокирующий активный центр Л, до конечной общей молярности 0.05 М, рН смеси довести до 7.0-7.4 с помощью микродоз 1 М раствора NaOH и осветлить с помощью центрифугирования при 1000 об./мин в течение 10 мин. В смесь внести ГА до концентрации 0.03% и оставить на 1 ч. В процессе реакции необходимо тщательно контролировать рН раствора. Для каждого Л следует подбирать оптимальные значения рН (для канканавалина А рН 6.8, для лектина клещевины рН 7.4). Через 1 ч концентрацию ГА повысить до 0.06% и отрегулировать значение рН. Еще через 1 ч концентрацию ГА довести до 0.1% и опалесцирующий раствор диализировать против ФБФР в течение 4-6 ч. Остаточные альдегидные группы восстановить путем добавления в раствор NaBH₄ из расчета 1 мг/мл. Затем продолжить диализировать раствор против ФБФР в течение 12 ч, после чего конъюгат лектина с ферритином очистить путем аффинной хроматографии на биоспецифическом сорбенте. Очищенный конъюгат отделить от непрореа-гировавшего Л методом высаливания насыщенным раствором NaCl (за исключением Л сои). Насыщенный раствор NaCl не осаждает нативные Л, хотя осаждает большинство конъюгатов ферритина с белками. Л сои необходимо осаждать 25%-ным раствором сульфата аммония.

Полученные ферритиновые конъюгаты разбавить до титра гемагглютинации, т. е. в диапазоне от 1: 128 до 1: 64 и диализировать против ФБФР. Затем к растворам добавить 5 мг/мл сывороточного альбумина и провести стерилизацию фильтрованием через миллипоровый фильтр Зейца. Полученные реагенты хранить при t=4®С. Необходимо избегать замерзания раствора, так как при этом происходит агрегация молекул ферритина или конъюгатов Л-ферритин, и он становится непригодным для использования. Л, меченные ферритином, можно хранить в виде осадка в насыщенном растворе NaCl при t=4®С. Л сои, меченный ферритином, надо осаждать и хранить в 25%-ном растворе сульфата аммония.

11.1.4. Конъюгирование Л с ПХ

К раствору активированной ПХ добавить 40 мг N-ацетилглюкозамина и 4 мг Л, например зародышей пшеницы - WGA (при конъюгировании с Л сои на 10 мг Л добавить 30 мг галактозы). Смесь оставить на 3 ч при t=20®С. К раствору добавить борогидрид натрия или лития из расчета 0.5 мг/мл и диализировать против 4 М борогидрида на ФБФР, в течение 8 ч (t=4®С). Очистку конъюгата провести с помощью гельхроматографии на сефадексе Г150, используя в качестве элюэнта ФБФР. Перед нанесением образца на колонку раствор, содержащий продукты реакции, сконцентрировать до объема 0.4-0.5 мл в процессе ультрафильтрации, диализа под давлением либо с помощью сухого сефадекса Г 25. Раствор Л нанести на колонку высотой не менее 80-100 см. В элюате собрать фракции, обладающие одновременно пероксидазной и гемагглютинирующей активностью (первый пик белка).
Для стандартизации очищенного конъюгата Л определить активность ПХ и титр гемагглютинации. Последний показатель является более важным, так как указывает на сохранение биологической активности Л и возможности его применения для исследования углеводных детерминант. Полученный реагент разбавить до титра гемагглютинации, т. е. в пределах от 1: 32 до 1 : 16, добавить 5 мг/мл сывороточного альбумина и консервант (0.02%-ный раствор NaN₃ или 0.01%-ный раствор мертиолата) либо стерилизовать фильтрацией; хранить при t=4®С.

11.2. Визуализация лектиновых рецепторов в ТЭМ

11.2.1. Прямой метод с ферритином

Перфузировать сосуды 0.5%-ным раствором ГА на среде Хэнкса (рН 7.2) в течение 3 мин. Иссечь объекты и отмыть средой Хэнкса. Обработать 0.1 М раствором глицина на среде Хэнкса 3 раза по 1 мин. Промыть средой Хэнкса - 2 мин. Инкубировать в растворе Л, конъюгированного с ферритином, - 15 мин (t=4®С). Промыть средой Хэнкса - 1 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на ФБ (рН 7.2) - 30 мин (можно исключить). Постфиксировать в ЧО по Милонигу (см. Приложение, 3.7.2) -1ч. Подготовить для ТЭМ (если Л конъюгирован с ПХ, то после инкубации в растворе комплекса Л с ПХ следует инкубировать объекты в среде на ПХ 3 раза по 1 ч при t=20®С, затем промыть в среде Хэнкса, а далее - так же).
Контроль: 1) обработать 1%-ным овомукоидом перед введением Л; 2) добавить в раствор Л 200 ммоль/л специфического сахара.

11.2.2. Прямой метод с КЗ

Изолированные клетки фиксировать в 0.1%-ном растворе ГА, который приготовлен на 0.1 М ФБ (рН 7.3), содержащем 4% ПВП, и дважды отмыть тем же буфером и центрифугировать. Затем клетки ресуспензировать в 0.1 М растворе хлорида аммония на ФБФР при t=4®С, отмыть тем же буфером, содержащим ПВП, и обработать раствором комплекса Л с КЗ в течение 30 мин (t=4®С). Несвязавшийся реагент удалить отмыванием клеток в буфере с ПВП 3 раза по 10 мин. Клетки фиксировать 2.5%-ным раствором ГА -1ч, постфиксировать 1%-ным раствором ЧО в ФБ -1 ч (t=4®С), отмыть в буфере. Приготовить для ТЭМ.
Контроль: 1) обработать клетки меченым Л в присутствии специфического углевода; 2) исключить Л из процесса обработки препаратов; 3) обработать объект 1%-ным раствором йодной кислоты.

11.3. Постэмбеддинг. Мечение УС пектинами

11.3.1. Прямой метод

Снять УС на никелевую (или золотую) сеточку с подложкой, поместить сеточку на каплю ФБФР, имеющего рН, оптимальный для связывания КЗ с Л. Затем сеточку с УС перенести на каплю раствора комплекса Л с КЗ на 30 мин. Промыть сеточку сначала несильной струей ФБФР (рН 7.2) из пластиковой трубки, потом на большой капле того же буфера (2 раза по 5 мин), а затем в большой капле воды. Контрастировать с помощью УА и ЦС.
Контроль: 1) инкубировать сеточки на капле раствора комплекса Л с КЗ после преинкубации с раствором специфического сахара; 2) предварительно инкубировать с немеченым Л, а затем с комплексом Л с КЗ; 3) инкубировать УС в растворе комплекса Л с КЗ после обработки раствором антител против Л; 4) инкубировать в растворе комплекса КЗ с другим белком (например, овальбумином или БСА); 5) инкубировать в суспензии КЗ, стабилизированного с помощью ПЭГ.

11.3.2. Непрямой метод

УС снять на никелевую сеточку с подложкой и поместить срезами вниз на каплю ФБФР, имеющего рН, оптимальный для связывания КЗ с Л. Затем сеточку перенести на каплю раствора немеченого Л (20-300 мкг/мл) на ФБФР (рН 7.2) на 30 мин (можно 45-60). Обильно промыть в слабой струе ФБФР, погрузить в ФБФР на 5 мин. Промокнуть на фильтровальной бумаге. Сеточку поместить на каплю раствора комплекса КЗ со специфичным для Л белком (например, овомукоидом) на 30 мин. Обильно промыть сеточку в ФБФР и воде, затем высушить на воздухе. Контрастировать с помощью УА и ЦС.
Контроль: 1) инкубировать в растворе Л после предварительной обработки срезов специфичными сахарами; 2) инкубировать только с комплексом КЗ с овальбумином (обработку Л из схемы исключить); 3) вначале инкубировать с Л, затем в растворе специфичного для Л белка (гликопротеина), а потом в растворе комплекса КЗ со специфичным белком (гликопротеином); 4) проинкубировать УС в нейроминидазе (если используется Л, специфичный для сиаловых кислот, например Limas flavus aggl.), затем следует обработать Л, а потом комплексом гликопротеина с КЗ; 5) экстрагировать сиаловые кислоты из срезов с помощью 0.1 М H₂SO₄ в течение 60 мин (t=80®С) до инкубации УС как в Limas flavus aggl., так и в растворе комплекса овомукоида (или фетуина) с КЗ; 6) инкубировать в растворе Л, а затем в растворе комплекса БСА с КЗ или овальбумина с КЗ.

11.4. Мечение пектинами крио-УС или изолированных клеток

Фиксировать объекты в приготовленном на 0.1 М КБ (рН 7.2) раствором, содержащим 0S% ГА и 4% ФА, в течение 30 мин (t=4®С). Обработать 0.05 М хлоридом аммония - 2 ч (t=30®С). Поместить объекты в 10%-ный раствор ДМСО на КБ - 3 раза по 1 мин. Заморозить в изопентане. Приготовить криосрезы толщиной 10 мкм и поместить их в ФБФР (рН 7.4). Инкубировать в растворе Л с добавлением 0.1% сапонина и БСА (0.1 мг/мл) - 3-6 ч. Инкубировать в растворе ПХ (100 мкг/мл, t=20®С) -6ч (помешивать). Промыть в ФБФР - 2 мин. Фиксировать 1%-ным раствором ГА (t=4®С) -1ч. Инкубировать в ИС - 15 мин (t=20®С). Промыть в бидистиллированной воде 3 раза по 1 мин. Постфиксировать 1%-ным раствором ЧО с феррицианидом (см. Приложение, 3.10.1) - 30 мин. Постфиксировать 1%-ным раствором ЧО на вероналацетатном буфере (рН 7.2) -8 ч. Обезводить и подготовить для ТЭМ.
ИС: растворить ДАБ (0.5 мг/мл) в 10 мл 0.05 М Трис-HCi буфера (рН 7.6) и добавить 1%-ный раствор перекиси водорода (20 мкл/мл).
Контроль: 1) исключить Л из ИС; 2) исключить ИС; 3) добавить в ИС специфичный конкурентный сахар (от 100 до 300 ммоль/л).

11.5. Визуализация лектиновых рецепторов эндотелия в СЭМ

Обработку вести при t=4®С: проперфузировать сосуды средой Хэнкса - 1 мин, а затем 2%-ным раствором ГА на 0.1 М КБ (рН 7.2) - 5 мин; промыть раствором Хэнкса - 1 мин; ввести в просвет сосуда раствор конканавалина А на том же буфере на 15 мин; промыть средой Хэнкса. Поднять температуру до 37®С: ввести в просвет 0.1%-ный раствор гемоцианина на том же буфере -1ч; промыть раствором Хэнкса - 30 с; постфиксировать 1%-ным раствором ЧО - 1 ч (t=20®С). Подготовить для СЭМ.
Контроль: 1) вместо 1%-ного раствора конканавалина А использовать смесь 1%-ного раствора конканавалина А и 0.1 М раствора L-метил-D-маннозида (1:9).

11.6. Визуализация лектиновых рецепторов в СЭМ с помощью антител [178]

Фиксировать в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.2) -2ч (t=4®С). Обработать 0.2 М раствором глицина на ФБФР - 30 мин. Промыть в физрастворе (см. ниже), забуференном Трис (рН 7.4) - 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе лектина (например, 100 мкг/мл конканавалина в физрастворе, забуференном Трис (ТБФР), с добавлением 1 ммоль/л MnCl₂ и 1 ммоль/л CaCl₂) - 60 мин. Промыть ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе очищенных кроличьих антилектиновых антител -2 ч. Промыть ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе очищенных козьих противокроличьих антител, конъюгированных с КЗ (диаметр 30 нм) - 60 мин. Промыть в ТБФР. Постфиксировать в ЧО и подготовить для СЭМ.
Физраствор, забуференный Трис: приготовить раствор, содержащий 10 ммоль/л Трис и 150 ммоль/л NaCl (рН 7.4).
Контроль: 1) исключить Л; 2) добавить 0.25 М раствор специфического ингибитора (d-метил-D-манноза) к раствору конканавалина А (1 : 1).

12. ИММУНОМЕЧЕНИЕ

12.1. Блокирование альдегидных групп на крио-УС

Сеточки с крио-УС поместить на крупную каплю 0.01 М раствора глицина, приготовленного на ФБФР. После трех таких промываний сеточку перенести на каплю такого же раствора, содержащего 2% желатины, на 10 мин, и вновь промыть на 4-6 каплях 0.01 М глицина на ФБФР.

12.2. Иммуномечение крио-УС

Фиксировать образцы в ФА. Изготовить крио-УС и поместить их на никелевые или золотые сеточки. Обработать 0.02 М раствором глицина на ФБ (или свежеприготовленным 1%-ным раствором борогидрида на ФБФР) - 10 мин. Промыть ФБ 2 раза по 1 мин. Промыть раствором, блокирующим неспецифическое связывание (РБНС), например 0.1%-ным раствором БСА на ФБФР с добавлением 0.1% желатины, - 15 мин. Инкубировать срезы с раствором первых антител в соответствующем разведении - 30-60 мин. Промыть в РБНС 2 раза по 5 мин. Инкубировать в растворе вторых антител в соответствующем разведении - 30-120 мин. Промыть в РБНС 2 раза по 5 мин. Промыть в ФБФР 2 раза по 5 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на ФБФР - 30 мин. Контрастировать срезы с помощью УА с добавлением метилцеллюлозы. Крио-УС после контрастирования можно заливать в акриловую смолу.

12.3. Иммуномечение крио-УС с помощью биотин-авидиновой системы

Фиксировать срезы в ФА и обработать их 1%-ным раствором борогидрида (или раствором глицина). Инкубировать в растворе первых антител (ПАТ) в соответствующем разведении - 60 мин. Промыть в РБНС 3 раза по 5 мин. Инкубировать в растворе биотинилированных вторых антител (ВАТ) в соответствующем разведении - 60 мин. Промыть в РБНС 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе комплекса: стрептавидина (или авидина) с КЗ (развести, например, в соотношении 1 : 50 с помощью РБНС) -120 мин (можно инкубировать до 4 ч). Промыть в РБНС 3 раза по 15 мин. Промыть в ФБФР 3 раза по 5 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на ФБФР - 10 мин. Промыть ФБФР 3 раза по 5 мин. Промыть водой 2 раза по 5 мин.

12.4. Преэмбеддинг с использованием КЗ в качестве маркера

Фиксировать в 4%-ном растворе ФА - 20 мин. Провести пермеабилизацию (обработать метанолом или 0.1%-ным раствором Тритона Х-100 и т. п.). Обработать 1%-ным раствором борогидрида или глицином - 30 мин. Обработать РБНС - 5 мин (лучше исключить). Инкубировать в растворе ПАТ (1 мкг/мл, разводить в РБНС) - 60 мин. Промыть в РБНС 3 раза по 5 мин. Инкубировать в биотинилированных ВАТ (2 мкг/мл) - 60 мин. Промыть РБНС 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе комплекса стрептавидина (или авидина) с КЗ (обычно разводят в соотношении 1 : 50 с помощью РБНС) - 120 мин (можно до 4 ч). Обработать РБНС 3 раза по 15 мин, а затем ФБФР 3 раза по 5 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на ФБФР - 10 мин. Промыть в ФБФР 3 раза по 5 мин. Подготовить для ТЭМ.

12.5. Преэмбеддинг с ПХ [332]

Вариант 1. Кусочки ткани (объемом 0.5 см ) фиксировать (можно исключить) и поместить в ФБФР, содержащий 2.3 М сахарозы, на 6-8 ч, быстро заморозить и оттаять в 2.3 М сахарозе (t=4®С). Промыть в ФБФР. В криостате приготовить срезы толщиной 20-80 мкм. Срезы инкубировать в РБНС (10%-ном растворе нормальной сыворотки, козьей или свиной) - 30-60 мин. Промыть в ТБФР (рН 7.2). Инкубировать в растворе ПАТ (кроличьи IgG, разведенные на ФБФР с 5% БСА) в течение ночи. Промыть в ТБФР. Инкубировать в растворе ВАТ (противокроличьих) - 60 мин. Промыть в ТБФР. Инкубировать в растворе комплекса пе-роксидаза - антипероксидаза (ПАП) - 90-120 мин (комплекс кроличьих ПАТ с IgG, разведенный в ТБФР в соотношении 1 : 50). Промыть в ТБФР. Инкубировать в ИС (см. ниже) для выявления ПХ без добавления перекиси водорода - 10 мин. Инкубировать в полной ИС - 10 мин. Промыть в ТБФР. Постфиксировать в ЧО. Приготовить для ТЭМ.
Вариант 2 [246]. Фиксировать в перйодат-лизин-параформальдегидном фиксаторе (см. Приложение, 3.10.8) в течение 6 ч. Криостатные срезы инкубировать (в течение ночи) в растворе IgG в соответствующем разведении (например, 1 : 100). Отмыть в промывочном растворе. Инкубировать с Fab-фрагментом овечьих противокроличьих IgG, конъюгированных с ПХ, в соответствующем разведении (например, 1 : 50) в течение 2 ч. Отмыть в промывочном растворе. Дофиксировать 3%-ным раствором ГА на 0.1 М КБ (рН 7.4). Провести реакцию на ПХ (см. Приложение, 9.5). Подготовить объекты для ТЭМ.
ИС: приготовить на 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 7.6) 0.06%-ный раствор ДАБ, добавить 0.01% перекиси водорода.
Среда для пероксидазы [116]: 22 мг ДАБ растворить в 175 мл 0.05 М Трис-HCl буфера (рН 7.6), добавить 100 мкл 30%-ной перекиси водорода и профильтровать через миллипоровый фильтр. Порошок ДАБ при t < 0®С может храниться в течение года. Раствор ДАБ также можно хранить в замороженном виде. Перекись водорода сохраняет свои свойства в течение 2 мес после откупорки банки. Однако, если к раствору ДАБ добавлена перекись водорода, раствор стабилен только в течение часа.
Сеточки в ИС должны находиться в постоянном движении, для этой цели обычно используют магнитную мешалку.

12.6. Постэмбеддинг

12.6.1. Прямой метод с использованием акриловых УС

Преинкубировать сеточку с УС в РБНС (см. ниже) - 30 мин. Инкубировать с первыми моноклональными антителами (МАТ), конъюгированными с КЗ (в соответствующем разведении), - от 30 мин до 2 ч. Промыть в РБНС 3 раза по 5 мин (в большой капле). Промыть в ФБФР 3 раза по 5 мин (в большой капле). Промыть в воде 3 раза по 5 мин (в большой капле).
РБНС: приготовить на ФБФР 0.5%-ный раствор БСА, добавить 0.1% желатины.

12.6.2. Непрямой метод с использованием акриловых УС [115]

Поместить УС на никелевые сеточки. Инкубировать в нормальной сыворотке или БСА - 30 мин. Инкубировать в растворе ПАТ на 0.05 М ТБФР (рН 7.2) - 24 ч (t=4®С). Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2) 2 раза по 10 мин. Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2), содержащим 1% БСА, - 10 мин. Инкубировать в растворе ВАТ, конъюгированных с КЗ, который приготовлен на 0.02 М ТБФР (рН 8.2) и содержит 1% БСА, - 10 мин. Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2) с 1% БСА - 10 мин. Промыть в 0.05 М ТБФР (рН 7.2) 2 раза по 10 мин. Промыть в воде - 10 мин. Контрастировать с помощью УА и ЦС.

12.6.3. Непрямой метод с использованием эпоксидных УС

Обработать УС на сеточках 10%-ным раствором перекиси водорода. Промыть водой. Удалить избыток жидкости с сеточки и поместить ее в каплю раствора нормальной сыворотки животного (донора ВАТ) на ФБФР, содержащего 0.1% БСА. Удалить избыток нормальной сыворотки с сеточек и поместить их в раствор ПАТ, приготовленный на ФБФР с 0.1% БСА, на 1 ч при t=20®С или на 48 ч при t=4®С (оптимальное разведение ПАТ определяют эмпирически). Промыть, (при постоянном помешивании) в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 7.2), содержащем 0.2% БСА, 3 раза по 15 мин. Поместить сеточки на каплю раствора ВАТ, конъюгированных с КЗ, и инкубировать 1 ч (t=20®С) Тщательно промыть большим объемом 0.05 М Трис-HCl буфера (рН 7.2), содержащего 0.2% БСА, затем буфером без БСА и наконец водой. Осушить сеточки фильтровальной бумагой. Контрастировать УА и(или) ЦС.

12.6.3.1. Травление УС

Вариант 1. Удаление осмия из тканей. Приготовить 1%-ный или насыщенный водный раствор метаперйодата натрия (за 2-3 сут до использования). Сеточки с УС поместить плавать на каплю раствора или погрузить в нее на 10-60 мин, затем отмыть в ФБФР.
Вариант 2. Протравить УС в 10%-ном растворе перекиси водорода (10 мин) или в 1%-ном растворе йодной кислоты (1 мин). Это сделает смолу проницаемой для антител.

12.7. Иммуномечение поверхности клеток для СЭМ

Вариант 1 [178]. Фиксировать объект в 4%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.4) - 30 мин. Промыть в ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе ПАТ на ТБФР - 60 мин. Промыть в ТБФР 3 раза по 10 мин. Инкубировать в растворе ВАТ, конъюгированных с КЗ (например, с частицами диаметром 45 нм), -60 мин (после этого этапа можно увеличить диаметр частиц КЗ с помощью серебряного усиления). Промыть, обезводить, подготовить для СЭМ.
Вариант 2 [178]. Отмыть клетки. Фиксировать в 1%-ном растворе ФА на 0.1 М ФБ (рН 7.2) - 15 мин. Промыть клетки в ФБФР. Инкубировать в растворе кроличьих ПАТ (например, против фибронектина) в соответствующем разведении - 45-60 мин. Промыть в ФБФР. Инкубировать в растворе козьих противокроличьих ВАТ, конъюгированных с КЗ (диаметр частиц - 45 нм), -2 ч. Промыть в ФБФР. Постфиксировать в ЧО. Подготовить для СЭМ.

13. ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU

13.1. Гибридизация in situ на ПС

Инкубировать объекты на капле гибридизирующей смеси (t=37®С) - 5-10 ч. Промыть в ФБФР (или РБНС) 5 раз по 10 мин. Инкубировать в растворе кроличьих противобиотиновых антител (в соответствующем разведении) -2 ч. Промыть в ФБФР (или РБНС) 2 раза по 5 мин. Инкубировать в растворе комплекса протеина А с КЗ - 1 ч. Промыть в ФБФР (или в РБНС). Инкубировать в растворе антител против протеина А - 2 ч. Промыть в ФБФР (или в РБНС). Инкубировать в растворе комплекса протеина А с КЗ - 1 ч. Промыть в воде, высушить, просмотреть.

13.2. Гибридизация in situ радиационным способом

Поместить сеточки с УС на каплю гибридизирующей смеси с зондом, меченным 3Н-тимидином, во влажную камеру (t=37 ® С) на 24 ч. Промыть формамидным буфером (несколько капель) (t=37®С) - 20 ч, затем в ФБФР и в воде. Высушить и провести процедуру ЭМ-АРГ (t=4®С). Меченные тритием зонды денатурировать путем кипячения.

13.3. Гибридизация in situ с помощью биотинилированного зонда

Поместить сеточки с УС на каплю 0.1 М глицина на 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 7.4) на 10 мин. Обработать раствором РНКазы (100 мкг/мл на цитратном физрастворе (ЦФР) (см. ниже), разбавленном в 2 раза) в течение 1 ч (t=37®С). Промыть в 70%-ном растворе формамида на разбавленном в 2 раза ЦФР -2 мин (t=70®С), затем в 50%-ном растворе формамида на ЦФР (разбавленном в 2 раза) с добавлением 10 ммоль/л Трис-НСl буфера (рН 7.5) и 1 ммоль/л ЭДТА - 2 мин. Инкубировать в смеси для гибридизации - 9-10 ч (во влажной камере, t=37®С). Обработать в 50%-ном формамиде на ЦФР (разбавленном в 2 раза; t=37®С, крупная капля, помешивать) 4 раза по 30 мин. Промыть в ФБФР, затем в 4%-ном БСА на ФБФР - 15 мин. Промокнуть. Обработать противобиотиновыми антителами, разведенными на базовом растворе, содержащем 1% БСА и 0.5% Тритона Х-100, -2 ч, затем в том же растворе, но без антител (крупная капля, помешивать) - 30 мин. Инкубировать в анти-IgG на базовом растворе (с БСА и Тритоном Х-100) - 90 мин. Отмыть в 1%-ном растворе БСА на ФБФР (крупная капля, помешивать) 2 раза по 30 мин. Промыть в ФБФР - 30 мин. Промыть в воде - 30 мин. Контрастировать в УА, а затем в ЦС.
Цитратный физраствор (ЦФР): растворить 8.82 г цитрата натрия и 11S г NaCl в воде (свободной от РНКазы), долить водой до 1 л (рН 7.0).
Смесь для гибридизации.
Состав 1: приготовить 50%-ный формамид на ЦФР (разбавленном в 2 раза), добавить 10% сульфата декстрана, 0.3% фикола, 0.3% ПВП, 0.3% БСА, по 100 мкг/мл тРНК и ДНК спермы лосося, 1 мкг/мл зонда. Прокипятить 2 мин и хранить при t=0®С.
Состав 2: ввести нуклеотидный зонд в растворитель для гибридизации (см. ниже) до концентрации 6-20 мкг/мл.
Растворитель для гибридизации: смешать 20 мл 50%-ного раствора сульфата декстрана (Sigma) на воде, свободной от РНКазы, 15 мл, разбавленного в 2 раза ЦФР, 2 мл раствора 50-Денхардта (Denhardt, фирма Sigma), 10 мг ДНК спермы лосося (фирма Sigma), 100 мг пирофосфата натрия, 18 мл воды, свободной от РНКазы, 50 мл деионизированного формамида. Раствор может храниться при t=-30®С.
Контроль: 1) обработать свежеприготовленным раствором ДНКа-зы (10 мкм/мл) или РНКазы (100 мкг/мл) на ФБФР (который кипятят 15 мин для инактивации ДНКаз и хранят не дольше 1 мес при t=4®С) в течение 1 ч; 2) пользоваться небиотинили-рованным зондом; 3) исследовать клетки в другом функциональном состоянии (где данный ген не экспрессируется).

14. ТРЕЙСЕРЫ

14.1. Исследование проницаемости с помощью ПХ

В 4 мл ФБФР растворить 40-50 мг ПХ и ввести внутривенно. Через несколько минут после введения ПХ (в зависимости от цели исследования) провести 5-7-минутную перфузионную фиксацию с помощью 1.5%-ного раствора ГА на 0.1 М ФБ (рН 7.4), содержащего 25% ПВП-4000. Извлечь кусочки тканей и промыть их в буфере в течение ночи. Затем 20 мин инкубировать в буфере, содержащем 0.05% ДАБ, а потом инкубировать в ИС на ПХ в течение 15-60 мин (t=37 ® С). Промыть в буфере, а потом в воде. Постфиксировать в смеси ЧО с ферроцианидом (см. Приложение, 3.10.1) в течение 1 ч. Приготовить для ТЭМ.
ИС на ПХ: растворить в 10 мд Трис-HCl буфера (рН 7.6) 5 мг ДАБ и добавить 0.1 мл 1%-ной перекиси водорода.

14.2. Исследование проницаемости с помощью микропероксидазы

Ввести в сосудистое русло раствор микропероксидазы (по 5-10 мг в 0.2 мл физраствора на 20 г массы). Фиксировать в разбавленном фиксаторе Карновского в течение 2 ч. Изготовить вибратомные срезы. Промыть срезы в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.6). Выдержать в ИС (см. ниже) без добавления перекиси водорода (t=37®С) в течение 10 мин. Инкубировать в ИС (см. ниже) в течение 3 ч. Промыть 5 раз в том же буфере. Обработать в осмий-феррицианидном растворе (см. Приложение, 3.10.1) в течение 30-90 мин.
ИС: растворить в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.6) 0.1% ДАБ-тетрахлорида и 0.01% перекиси водорода.
ИС для микропероксидазы НИР и Н8Р: приготовить на 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.6-9.0 для НИР и рН 7.0-7.2 для Н8Р) 0.1 М раствор имидазола, содержащий 0.15% ДАБ-тетрахлорида, 0.02% перекиси водорода. Время инкубации 60 мин (t=20®С). В дальнейшем желательна обработка с помощью ТК.

14.3. Окрашивание коллоидным лантаном [253]

Фиксировать объекты в растворе Б в течение 1 ч. Промыть в растворе В в течение 16 ч. Постфиксировать в растворе Г в течение 1ч.
Раствор А: приготовить на бидистиллированной воде 3.5%-ный раствор La(NO₃)₂, оттитровать рН полученного раствора при помощи 0.1 М NaOH до 7.7, довести рН до 7.80 с помощью 0.01 М NaOH (на магнитной мешалке, контролируя рН) - осторожно, при рН 7.81 выпадает осадок. Раствор коллоидного лантана прозрачен и не опалесцирует.
Раствор Б: слить 17.5 мл 0.1 М КБ (рН 7.4), 25 мл 25%-ного раствора ГА и 5.0 мл раствора А.
Раствор В: а) слить 175 мл 0.1 М КБ (рН 7.4) и 5.0 мл раствора А; б) приготовить на 0.1 М КБ (рН 7.4) 2%-ный раствор ГА с добавлением 1.25% коллоидного лантана.
Раствор Г: слить 6.0 мл 2%-ного раствора ЧО на 0.1 М КБ (рН 7.4) и 2.0 мл раствора А.

14.4. Окрашивание коллоидным никелем

Фиксировать объекты в растворе Б с помощью иммерсии или перфузии -8 ч. Промыть в 0.1 М КБ (рН 7.2). Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО с добавлением 1% ферроцианид калия.
Раствор А: 1.0 г Ni(NO₃)₂"6H₂O растворить в 100 мл 0.1 М КБ (рН 7.2).
Раствор Б: перед самой фиксацией смешать 4 части раствора А с 1 частью 25%-наго раствора ГА (конечная осмолярность -850 мОсм).

14.5. Мечение поверхности объекта с помощью катионизированного ферритина [312]

Фиксировать объекты в разбавленном растворе Карновского (см. Приложение, 3.9.2). Промыть в 0.1 М КБ на 0.1 М сахарозе (рН 7.4) в течение 30 мин (сменить раствор несколько раз). Поместить в 0.15 М глицин с добавлением 7.5% сахарозы на 20 мин. Инкубировать при постоянном перемешивании в 2 мл суспензии катионизированного ферритина (фирма Sigma, 1 мг/мл) на среде 199 в течение 15 мин. Промыть и подготовить для ТЭМ.

15. ПОЛУЧЕНИЕ УГЛЕРОДНОЙ ПЛЕНКИ

Пары нафталина впускают в вакуумную камеру и подвергают воздействию высоковольтного разряда в течение 10 с. Это вызывает полимеризацию газа в виде тонкой пленки на поверхности объекта. Биологические ткани затем растворяют в 1%-ном растворе гипохлорита натрия в течение 5-10 мин.

16. ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ХОЛЕСТЕРИНА В МЕМБРАНАХ

Фиксировать объекты в 2.5%-ном растворе ГА на КБ (рН 7.4) с добавлением 50 ммоль/л филипина и 1% ДМСО (предварительно филипин растворить в нескольких микролитрах ДМСО) в течение 5 мин. Отмыть в КБ. Поместить в 20%-ный раствор глицерина на КБ на 15 мин. Заморозить. Методом замораживания - скалывания получить реплики для исследования в ТЭМ.

17. СОЧЕТАНИЕ МЕТОДОВ ЭМ

17.1. Оттенение макромолекул

С помощью пинцета расщепить пластинку слюды и получить две чистые поверхности. Провести диализ раствора исследуемых макромолекул против раствора смеси летучих веществ (аммоний ацетат, аммоний гидроксид, уксусная кислота и др.). Развести полученный раствор белка до концентрации 50-100 мкг/мл и добавить 25-50% чистого глицерина. Распылить раствор пульверизатором так, чтобы верхний конец пластинки слюды смачивался сильнее (для создания градиента плотности фракций). Вакуумировать полученные препараты в течение 20 ч под давлением 10^-7 Торр (1.33"10^-5 Па), чтобы удалить с поверхности все летучие вещества. Напылить пластинку вольфрамом или танталом под углом 10 0 при постоянном вращении объекта (толщина реплики должна быть 5 нм). Напылить слой углерода, контролируя его толщину с помощью пьезоэлектрического монитора или по цвету пленки. Покрыть слюду 05%-ным раствором нитроцеллюлозы в n-бутилацетате и промокнуть избыток. Высушить в течение 5 мин и разделить пластинку на более мелкие кусочки. Снять реплику на поверхность воды и поместить на сеточки. Слой нитроцеллюлозы можно удалить в амилацетате.

17.2. Метод распластывания и оттенения молекул ДНК с помощью формамида [114]

Растворить ДНК в растворе А до концентрации 1 мкг/мл. Добавить к полученному раствору цитохром С до конечной концентрации 100 мкг/мл, 60% перегнанного формамида (объемные доли), 100 ммоль/л Трис-HCl буфера (рН 8.5) и 10 ммоль/л ЭДТА. Наслоить полученный раствор на "гипофазу" (см. ниже). Собрать распластавшиеся объекты на сеточки с углеродными подложками, обработанными альциановым синим. Погрузить сеточки в 5"10^-4 М раствор УА на 96%-ном этаноле на 30 с. Промыть в 96%-ном этаноле и высушить. Провести круговое оттенение с помощью платинопалладиевого сплава (80 : 20) под углом 8®.
Раствор А: приготовить 0.001 М раствор ЭДТА на 0.01 М Трис-HCl буфере (рН 8.0).
Раствор-"гипофаза": приготовить 0.001 М раствор ЭДТА на 0.01 М Трис-HCl буфере (рН 85), добавить 30% формамида.

17.3. Исследование парафиновых блоков в СЭМ и ТЭМ

Удалить парафин с помощью ксилола (до трех раз по 2 ч - в зависимости от величины объектов; крупные кусочки обрабатывать ксилолом при t=60®С). Поместить объекты в 100%-ный этанол на 15 мин, затем в 50%-ный этанол на 15 мин. Промыть водой 2 раза по 10 мин. Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО -1 ч. Подготовить для СЭМ или ТЭМ.

17.4. Последовательное изучение объектов в СМ, СЭМ и ТЭМ [191]

После изготовления гистосрезов объект поместить в смесь (1 : 1) ксилола и этанола на 5 мин, потом в этанол на 5 мин, затем в смесь (1:1) этанола и изоамилацетата на 5 мин. Перенести срезы в изоамидацетат на 5 мин. Высушить с помощью перехода критической точки (ВКТ). Просмотреть в СЭМ, просмотренные объекты обводнить (этанол 100, 80, 65, 45, 25%-ный, затем вода -по 30 мин). Промыть в ФБ (рН 7.4) в течение 20 мин, постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО в течение 1 ч. Обезводить, заключить в Аралдит и приготовить УС для ТЭМ.

17.5. Анализ объектов, подготовленных для ТЭМ, в СЭМ

Растворить эпоксидную смолу 30%-ным раствором NaOH на 100%-ном этаноле (для кусочка размером 5 мм продолжительность обработки 48-60 ч). Отмыть в 100%-ном этаноле 3 раза по 1 ч. Подготовить для СЭМ.

17.6. Исследование объектов в СЭМ после СМ [272]

Обезводить в этаноле при возрастающих концентрациях (30, 50, 70, 85%-ный ) - по 1 ч в каждом растворе, затем в 100%-ном этаноле 3 раза по 15 мин. Обработать, перемешивая, смесью (1 : 1) среды А и абсолютного этанола в течение 30 мин. Пропитать в расплавленной среде A (t=37®С) 3 раза по 30 мин, а затем еще 1-12 ч. Поместить в свежерасплавленную и отфильтрованную среду А (см. ниже), дать объектам остыть до комнатной температуры и выдержать в течение 24 ч. Изготовить срезы толщиной 3-4 мкм. Обработать срезанные блоки (t=37®С) в 100%-ном этаноле 3 раза по 15 мин (для срезов 3 раза по 5 мин). Подвергнуть ВКТ и исследовать в СЭМ срезанную поверхность блока.
Среда А: 9 частей расплавленного дистеарата ПЭГ-400 перемешать с 1 частью 1-гексадеканола (t=60®С) до гомогенного состояния; хранить при комнатной температуре (не допускать двукратного нагревания до t=37®С).

17.7. Приготовление меламиновой подложки для культивирования клеток и ЭМ [345]

Выполнить те же процедуры, что и при изготовлении подложки из формвара (см. раздел 7.6.2), но перед погружением стекла в раствор меламина его следует нагреть до t=60®С, а при последующих манипуляциях использовать пинцет. Стекла вынимать из раствора медленно - в течение 1-2 с, высушивать 5 мин и для полимеризации смолы нагревать над пламенем (в ламинарном шкафу). Толщина пленки меламина 80 нм.
После культивирования клеток и подготовки объектов для СЭМ с использованием ВКТ пленка легко отделяется от стекла с помощью тонких пинцетов, ресницы или другого сверхтонкого инструмента.
Раствор меламина: 1 мл эфира гексаметилолмеламина (Agar Scientific, Stansted) растворить в 99 мл 100%-ного сверхчистого этанола и добавить 03% паратолуенсульфоновой кислоты (инициатор); раствор стабилен при комнатной температуре несколько недель.

17.8. Фиксация бактерий

Фиксировать в 6.25%-ном растворе ГА на буфере А (см. ниже) в течение 1 ч. Сполоснуть в буфере А. Постфиксировать в растворе Б в течение 1 ч. Сполоснуть в буфере А. Контрастировать в 0"5%-ном растворе УА на буфере А в течение 1 ч. Обезводить и подготовить для ТЭМ.
Буфер А: (рН 6.2-6.4): смешать 5 мл 0.1 М раствора веронала натрия, 2.0 мл 8.5%-ного раствора NaCl, 6.7 мл 0.1 М раствора НСl и 11.3 мл воды.
Раствор Б: смешать 12 мл вероналацетатного буфера, 0.25 мл насыщенного раствора СаCl₂ и сразу добавить 12.5 мл 2%-ного раствора ЧО.

17.9. Фиксация бактериальных клеток по Рейтеру [9]

К 1 части культуры бактерий в жидкой среде добавить 10 частей раствора ЧО (см. ниже), отцентрифугировать при 4000 об./мин в течение 5 мин. Осадок ресуспензировать в 0.1 мл питательной среды, к которой добавить 10 мл 1%-ного раствора ЧО, приготовленного на растворе Б, и оставить на ночь. Добавить 10 мл раствора А и отцентрифугировать при 4000 об./ мин в течение 4 мин. Осадок залить 0.03 мл 2%-ной желатины, хорошо перемешать и нанести каплю на предметное стекло при t=45®С. После застывания нарезать каплю на кубики объемом 1 мм и обработать их 0.5%-ным раствором УА, приготовленным на растворе А. Обезводить и подготовить для ТЭМ.
Раствор ЧО: приготовить 1%-ный раствор ЧО на растворе А.
Раствор А: 19.428 г уксуснокислого натрия, 29.428 г веронала натрия, 34.0 г NaCl растворить в небольшом количестве воды и долить водой до 1 л; к 5 мл полученного раствора добавить 7 мл 0.1 М НСl, 13 мл бидистиллированной воды и 0.25 мл 1 М CaCl₂ (рН 6.0).
Раствор Б: приготовить 10%-ный Тритон Х-100 на растворе А.

18. СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ НАТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ

18.1. Электропроводный клей

Состав 1: растереть в фарфоровой ступке 150 г графита, 300 г серебра порошкового, 300 г сополимера винилхлорида-винилацетата и 320 мл ацетона.
Состав 2: растереть в фарфоровой ступке 600 г серебра порошкового, 60 г порошка графита, 40 г нитроцеллюлозы, 26 г канифоли и 300 мл ацетона.
18.2. Осмирование образцов для СЭМ
После фиксации в ЧО отмыть объекты в КБ (рН 7.4) - 10 мин. Обработать 1%-ным раствором ТК на 0.05 М КБ (рН 7.0) - 30 мин. Отмыть в КБ. Приготовить для СЭМ.

18.3. Выявление лимфатических сосудов в СЭМ [305]

Перед фиксацией на 10 мин погрузить объекты в 0.75%-ный раствор перекиси водорода - лимфатические капилляры при этом растягиваются. Фиксировать иммерсией в 4%-ном растворе ФА с добавлением 1% перекиси водорода -2 ч. Покровные слои ткани осторожно удалить тонким пинцетом и поместить оставшийся кусочек в 8 М раствор НСl на 30 мин (t=40®С). Подготовить объекты для СЭМ.

18.4. Импрегнация межэндотелиальных границ для анализа в СЭМ

Вариант 1. После перфузионной глютаровой фиксации отмыть сосуды 5%-ным раствором глюкозы в течение 5 мин. Последовательно проперфузировать (или промыть после извлечения кусочка) сосуды 0.15%-ным раствором AgNO₃ - 1 мин, 5%-ным раствором глюкозы - 1 мин, раствором, содержащим 3% СоВг₂ и 1% NH₄Br - 1 мин, 5%-ным раствором глюкозы - 1 мин, 2.5%-ным раствором ГА - 2 мин. Иссечь участок сосуда и дофиксировать в ГА в течение 24 ч. Приготовить для СЭМ.
Вариант 2. Перед фиксацией промыть сосуды 5%-ным раствором глюкозы, приготовленным на 0.01 М ГЕПЕС (рН 7.0), -1 мин, перфузировать 0.05%-ным раствором AgNO₃ на свежеприготовленном 5%-ном растворе глюкозы - 30 с, затем отмыть 5%-ным раствором глюкозы на 0.01 М ГЕПЕС (рН 7.0) - 1 мин. Перфузировать раствором, содержащим 1% NH₄Br и 3% СоВг₂, -1 мин. Фиксировать 2%-ным раствором ГА на КБ (рН 7.2) -2 ч. Подготовить для СЭМ.

18.5. Импрегнация трупного материала

Не позднее чем через 2 ч после смерти отмыть сосуды раствором Хэнкса с гепарином (10 ЕД/мл). Фиксировать 2.5%-ным раствором ГА на растворе Хэнкса - 5 мин. Иссечь кусочки (можно хранить не более 1 сут в 0.9%-ном растворе хлорида натрия). Отмыть сосуд в 5-5%-ном растворе глюкозы - 1 мин. Инкубировать в 0.15%-ном растворе AgNO₃ - 90 с. Последовательно проинкубировать в 5.5%-ном растворе глюкозы - 1 мин, в растворе, содержащем 1% NH4BT и 3% СоВг₂, - 1 мин, в 55%-ном растворе глюкозы - 1 мин, в 2.5%-ном растворе ГА - 5 мин. Вскрыть сосуд вдоль оси, отделить адвентицию пинцетом от комплекса внутренней и средней оболочек. Приготовить для СЭМ.

19. ИССЛЕДОВАНИЕ В СЭМ НЕСВОБОДНЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ

19.1. Обнажение внутренней поверхности плазмалеммы

Свежеотщепленную пластинку слюды погрузить в 0.01%-ный раствор альцианового синего или L-полилизина и сполоснуть в воде. Каплю взвеси изолированных клеток в ФБФР поместить на слюду и выдержать в горизонтальном положении для прикрепления клеток к слюде. Промыть 10-кратным погружением пластинки в ФБФР. Прикрепленные клетки обработать 30%-ным раствором глицерина на 0.155 М ацетате аммония. Избыток раствора промокнуть фильтровальной бумагой. Клетки в течение 1 ч вакуумировать, а затем напылить слоем углерода (10 нм). Полученный препарат осторожно погрузить в воду - вследствие осмотического разрушения клеток угольная пленка с адгезированной плаз-малеммой всплывает на поверхность жидкости. На пленку разложить ЭМ-сеточки, снять их и подвергнуть негативному контрастированию со стороны внутренней поверхности на капле 2%-ного раствора УА (рН 45) или молибдата аммония (рН 6.9).

19.2. Обнажение внутриклеточных структур с помощью осмиевой мацерации

Вариант 1. Фиксировать объект перфузией раствора, содержащего 0.5% ГА и 0.5% ФА, 5 мин. Вырезать кусочки. Пропитать растворами ДМСО при возрастающей (до 50%) концентрации. Заморозить в тающем пропане или фреоне-111. Расколоть под жидким азотом. Поместить в 50%-ный раствор ДМСО. Отмыть криопротектор буферным раствором. Постфиксировать в 1%-ном растворе ЧО. Мацерировать в 0.1%-ном растворе ЧО на 0.15 М ФБ (рН 7.4) - 3 сут (t=20®С). Импрегнировать осмием с помощью ТК или тиокарбогидразида (см. Приложение, 18.2). Обезводить, подвергнуть ВКТ (или замораживанию - высушиванию), напылить платиной (или сплавом золота с палладием), изучить в СЭМ (или очистить реплику и изучить в ТЭМ).
Вариант 2. Фиксировать объекты в 1%-ном растворе ЧО на 0.067 М ФБ (рН 7.4) в течение 15 ч. Промыть в ФБ. Погрузить в 25%-ный раствор ДМСО на ФБ на 1 ч (пока объекты не утонут). Перенести в 50%-ный раствор ДМСО на 1 ч. Промокнуть кусочки, заморозить (например, в жидком азоте) и расколоть в замороженном состоянии. Отметить сколотую поверхность и поместить в 50%-ный раствор ДМСО до полного оттаивания. Погрузить в 0.1%-ный раствор ЧО на 30 мин, а затем в новую порцию на 72 ч. Обезводить в этаноле. Подвергнуть ВКТ. Смонтировать на столик сколотой поверхностью вверх.

19.3. Выявление цитоскелета [237]

Промыть объекты раствором Хэнкса (t=37®С). Обработать свежеприготовленным 0.001 М раствором ДСТ на растворе Хэнкса -15 мин (t=37®С). Обработать свежеприготовленным 0.001 М раствором ДСТ с добавлением 05% Тритона Х-100 на цитоскелетстабилизирующем буфере (ЦСБ) - 10 мин (t=37®С). Промыть в ЦСБ - 5 мин. Фиксировать в 2.5%-ном растворе ГА на ЦСБ - 10 мин (t =37®С). Фиксировать в 2%-ном растворе ГА на 0.1 М КБ (рН 7.2) - 2-4 ч. Провести замораживание - высушивание. Приготовить для СЭМ.

19.3.1. Выявление цитоскелета эндотелия

Промыть сосуды раствором Хэнкса (средой 199) с гепарином (10 ЕД/мл) - 1 мин. Перфузировать сосуды 1%-ным раствором Тритона Х-100 на ЦСБ (см. Приложение, 19.3.2) - 5 мин. Перфузировать 2%-ным раствором ГА на ЦСБ - 2 мин, а затем 2%-ным раствором ГА на растворе Хэнкса - 5 мин. Подготовить для СЭМ.

19.3.2. Цитоскелетстабилизирующие буферы (ЦСБ) (см: [22])

Раствор А (ммоль/л): 137 NaCl, 5 КСl, 2 MgCl₂, 2 ЭГТА, 5 имидазола, 4000 глицерина (рН 6.8, t=20®С).
Раствор Б (ммоль/л): 1 ЭГТА, 4% ПЭГ-6000, 100 ПИПЕС (рН 6.9).
Раствор В (ммоль/л): 1 ГТФ, 1 MgSO₄, 2 ЭГТА, 100 ПИПЕС (рН 6.85).
Раствор Г (ммоль/л): 10 ПИПЕС, 100 NaCl, 3 MgCl₂, 1 ЭГТА (рН6.7)[92].
Раствор Д (ммоль/л): 100 ПИПЕС, 1 ЭГТА, 0.0015% фенолового красного, 4% ПЭГ-4000 (рН 6.9) [92].
Раствор Е (ммоль/л): 30 ГЕПЕС, 70 КСl, 5 MgCl₂, 3 ЭГТА, 0.01 таксола, 0.25% ФМСФ (рН 7.0) [92].

19.3.3. Диссоциирующий раствор

Состав (ммоль/л): 1% Тритона Х-100,80 КСl,5 MgCl₂, 3 ЭГТА, 30 ГЕПЕС (рН 7.2); диссоциация длится 10 мин (t=0®С) [22].

19.3.4. Фиксатор для сохранения цитоскелета после диссоциации с помощью Тритона Х-100

Приготовить на 0.1 М ФБ (рН 7.4) 2%-ный раствор ГА, добавить 50 ммоль/л лизинхлорида (t=23®С). Фиксировать 45 мин.

19.4. Обнажение скрытых поверхностей клеток

Фиксировать объекты в 1%-ном растворе 40 на 0.2 М КБ (рН 7.2) в течение 3-5 ч (t=4®С). Промыть водой. Обработать 1%-ным раствором борной кислоты -5ч (если дольше, то может повреждаться плазмалемма). Через каждые 1-2 ч проводить измельчение с помощью медленно вращающегося гомогенизатора или стеклянной палочки. Суспензию налить на слой желатины, дать отстояться 5-10 мин. Жидкость удалить. Обработать осадок 2%-ным раствором ГА. Подготовить для СЭМ.

19.5. Выявление эластического каркаса с помощью муравьиной кислоты

Фиксировать сосуд перфузией 4%-ного раствора ФА в течение 10 мин и оставить в том же фиксаторе на 12-24 ч. Удалить адвентицию, жировую ткань. Поместить колечки сосуда длиной 1 мм в 88%-ный раствор муравьиной кислоты (t=45®С) на 24-216 ч (кусочки становятся прозрачными и отечными). Тщательно отмыть в 0.002 М растворе НСl до тех пор, пока кусочки не приобретут первоначальные размеры (нельзя использовать нейтральный буфер). Заморозить и лиофилизировать при давлении 10^-6 Торр (1.33"10^-4 Па) в присутствии поглотителя паров воды (пятиокись фосфора). Подготовить для СЭМ.

19.6. Выявление неклеточных структур в костях

Фиксировать объекты 2%-ным раствором ГА в течение 24 ч. Обработать 4%-ным раствором ЭДТА, содержащим 3.5% сахарозы, - 16 ч. Фиксировать 2%-ным раствором ГА - 8 сут. Обработать 5 М раствором КОН (t=60®С) - 8 мин, а затем 2%-ным раствором ТК - 30 мин. Промыть водой. Постфиксировать 2%-ным раствором ЧО. Обезводить. Подготовить для СЭМ.

19.7. Визуализация базальных мембран

Обработать нефиксированные тонкие (размером менее 1 мм) кусочки органа 0.01 М раствором ЭДТА - 8-12 ч (t=4®С). Интенсивно отмыть водой. Обработать 3%-ным раствором Тритона Х-100 - 6-8 ч. Промыть водой. Обработать 4%-ным раствором дезоксихолата натрия с добавлением 0.1% азида натрия (t=20®С, встряхивать) - 6-8 ч. Для получения ровных краев препарата рекомендуется последующее криоскалывание. В органах с хорошо развитой стромой метод "работает" неудовлетворительно.

20. СЭМ КОРРОЗИОННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Промыть сосуды солевым раствором с добавлением 10 ЕД/мл гепарина - 1-2 мин. Провести перфузионную фиксацию 0.5%-ным раствором ГА - 3 мин (можно исключить). Ввести в исследуемую полость (например, в сосуды) инъекционную массу. Поместить животное (орган) в воду (t=60®С) для завершения полимеризации на 2 ч. Мацерировать объект в 20%-ном растворе NaOH в течение 2 ч (t=60®С). Промыть водой. Мацерировать объект в 8 М НСl (можно исключить) - 1 ч (t=40®С). При необходимости мацерацию и промывание повторить. Промыть водой, высушить на воздухе. Напылить проводящий слой и просмотреть в СЭМ.
Состав смолы Батсонс 17 (Batson's 17): мономер - 200 мл, катализатор - 24-40 мл, промотер (С) - 24 капли, состав отвердевает через 45-120 мин.

21. МАРКЕРЫ В ЭМ

21.1. Приготовление КЗ

Вариант 1. Приготовить растворы А-Е.
Раствор А: тщательно вымыть посуду (лучше использовать силиконизированное или специальное стекло); вскрыть ампулу с HAuCl₄ и немедленно перенести в соответствующее количество бидистиллированной воды, чтобы получился 1%-ный раствор (этот раствор хранится в абсолютной темноте при t=4®С).
Раствор Б: приготовить 1%-ный раствор цитрата натрия (ex tempore).
Раствор В: приготовить 1%-ный раствор ТК (ex tempore). Раствор Г: приготовить 0.025 М раствор К₂СО₃. Раствор Д: слить 1 мл раствора А и 79 мл бидистиллированной воды.
Раствор Е: слить 4 мл раствора Б, X мл раствора В и (16 - X) мл раствора Г, долить бидистиллированной водой до 20 мл.
Нагреть растворы Д и Е до t=60®С и влить раствор Е в раствор Д, интенсивно перемешивая. Поднять температуру до 100®С и оставить с обратным холодильником на 30 мин. При увеличении X с 0.1 до 5 мл размеры частиц КЗ уменьшаются с 10 до 3.5 нм. Для измерения частиц КЗ на сеточку с подложкой капают раствор КЗ, высушивают и просматривают в ТЭМ.
Вариант; 2. Приготовить 0.01%-ный раствор HAuCl₄ и 1%-ный раствор трехзамещенного цитрата натрия на бидистиллированной воде. Нагреть до кипения 100 мл раствора золотохлористоводород-ной кислоты и при перемешивании к нему добавить 2.5 мл раствора цитрата натрия. Через 25 с кипящая смесь приобретает серовато-синий цвет (начало коллоидообразования), еще через 2 мин она становится оранжево-красной (образование монодисперсных сферических коллоидных частиц диаметром 15 нм). Если внести в кипящий раствор HAuCl₄ не 25 мл, а 4 мл цитрата натрия, то размер частиц будет не 15 нм, а соответственно 40 нм. Во всех случаях желательно проверить монодисперсность полученного золя и диаметр коллоидных частиц с помощью ТЭМ.
Свежеприготовленный раствор КЗ имеет рН 55. Коррекцию рН проводят с помощью 0.2 М раствора К₂СО₃ или 0.1 М раствора Н₃РО₄. Перед регулированием рН к каждым 10 мл золя необходимо прибавить 2 капли 1%-ного раствора ПВП.

21.2. Конъюгирование IgG с КЗ

Адсорбировать 4 мл антисыворотки на 2 мл активированного геля Сефарозы, с которым связаны кроличьи иммуноглобулины (t=20®С). Гель промыть ФБФР, и противокроличьи иммуноглобулины элюировать с помощью 4 мл 3 М раствора KCNS. Концентрацию белка довести до 1 мг/мл, п раствор диализировать против 0.002 М раствора буры (рН 9.0). Агрегаты IgG можно отцентрифугировать (50 тыс. g , 30 мин). Агрегация уменьшается, если увеличить разведение и рН. Добавить к 30 мл раствора КЗ (12 нм) с рН больше 9.0 антисыворотку, причем ее количество должно превышать точку стабилизации на 10%. Через 1 мин добавить соответствующий объем 10%-ного раствора БСА, чтобы получить конечную концентрацию 0.25% для стабилизации частиц КЗ. От-центрифугировать при 50000 g в течение 45 мин. Осадок будет состоять из нижнего компактного слоя и верхнего рыхлого. Надосадочную жидкость аккуратно слить. Верхний (рыхлый) слой ресуспензировать в оставшемся супернатанте. Отцентрифугировать в градиенте плотности (10.5 мл, длина 8 см) сахарозы (10-30%), приготовленной на ТБФР (см. ниже) (рН 8.2) в течение 30 мин (20 тыс. об./мин). Комплекс IgG с КЗ хранится в течение нескольких месяцев, если добавить 0.02% азида натрия (t=4®С), или его порции могут быть заморожены и храниться при t=-70®С.
Физраствор, забуференный Трис (ТБФР): приготовить раствор, содержащий 10 ммоль/л Трис и 150 ммоль/л NaCl (рН 8.2).

21.3. Конъюгирование протеина А с КЗ

Довести рН взвеси частиц КЗ (15 нм) до рН 5.5-6.0. Затем 10 мл взвеси добавить к такому объему профильтрованного через миллипоровый фильтр раствора протеина А, который содержит 0.3 мг этого вещества (нельзя раствор протеина А вливать в раствор КЗ - могут образоваться агрегаты). Полученный раствор центрифугировать в ультрацентрифуге при 25000 об./мин (t=4®С), используя ротор Тисо. Если размер частиц КЗ соответствует 5 нм, то центрифугирование осуществляется при 40000 об./мин в течение 1 ч, а если 40 нм - то при 15000 об./мин - 30 мин. После окончания ультрацентрифугирования в пробирке образуются три фазы: 1) вверху чистый супернатант, содержащий свободный протеин А; 2) ниже темно-красный седимент - комплекс КЗ с протеином А; 3) темное пятно на стороне пробирки около дна -металлическое золото, не стабилизированное протеином А. Седимент растворить в 1.5 мл 0.01 М ФБФР (рН 7.3), содержащего 0.02% ПЭГ-20000 (вместо ПЭГ можно использовать сывороточный альбумин), и хранить при t=4®С. Конечная адсорбция рабочего раствора равна 0.5 при 525 нм. Перед мечением образованные во время хранения агрегаты надо удалить 5-минутным центрифугированием при низкой скорости (3500 об./мин). Комплекс КЗ с протеином G приготовить тем же способом, но рН должен быть равен 5.0, а ПЭГ лучше добавлять в конце очистки при ресуспензировании комплекса.

21.4. Серебряное усиление

Вариант 1. После иммуномечения УС промывают 3 раза по 10 мин в том буфере, который использовался для разведения антител, затем промывают в бидистиллированной воде или разведенном (0.02 М) Na-цитратном буфере 5 раз по 1 мин. Для того чтобы избежать потери метки, УС желательно постфиксировать с помощью 05-2.0%-ного раствора ГА - 10-15 мин. Вновь промыть в бидистиллированной воде - 10-45 мин. УС покрыть 0.05%-ным раствором желатины и высушить. Желатина предупреждает выпадение аутокаталитических преципитатов из проявителя, уменьшает зерно. Стекла должны быть очень чистыми. Всю процедуру желательно проводить при красном свете.
После обработки в проявителе УС тщательно промыть в бидистиллированной воде. Покрытые желатиной срезы в течение 45 мин промыть в теплой (t=40®С) воде для удаления слоя желатины и сполоснуть в бидистиллированной воде.
Вариант 2. После окрашивания комплексом стрептавидина с КЗ препарат отмыть в воде для удаления ионов серебра. Затем промыть в разведенном в 50 раз растворе А. Погрузить на 10 мин без встряхивания в свежеприготовленный раствор Г (проявитель). Промыть в воде. Закрепить в течение 5 мин в подходящем фиксаже, разведенном водой (1:5). Тщательно промыть в воде. Потеря частиц КЗ во время усиления серебром может быть предупреждена путем дополнительной фиксации в 1%-ном растворе ГА после иммуноинкубации.
Раствор А: в 100 мл воды растворить 11.7 г дигидрата трехзамещенного цитрата натрия и 12.75 г моногидрата лимонной кислоты.
Раствор Б: в 7.5 мл воды растворить 0.055 г лактата серебра.
Раствор В: в 7.5 мл воды растворить 0.425 г гидрохинона.
Раствор Г: смешать 10 мл раствора А, 7.5 мл раствора Б, 75 мл раствора В, 25 мл воды (защищать от света).

21.5. Серебряное усиление после реакции на ПХ

Отмыть объект в ФБФР. Проинкубировать в течение 4 ч в 10%-ной тиогликолевой кислоте. Промыть в ацетатном буфере 3 раза по 10 мин. Проинкубировать в усилителе (см. Приложение, 21.5.1.) с постоянным (через каждые 5-10 мин) просмотром в СМ для определения времени окончания реакции. Сполоснуть в 1%-ной уксусной кислоте (стоп-ванна). Промыть в ацетатном буфере 3 раза по 5 мин. Проинкубировать в 0.05%-ном растворе хлорида золота - 3-10 мин. Промыть в 3%-ном растворе тиосульфата натрия - 5 мин. Промыть в ацетатном буфере 3 раза по 5 мин. Обработать в ЧО и подготовить для ТЭМ.

21.5.1. Усилитель коллоидного золота

Вариант 1. Смешать 60 частей раствора А, 10 частей раствора Б, 15 частей раствора В, 15 частей раствора Г. Проявитель профильтровать через Ватман N 4. Обрабатывать в темноте в течение 5 мин.
Раствор А: 1 кг гуммиарабика с помощью магнитной мешалки растворить в 2 л деионизированной воды (использовать только чистую посуду), затем профильтровать через несколько слоев марли и хранить в пластиковых бутылях при t=-20®С.
Раствор Б: 25.5 г лимонной кислоты и 236.0 г безводного цитрата натрия растворить в воде, объем довести до 100 мл (рН 7.4).
Раствор В: в 15 мл деионизированной воды растворить 0.85 г гидрохинона.
Раствор Г: 0.11 г нитрата серебра растворить в деионизированной воде, объем довести до 15 мл, серебро в усилитель добавить непосредственно перед использованием (в темноте).
Вариант 2. Фотоэмульсию (например, L4) растворить до концентрации 40 мг/мл в проявителе следующего состава: метол -0.075 г, безводный сульфит натрия - 0.05 г, тиоцианат натрия -0.02 г, бидистиллированная вода - 10 мл (рН 6.3).
Вариант 3. Приготовить на на 0.01 М цитратном буфере раствор, содержащий 0.6% ацетата серебра, 0.8% гидрохинона, 15% гуммиарабика. Проявлять 2-5 мин.
21.6. Усиление никелем реакции на пероксидазу для СМ
В 30 мл 0.05 М ацетатного буфера (рН 6) растворить 6-7 мг ДАБ и 0.45 г сульфата никеля-аммония. Перемешать и добавить 10 мкл 30%-ной перекиси водорода. Профильтровать. Использовать в течение 6-7 мин. Промыть. Высушить.

ЛИТЕРАТУРА

1.Аглинцт Т.С., Мартиросян Д.А. Метод плоско-параллельной заливки в эпоксидные смолы срезов тканей и пленчатых препаратов: Метод, рекомендации. Ереван, 1982.

4.Арутюнов В.Д. и др. Методические возможности сканирующей электронной микроскопии при изучении органа-ткани-клетки. М., 1979. Рукопись деп. в ВИНИТИ. 1.105.79. N 1079-79 Деп.
5.Атлас сканирующей электронной микроскопии клеток, тканей и органов Под ред. О.В.Волковой и др. М., 1987.
6.Балашов Ю.С., Леонович С.А. Методы применения растровой электронной микроскопии в зоологии. Л., 1984.
7.Банин В.В. и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983. Т.85, N8. С.67.

10.Бобрик И.И. и др. Методические рекомендации: сканирующая электронная микроскопия коррозионных анатомических препаратов. Киев, 1986.
11.Боголепов Н.Н. Методы электронно-микроскопического исследования мозга. М., 1976.
12.Бухвалов И.Б. и др. // XIV конф. по электронной микроскопии (биология, медицина): Тез. докл. М., 1992. С.6.
13.Вакулин Г.М. II XIII Всесоки. конф. по электронной микроскопии (биология и медицина): Тез. докл. М., 1988. С.21.
14.Втюрин Б.В., Пальцын А.А. Современные методы и приемы электронно-микроскопического исследования биологических объектов: электронно-микроскопическая радиоавтография и растровая электронная микроскопия. М., 1985.

19.Караганов ЯЛ. и др. // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1981. Т.81, N 8. С.5.

22.Караганов ЯЛ. и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983.Т.85, N 12. С.5.
23.Караганов ЯЛ. и dp*. 11 Арх. анатомии, гистологии иэмбриологии. 1986. Т.90, N 1. С.93.
24.Караганов ЯЛ. и др. // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1986.Т.90, N 3. С.83.
25.Карелина Н.Р. и др. Современные методы электронно-микроскопическогоисследования в морфологии. Л., 1986.

28.Киселева А.Ф и др. Морфофункциональные методы исследования в норме ипри патологии. Киев, 1983.
29.Козинец Г.И. и др. Метод сканирующей электронной микроскопии в гемато-логии: Метод, рекомендации. М., 1982.
30.Козинец Г.И., Симоварт Ю.А. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови. Таллин, 1984.
31. Колпаков В.А. и др. // Арх. патологии. 1992. Т.54, Н® L. С.68.
32.Кошссарчик Я.Ю., Миронов АА Электронная микроскопия клеток и тканей:замораживание-скалывание-травление. Л., 1990.
33.Кошссарчик ЯЮ., Снигиревская Е.С. II VIII Всесоюз. конф. по электронной микроскопии: Тез. докл. М., 1971. С.195.
34.Королев Её. IJ XIV конф. по электронной микроскопии (биология, медицина): Тез. докл. М.. 1992. С. 10.
35.Кортуков Е.В. и др. 11 X Всесоюз. конф. по электронной микроскопии:Тез. докл. М., 1976. С.16.
36.Костиленко ЮЛ., Ковалев КВ. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии.1978. Т.75, N 12. С.68.
37.Лившиц В.Л. Метод ориентирующего маркирования светооптических препаратов с целью идентификации клеток, избранных для сагиттальной ультратомии. М., 1985. Рукопись деп. в ВИНИТИ. 23.10.85. N 3486-85 Деп.

43.Миронов АА, Миронов В.А / / XII Всесоюз. конф. по электронной микроскопии: Тез. докл. М., 1982. С.271.
44.Миронов АА, Миронов В.А // XXXVII Всесоюз. науч.сессия, посвященная Дню Радио: Тез. докл. М., 1982. 4.2. С.123.
45.Миронов АА, Миронов В.А // Изобретательство и рационализация в медицине. М., 1983. С.11.
46.Миронов АА, Миронов В.А /1 Всесоюз. симпоз. "Криогенные методы в электронной микроскопии". Пущино, 1985. С.70.
47.Миронов АА, Миронов В.А / / (К Всесоюз. симпоз. "Структура и функции клеточного ядра": Тез. докл. Черноголовка, 1987. С.24.
48.Миронов АА и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1983.Т.85, N 11. С.85.
49.Миронов АА и др. 17 Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1989. Т.97, N 8. С.69.
50.Миронов В.А, Миронов АА // Цитология и генетика. 1985. Т.19, N 1.С.5.
51.Миронова В.А, Миронов Р.П. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии.1978. Т.75, N 11. С.98.
52.Панова Л.А Адсорбционная электронно-микроскопическая авторадиография в изучении структурно-функциональных свойств клеток энтеробакте-рий: Автореф. дис.... канд.биол. наук. Иваново, 1983.

55.Полянская Л.И. и др. II Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1990.Т.98, N 5. С. 14.
56.Пушкарь Н.С., Капрельянц АС. Введение в электронно-микроскопическую технику для медико-биологических исследований. Киев, 1982.
57.Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ / Под ред. Д. Гольдстейна. М., 1984. Кн. 1 и 2.

62.Рехтер М.Д., Миронов АА // Успехи соврем, биологии. 1990. Т.109, N 3.С.467.
63.Рикберг АБ. и др. Метод изучения индивидуальных клеток в световом микроскопе и РЭМ. Киев, 1983. (Препринт / Ин-т физики АН УССР; N 17).
64.Рикберг АБ. и др. Лазерная маркировка клеток для световой и электронной микроскопии. Киев, 1985 (Препринт / Ин-т физики АН УССР).
65.Ровенский Ю.А Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. М., 1979.

68.Саркисов Д.С. и др. Электронно-микроскопическая радиоавтография клетки. М., 1980.

76.Хатанова И.А Введение в просвечивающую электронную микроскопию твердых тел и биологических объектов. М., 1983.
77.Хомутовский OA. и др. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. Киев, 1986.

121.Crang RF.E, Klomparens KL Artifacts in biological electron microscopy. New York; London, 1988.

140.Elgsaeter A. et aL II Science of biological preparation / Eds SA.Bhatt et al.Chicago, 1984. P.195.

189.Hind J.V., Phillips J.I. I Proc. 23th Annu. Congr. Electron Microsc. Soc. S. Afr. 1984. Vol.14. P.109..
190.Hirabayashi Y., Wamada К // Ztschr. mikrosk.-anat. Forsch. Leipzig. 1989. Bd
103. S.90.

198.Hulstaert C.E. et al. / / Techniques in diagnostic pathology / Ed. G.R Bullock.London, 1989. P.133.

202.Ingram F.Dl, Ingram M.J. // Science of biological specimen preparation / EdsSA. Bhatt et al. Chicago, 1984. P. 167.

261.Morel G. 11 Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed. RHarris. Oxford, 1991. P.83.

279.Pavelka M., Ellinger A. / / Electron microscopy of subcellular dynamics / Ed. H. Plattner. Boca Raton (Flor.), 1989. P. 199.
280.Peters K-R II Advanced techniques in biological electron microscopy / Ed. J.K. Koehler. Berlin etc., 1986. Vol.3. P.101.

285.Plattner H., Knoll G. // Science of biological preparation / Eds SA. Bhatt et al. Chicago, 1984. P.139.

301.Robinson G., GrayT. // Theory and practice of histo'jgical techniques / Eds J.D.Bancroft et al. Edinburg etc., 1990. P.525.
302.Robinson G., GrayT. // Theory and practice of histological techniques / Eds J.D.Bancroft et al. Edinburg etc., 1990. P.563.
303.Roomans G.M. /I 12th Intern. Congr. X-ray optics and microanalysis. Krakow, 1990. Vol.1. P.37.
304. Roos N. N Electron microscopy in biology: A practical approach / Ed. R.Harris. Oxford, 1991. P.39.

328.Sitte Я. // Science of biological preparation / Eds SA. Bhatt et al. Chicago,1984. P.97.

372.WolberRA., Beats T.F. II Colloidal gold: Principles, methods and applications /Ed. MA. Hayat. New York, 1989. Vol.2. P.379.

Научное издание

Миронов Александр Александрович,

Комиссарчик Ян Юдович, Миронов Владимир Александрович

МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Утверждено к печати Институтом цитологии Российской академии наук

Редактор издательства Л.С.Евстигнеева

Художник Ю.П.Амбросов Технический редактор О.Б.Мацылевич. Корректор И.А.Крайнева, А.Х.Салтанаева, С.И.Семиглазова и Г.И.Тимошенко

ЛР N 020297 от 27.11.91. Сдано в набор 22.08.94. Подписано к печати 27.12.94. Формат 60 х 90 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать офсетная. Усл. печ. л. 25.0. Уч.-изд. л. 27.7. Тираж 390 экз. Тип. зак. N 3234. С 990.

Санкт-Петербургская издательская фирма РАН 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 1

Санкт-Петербургская типография N 1 РАН 199034, Санкт-Петербург, 9 линия, 12

Оставить комментарий © Copyright Миронов А.А.(Миронин Сигизмунд Сигизмундович), Комиссарчик Я.Ю. Миронов В.А. (mironaaa@yandex.ru) Размещен: 01/03/2017, изменен: 01/03/2017. 1088k. Статистика. Монография: Естествознание Иллюстрации/приложения: 46 шт.		Оценка: *7.444** Ваша оценка:
Аннотация: В монографии изложено большинство современных подходов к препарироќванию биологических объектов для исследования в трансмиссионных и сканируќющих микроскопах различные способы их криофиксации и прямого исследования в электронном микроскопе (замораживание-скалывание), низкотемпературная дегидратация (замораживание-замещение) и дегидратация в критической точке, низкотемпературные заливочные среды и условия их пропитки и полимеризации, существующие методы гистохимии и иммуноцитохимии с использованием разќличных электронно-плотных меток и др. В книге приведен также ряд рутинных методов, которые оправдали себя и до сих пор широко используются: различные способы химической фиксации, дегидќратации, заливки в эпоксидные смолы, микротомирование стеклянными и алмазќными ножами, контрастирование солями тяжелых металлов и др. Большое место отведено критическому анализу возникающих в процессе препарирования артефактов. Рассмотрены причины их возникновения и пути их профилактики. Значительное внимание уделено количественному анализу в элекќтронной микроскопии, в том числе рентгеновскому микроанализу. Специальные разделы посвящены методам изучения проницаемости и транспорта веществ в клетках, тканях и органах, а также сочетаемости различных методов электронной микроскопии. Обстоятельно рассмотрены вопросы интерпќретации и объемной реконструкции электронно-микроскопических изображений. В конце книги дан перечень рекомендуемых авторами протоколов основных методов препарирования объектов для электронно-микроскопического исследоќвания. Книга рассчитана на широкий круг научных сотрудников, аспирантов, стуќдентов и практических работников, занимающихся или интересующихся морфоќлогическими аспектами различных биологических дисциплин.

Миронов А.А.(Миронин Сигизмунд Сигизмундович), Комиссарчик Я.Ю. Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине

Миронов А.А.(Миронин Сигизмунд Сигизмундович), Комиссарчик Я.Ю. Миронов В.А.
Методы электронной микроскопии в биологии и медицине